ngs與其他檢測序技術(shù)流程的對比

世和基因內(nèi)部培訓(xùn)材料

——NGS與其他檢測序技術(shù)流程的比照

2021年7月Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.臨床常用診斷技術(shù)2Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.腫瘤診斷方法影像學(xué)診斷：超聲，CT，MRI，PET，PET-CT組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷：-HE染色-區(qū)分腫瘤細(xì)胞及分型免疫組化診斷：-利用抗原抗體結(jié)合反響原理-針對蛋白類腫瘤標(biāo)記物〔癌胚抗原，糖類抗原，甲胎蛋白等〕的檢測-鑒別組織來源分子診斷：-熒光原位雜交〔FISH〕、基因探針及標(biāo)記、多聚酶鏈?zhǔn)椒错憽睵CR〕、DNA序列分析〔sanger測序、ARMS法、二代測序〕等-針對腫瘤的癌基因/抑癌基因、生長因子及受體,以及腫瘤相關(guān)的某些染色體位點(diǎn)異常的檢測

3組織病理學(xué)檢查仍是癌癥診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)〞ACSCSCCLC4FISH

ARMS腫瘤點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本腫瘤病理診斷治療已進(jìn)入個體化分子時代

免疫組化

一代測序

數(shù)字PCR

二代測序檢測方法的介紹免疫組化〔IHC〕熒光原位雜交〔FISH〕桑格測序〔Sanger測序法〕擴(kuò)增阻滯突變〔ARMS〕-PCR法數(shù)字PCR〔ddPCR〕二代測序檢測方法介紹6Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.免疫組化染色原理：根據(jù)抗原抗體反響和化學(xué)顯色原理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與標(biāo)記生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反響，前者再用標(biāo)記辣根過氧化物酶〔HRP〕或堿性磷酸酶〔AKP〕等的抗生物素〔如鏈霉親和素等〕結(jié)合，最后通過呈色反響或熒光來顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反響產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量。免疫組化是從蛋白層面看問題的，與測序不同，一個是因〔DNA〕，一個是果〔Protein〕，所以體內(nèi)出現(xiàn)一些未知突變，如果對蛋白功能產(chǎn)生影響，也是可以看出來的。70分1分2分3分熒光原位雜交〔FISH〕定義：熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析其結(jié)果的一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。它的根本原理是：如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反響，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。分析9Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.熒光原位雜交(FISH)檢測——以HER2為例FISH檢測乳腺癌細(xì)胞HER2擴(kuò)增代表性圖例高倍擴(kuò)增無擴(kuò)增擴(kuò)增無擴(kuò)增DNA序列測定的意義

DNA的序列測定是分子生物學(xué)研究中的一項非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的別離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達(dá)與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對DNA一級結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解。桑格測序原理原理：利用DNA聚合酶，以待測單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測序反響體系，在每個反響體系中參加不同的雙脫氧核苷三磷酸〔ddNTP〕作為鏈延伸終止劑。在測序引物引導(dǎo)下，通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳別離，放射自顯影檢測后，合成鏈序列，由此推知待測模板鏈的序列。

13Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.Sanger測序的流程結(jié)果解讀擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(ARMS)-又稱等位基因特異性擴(kuò)增〔ASA〕，利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，設(shè)計等位基因特異性PCR擴(kuò)增引物。ARMS〔ASA〕的特點(diǎn)是：“只有在引物3’堿基與模板配對時才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增帶，野生型的不擴(kuò)增〞優(yōu)勢? 靈敏度高，重復(fù)性好，對標(biāo)本突變率要求底? 操作簡單，儀器費(fèi)用較低廉? 檢測時間短缺乏? 僅能檢測突變類型? 不能得到具體堿基突變類型ARMS法檢測16數(shù)字微滴PCR(ddPCR)通過將微量樣品擴(kuò)大倍數(shù)稀釋和分液(partitioning)，直至每個樣品中所含有的待測分子數(shù)不會超過1個，再將所有樣品在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對發(fā)生了擴(kuò)增反響的樣品逐個進(jìn)行計數(shù)的一種技術(shù)。Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.ddPCR的工作流程原理是在Sanger測序方法的根底上，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP。通過堿基互補(bǔ)配對原那么逐一的添加標(biāo)記過的dNTP，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號并經(jīng)過特定的計算機(jī)識別、轉(zhuǎn)換，從而生成相應(yīng)的序列信息。新一代高通量測序(NGS)的原理四色熒光判別ATCG四種堿基

