-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶-cgase突變體的制備

-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶-cgase突變體的制備

葡萄糖原旋轉(zhuǎn)酶（csi2.4.1.19）是京粉酶家族的重要成員。它的獨特功能是將淀粉轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精。環(huán)糊精是由6個以上葡萄糖連結(jié)而成的具有環(huán)狀疏水圓錐形結(jié)構(gòu)的低聚糖非還原性化合物系列,其中最常用的是α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精,它們分別由6、7、8個葡萄糖單元構(gòu)成。環(huán)糊精分子的內(nèi)表面呈疏水性,外表面呈親水性,這種獨特的分子結(jié)構(gòu)使它可以通過范德華力、疏水作用力等與一些疏水性客體分子或基團形成包合物,從而改變客體分子的物理和化學(xué)性質(zhì)如溶解度、穩(wěn)定性等,因此其在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、紡織、環(huán)保、化妝品、生物技術(shù)和分析化學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。3種常用的環(huán)糊精中,由于β-環(huán)糊精溶解度最小,可以很方便地通過分步結(jié)晶的方法制得,因此,目前工業(yè)生產(chǎn)中大量制備和廣泛應(yīng)用的是β-環(huán)糊精,但是β-環(huán)糊精無法取代α-環(huán)糊精的用途,相比于β-環(huán)糊精,α-環(huán)糊精具有更小的空腔,更適于包合具有低分子質(zhì)量的分子,并且是一種非常好的膳食纖維,在食品等領(lǐng)域已顯示出無可比擬的優(yōu)勢。雖然市場上對α-環(huán)糊精有較大的需求,但由于CGTase的產(chǎn)物特異性差,而且α-環(huán)糊精的水溶性相對較高,不容易分離純化,因此造成生產(chǎn)成本高,α-環(huán)糊精價格昂貴。國外雖然已有相關(guān)研究報道,但是產(chǎn)量非常有限,國內(nèi)尚未見α-環(huán)糊精生產(chǎn)工藝的報道,因此研究α-環(huán)糊精的酶轉(zhuǎn)化與制備工藝顯得至關(guān)重要。生產(chǎn)α-環(huán)糊精的方法主要有化學(xué)法和生物法,化學(xué)法是將馬賽蘭氏淀粉與四氯乙烷反應(yīng),生成α-環(huán)糊精粗品,再經(jīng)過濾和水蒸氣蒸餾后得到純度相對較高的α-環(huán)糊精。由于α-環(huán)糊精溶解度較大,所以化學(xué)法制備比較困難,而且會對環(huán)境造成較大污染。生物法目前被認為是極具應(yīng)用潛力的方法。然而關(guān)于生物法生產(chǎn)α-環(huán)糊精的報道則很少。陳龍然等從土壤中分離出一株地衣芽孢桿菌,該菌發(fā)酵得到的CGTase作用于淀粉后,產(chǎn)物以α-環(huán)糊精為主,β-環(huán)糊精次之,二者比例為2.47:1,環(huán)糊精總產(chǎn)率為29.8%。王俊英等從其實驗室保存的一株Bacillussp.60221細菌中純化了一種α-CGTase,利用該酶轉(zhuǎn)化淀粉24h,總轉(zhuǎn)化率可達41%,其中α-環(huán)糊精占總轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的78%。目前,所有已知的野生型CGTase生產(chǎn)的均是α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精的混合物,這給產(chǎn)物的分離純化帶來很大不便,因此如何提高環(huán)糊精生產(chǎn)的特異性成為了近幾年研究的熱點。研究表明,通過一些定點突變的設(shè)計,對CGTase活性中心底物結(jié)合凹槽附近的一個或多個重要的氨基酸殘基進行取代、插入或者刪除等會改變CGTase產(chǎn)物中α、β、γ構(gòu)型的比例,從而改善環(huán)糊精的產(chǎn)品特異性,并減弱產(chǎn)物抑制。根據(jù)文獻報道,CGTase的一級結(jié)構(gòu)是決定產(chǎn)物特異性的主要內(nèi)在因素,CGTase活性中心凹槽至少包括9個糖結(jié)合位點,在環(huán)化過程中,葡萄糖殘基在亞位點-3上的結(jié)合模式發(fā)生改變,最近的一些定點突變結(jié)果證實了與定位在亞位點-3上的葡萄糖殘基有相互作用的氨基酸殘基對CGTase的產(chǎn)物特異性具有重要的作用。氨基酸殘基89(按照PeanibacillusmaceransCGTase編號)是亞位點-3的組成部分,因此在前期研究中,本實驗室選擇PeanibacillusmaceransJFB05-01CGTase中的Tyr89作為定點突變的目標(biāo),將PeanibacillusmaceransJFB05-01CGTase中位于亞位點-3處89位的酪氨酸(Y)突變成天冬氨酸(D),發(fā)現(xiàn)該突變體可以顯著提高α-環(huán)糊精特異性。本實驗對α-CGTase突變體Y89D制備α-環(huán)糊精的影響因素進行初步研究,從而為α-環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。