激光超高分辨率照相機(jī)

Miseq為首個FDA批準(zhǔn)臨床的高通量測序儀

國際NGS高分文章，絕大多數(shù)使用Hiseq平臺18新一代高通量測序(NGS)能同時檢測不同形式的基因突變

MarcLadanyi.2021ASCOAnnualMeeting19檢測方法比較檢測方法優(yōu)勢劣勢可檢測的變異形式AMRS-PCR1、靈敏度3%-10%2、擴(kuò)增和檢測同時進(jìn)行，封閉的體系，減少污染的可能性1、只能檢測已知突變2、如果檢測突變點(diǎn)或者類型較多，出現(xiàn)特異產(chǎn)物概率也增加3、當(dāng)檢測位點(diǎn)較多時，對DNA樣本需求增加點(diǎn)突變、小片段插入/缺失無法測融合、大片段以及熱點(diǎn)測序熒光原位雜交FISH1、靈敏度高、特異度高2、空間定位準(zhǔn)確，可同時分析分裂期和間期多個細(xì)胞，并進(jìn)行定量1、通量低、成本高2、對操作和判讀技術(shù)要求高，不同讀片者判讀差異較大拷貝數(shù)變化、大片段插入/缺失、融合/重排。擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)免疫組化IHC1、可對組織和細(xì)胞中相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性、定位及定量研究2、經(jīng)濟(jì)快捷1、抗體的選擇2、檢測者組織的固定3、觀察者解釋方面的差異僅檢測蛋白表達(dá)水平Sanger測序1、測序長度2、準(zhǔn)確性高，靈敏度20%-30%3、能處理的處理重復(fù)序列和多聚序列1、通量低、成本高2、對樣本中腫瘤細(xì)胞的含量和比例要求較高3、靈敏度低點(diǎn)突變、小片段插入/缺失二代測序1、大規(guī)模、高通量2、能檢測各種變異形式3、靈敏度1%-3%1、成本較高2、引入PCR過程會在一定程度上增加測序的錯誤率，并且具有系統(tǒng)的偏向性，同時讀長也比較短3、對數(shù)據(jù)注釋和報告解讀要求高點(diǎn)突變擴(kuò)增融合/重排插入/缺失20Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.各種方法檢測的比照方法檢測層面樣本需求優(yōu)勢劣勢IHCProtein組織直接展現(xiàn)表達(dá)結(jié)果，直觀主觀判斷，對操作人員要求較高，陽性判定不確定ARMSDNA組織，血液速度快，精準(zhǔn)度較高無法測融合，擴(kuò)增及大片段測序，熱點(diǎn)測序ddPCRDNA組織，血液單位點(diǎn)精準(zhǔn)度非常高，可以進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測多位點(diǎn)血檢匹配度不高，熱點(diǎn)測序FISHDNA組織擴(kuò)增是金標(biāo)準(zhǔn)，并且可以測融合主觀判斷，對操作人員要求較高，對融合的判別要求非常高，結(jié)果容易出錯世和DNA/RNA普適性一次檢測所有突變類型，多基因，精準(zhǔn)度高價格略高，周期略長21Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.總結(jié)

SummaryNGS只需要微量樣本就可以一次性檢測所有的突變類型FISH做擴(kuò)增與融合對實(shí)驗(yàn)室研判人員的要求較高，NGS通過優(yōu)化算法，降低人工出錯的比率。陰性對照極為重要，具有質(zhì)控和探查種系突變的作用ARMS,ddPCR等傳統(tǒng)一代測序方法在熱點(diǎn)測序這一塊確實(shí)精準(zhǔn)度較高，但是本質(zhì)上仍舊是熱點(diǎn)測序，不能滿足越來越大的檢測需求世和專有探針庫保證了前期提取的DNA質(zhì)量22Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.NGS&ctDNA技術(shù)優(yōu)勢Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.NGS技術(shù)特點(diǎn)及優(yōu)勢檢測全面精準(zhǔn)度高周期短樣本需求少全自動化的大數(shù)據(jù)分析方法時時更新的醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫高通量單次檢測中同時發(fā)現(xiàn)多個基因的多種突變包括單堿基突變、堿基缺失、堿基插入和基因融合單次反響只能針對一種突變進(jìn)行檢測，并只能檢測一種突變類型同時對416個致癌基因進(jìn)行測序展現(xiàn)所有突變每次反響只檢測單個基因一種突變世和的技術(shù)在單次檢測中對每個堿基覆蓋600次以上，杜絕假陽/陰性結(jié)果技術(shù)局限，假陽/陰性錯誤率高只需一次微量

腫瘤樣本，并且可以檢測手術(shù)樣本，血液/積液樣本，F(xiàn)FPE石蠟樣本等屢次檢測導(dǎo)致樣本量大、價格高、耗時長實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)分析的算法優(yōu)化和分析自動化，快速處理海量病人數(shù)據(jù)，杜絕人為錯誤技術(shù)局限無法及時有效處理海量病人數(shù)據(jù)以FDA逾三萬份臨床數(shù)據(jù)為根底，報告切實(shí)有用，有效幫助醫(yī)生和病人選擇高敏感性的藥物不同實(shí)驗(yàn)室的各種報告而造成的信息重復(fù)或混亂，無法保證臨床數(shù)據(jù)庫的完善性和時效性檢測流程高度自動化，7天提供全面準(zhǔn)確報告屢次反復(fù)測試，造成耗時長，而且由于技術(shù)局限無法提供全面的報告上一代傳統(tǒng)基因檢測高通量測序Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.NGS與液體活檢結(jié)合可有效解決傳統(tǒng)檢測面臨的挑戰(zhàn)Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.ctDNA液體活檢?特點(diǎn)和優(yōu)勢26克服腫瘤異質(zhì)性與組織高度匹配取樣無創(chuàng)簡便動態(tài)監(jiān)測藥物療效動態(tài)監(jiān)測耐藥情況有效評估預(yù)后NatRevClinOncol.2021Aug;10(8):472-84.沒有組織怎么辦？？？Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.初始診斷性活檢是通過組織病理學(xué)、免疫組化和分子學(xué)特征描繪進(jìn)行評估的，根據(jù)結(jié)果制訂治療方案在獲得性耐藥時進(jìn)行再活檢，并采用同樣的方法重新分析以發(fā)現(xiàn)耐藥時收集的標(biāo)本與治療前標(biāo)本的差異該過程在各治療階段時重復(fù)進(jìn)行應(yīng)形成可能的細(xì)胞株和患者衍生的移植瘤模型以促進(jìn)耐藥機(jī)制和治療作用的功能性研究PolitiK,etal.ClinCancerRes.2021May15;21(10):2213-20.分子學(xué)特征和再活檢與癌癥治療的整合27檢測全面?克服腫瘤異質(zhì)性腫瘤具有復(fù)雜的時空異質(zhì)性不同位置具有不同病灶腫瘤亞克隆AndriyMarusyk,etal.NatureReviewCancer.2021.AlmendroV,etal.Annualreviewofpathology2021.由于組織檢測只取樣于腫瘤的某一部位，無法衡量腫瘤組織的異質(zhì)性，導(dǎo)致檢測信息不全面。ctDNA：由于ctDNA來源于患者體內(nèi)不同位置的腫瘤細(xì)胞，同時經(jīng)過人體天然血液循環(huán)系統(tǒng)混勻，其攜帶的腫瘤基因信息更全面，躲避了腫瘤組織的異質(zhì)性。靈敏度高?準(zhǔn)確度高?假陽性率低Zhengetal.SciRep

6:

20913(2021).Thierryetal.NatMed.2021;20(4):319-449.為什么要進(jìn)行ctDNA基因檢測現(xiàn)有的基于血清蛋白生物標(biāo)記物〔例如CA-125和PSA〕的無創(chuàng)檢測方法存在一定數(shù)量的假陽性與假陰性結(jié)果，并不能對腫瘤的進(jìn)展做出準(zhǔn)確判斷ctDNA可從血液中較易別離〔liquidbiopsy〕，并攜帶腫瘤特異性的體細(xì)胞突變，因此極為適合作為腫瘤無創(chuàng)診斷及監(jiān)測的生物標(biāo)記物對ctDNA進(jìn)行基因檢測還可以及時發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)后產(chǎn)生的抗藥性突變，而及時對治療方案進(jìn)行調(diào)整盡管腫瘤本身是腫瘤DNA的最直接來源，但是通過活檢或手術(shù)獲取腫瘤組織是侵入性的，具有一定風(fēng)險的。而且有些癌癥病人不宜進(jìn)行手術(shù)，無法獲得腫瘤組織進(jìn)行基因檢測，以幫助制定治療方案30ctDNA檢測中遇到的問題及挑戰(zhàn)

ctDNA總量取決于：樣品提供人的健康狀態(tài)取血及保存運(yùn)輸血液/血漿樣品的條件血漿的制備方法DNA的提取方法以及DNA的定量方法世和基因的技術(shù)優(yōu)勢：大幅提高ctDNA回收率從微量ctDNA建立測序文庫ctDNA在血液中含量極少，片段較小，提取方法及其重要1建庫及富集的產(chǎn)量2事實(shí)上，ctDNA檢測的核心在于前期準(zhǔn)備以確保ctDNA文庫的多樣性，保證被檢測樣本有代表性是下游測序及分析的基石31Copyright?2021.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.那么多公司，為什么選擇我們？

世和的優(yōu)勢32世和的優(yōu)勢來自于——步步優(yōu)化，精益求精33世和的優(yōu)勢來自于——步步優(yōu)化，精益求精優(yōu)勢在于每步優(yōu)化！QC步驟34樣本收集－兩小時之內(nèi)別離血漿收到血樣后2小時內(nèi)別離血漿血漿多種運(yùn)輸條件實(shí)驗(yàn)室模擬不能輸在起跑線上！運(yùn)輸全血至總部再別離血漿季節(jié)地域溫差大，影響質(zhì)量直接影響檢出率世和基因其他公司SciTranslMed.Aug26,2021;7(302):302ra1332小時內(nèi)收集血漿是臨床試驗(yàn)、高分論文金標(biāo)準(zhǔn)！分離全血收集血漿，時間精至分鐘！35DNA提取I－血漿ctDNA－富集小片段ctDNA，去除干擾小片段含腫瘤特異突變大片段不含腫瘤特異突變血漿DNA經(jīng)過大小片段別離有效富集小片段ctDNA！更豐富的起始原料世和基因數(shù)據(jù)36DNA提取II－石蠟組織－自主研發(fā)基于qPCR的樣本質(zhì)控0.5率先使用熒光定量PCR法用于FFPE樣本質(zhì)控自主設(shè)計引物，經(jīng)過>8個參數(shù)計算模型，確保通過QC樣本測序質(zhì)量防止交聯(lián)過于嚴(yán)重的石蠟樣本進(jìn)入流程測序質(zhì)量好測序質(zhì)量差世和基因數(shù)據(jù)，基于100例臨床病人石蠟樣本測序結(jié)果37樣本建庫－不計本錢的大量進(jìn)口試劑優(yōu)化上百種進(jìn)口試劑反復(fù)搭配優(yōu)化極大提升建庫效率38靶向富集I－基因捕獲探針Mass

spec質(zhì)控單獨(dú)合成基因靶向富集－15000余個探針探針庫反復(fù)優(yōu)化14次，歷時3年，保證每個基因每個外顯子覆蓋探針單個合成，Mass

Spec保證質(zhì)量7項核心專利探針單獨(dú)合成質(zhì)譜分析純化世和探針庫剪切探針庫芯片大規(guī)模合成芯片合成探針的缺點(diǎn)：大規(guī)模一次合成多個探針統(tǒng)一剪切探針的完整性等品質(zhì)無任何保證大局部探針都不完整，導(dǎo)致基因捕獲效率大大降低芯片合成探針的缺點(diǎn)反復(fù)15000次39靶向富集II－為什么一定要“好〞探針？什么是探針的均一性〔Uniformity〕？探針覆蓋不均一探針覆蓋均一ALK19內(nèi)含子測序數(shù)據(jù)的重要參數(shù)，除了測序深度，還有探針均一程度換句話說，如果EGFR覆蓋3000X，而ALK只覆蓋300X，將會嚴(yán)重影響檢測敏感性檢測靈敏度是由覆蓋最低的基因決定的如不均一，等于沒測！40世和基因IlluminaHiseq4000/Miseq其他測序公司IlluminaNextseq500四色熒光判別ATCG四種堿基

激光超高分辨率照相機(jī)Miseq為首個FDA批準(zhǔn)臨床的高通量測序儀國際NGS高分文章，絕大多數(shù)使用Hiseq平臺二色熒光判別ATCG

LED照相機(jī)

準(zhǔn)確率和靈敏度較差主要用于產(chǎn)前檢測上樣測序－Illumina

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