1材料和方法1.1馬鈴薯淀粉t-y29d/pet-20b/n.colib21de3大腸桿菌cgt/pET-20b(+)/E.coliBL21(DE3)由本實驗室構(gòu)建并保存;大腸桿菌cgt-Y89D/pET-20b(+)/E.coliBL21(DE3)由本實驗室構(gòu)建并保存。α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精Sigma-Aldrich(上海)公司;玉米淀粉諸城興貿(mào)玉米開發(fā)有限公司;馬鈴薯淀粉寧夏固原六盤山淀粉公司;木薯淀粉廣西武鳴淀粉廠;乙腈(色譜純)美國Honeywell公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2高速離心cf1307200型分光光度計尤尼柯上海儀器有限公司;PYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進醫(yī)療器械廠;冷凍立式離心機CF16RX日本Hitachi公司;高速離心機德國Eppendorf公司;W201D電熱恒溫水浴搖床江蘇金壇國華儀器廠;Waters600HPLC色譜儀、Waters自動進樣器、Waters2410示差檢測器美國Waters公司;色譜柱LichrosorbNH2(4.6mm×150mm)德國Merch公司。1.3方法1.3.1培養(yǎng)基的制備種子培養(yǎng):將保藏的菌種接入裝有50mLLB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,回旋式搖床轉(zhuǎn)速200r/min,培養(yǎng)溫度為37℃,培養(yǎng)8h。發(fā)酵培養(yǎng):將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按體積分數(shù)4%的接種量,接種至裝有100mLTB培養(yǎng)基的500mL三角瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速200r/min,培養(yǎng)溫度為25℃,培養(yǎng)4d。各培養(yǎng)基使用前添加100μg/mL氨芐青霉素。將發(fā)酵液于4℃、10000r/min離心20min除菌體,收集上清液,上清液即為粗酶液。1.3.2甲基橙的制備甲基橙法測定酶環(huán)化活力。將適當(dāng)稀釋的粗酶液加入裝有預(yù)先用50mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)配制1g/100mL可溶性淀粉溶液的試管中,在40℃反應(yīng)10min后,加入1.0mL1.0mol/L的鹽酸停止反應(yīng),再加入1.0mL用50mmol/L磷酸緩沖液配制的0.1mmol/L甲基橙,在20℃保溫20min,在波長505nm處測定吸光度。酶活單位(U)定義為在上述條件下每分鐘生成1μmol的α-環(huán)糊精所需的酶量。1.3.3產(chǎn)物的提取和測定采用HPLC法進行酶產(chǎn)物分析。用磷酸鹽緩沖溶液配制5g/100mL淀粉溶液,沸水浴中加熱糊化10min,冷卻至反應(yīng)溫度后添加一定量的α-CGTase和有機溶劑,充分混勻后在40℃、200r/min水浴搖床中反應(yīng)24h,相隔一定時間取樣500μL,加熱滅酶后于12000r/min離心25min,上清液經(jīng)0.45μm超濾膜過濾后取10μL上機分析。采用HPLC進行產(chǎn)物分析的色譜條件為:Waters600HPLC色譜儀、Waters自動進樣器、色譜柱LichrosorbNH2(4.6mm×150mm);Waters2410示差檢測器;流動相為65%乙腈水溶液,流速1mL/min;柱溫30℃。1.3.4c-gatase突變體y89d對淀粉生產(chǎn)-環(huán)糊精的影響1.3.4.1.喂食型-caseu-y89d天竺葵素生產(chǎn)的環(huán)糊精參照1.3.3節(jié)方法分別以可溶性淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉作為原料制備α-環(huán)糊精,HPLC檢測分析環(huán)糊精產(chǎn)量。1.3.4.環(huán)糊精的hplc檢測配制pH6.0的5g/100mL馬鈴薯淀粉溶液,每克淀粉分別加入2.5、5、10、20、30、40U的CGTase粗酶液,參照1.3.3節(jié)制備α-環(huán)糊精,HPLC檢測分析環(huán)糊精產(chǎn)量。1.3.4.馬鈴薯淀粉量的影響參照1.3.3節(jié)方法配制pH6.0的5g/100mL馬鈴薯淀粉溶液,加酶量控制在每克淀粉5U左右,反應(yīng)6h,分別在不同的溫度條件下制備α-環(huán)糊精,HPLC檢測分析環(huán)糊精產(chǎn)量。1.3.4.馬鈴薯淀粉量的檢測參照1.3.3節(jié)方法用不同pH值緩沖溶液配制5g/100mL馬鈴薯淀粉溶液,控制加酶量為每克淀粉5U,于30℃進行轉(zhuǎn)化反應(yīng),HPLC檢測分析環(huán)糊精產(chǎn)量。1.3.4.環(huán)糊精的合成配制pH5.0的5g/100mL馬鈴薯淀粉溶液,加酶量控制在每克淀粉5U,反應(yīng)體系中分別加入2%的乙醇、異丙醇、正丁醇、正癸醇,反應(yīng)溫度30℃,參照1.3.3節(jié)方法制備α-環(huán)糊精,HPLC檢測分析環(huán)糊精產(chǎn)量。1.3.4.環(huán)糊精的合成配制pH5.0的5g/100mL馬鈴薯淀粉溶液,反應(yīng)體系中分別加入體積分數(shù)1%、2%、5%、7.5%、10%的正癸醇,加酶量控制在每克淀粉5U,反應(yīng)溫度30℃,反應(yīng)6h,反應(yīng)結(jié)束后水蒸氣蒸餾除去正癸醇,參照1.3.3節(jié)方法制備α-環(huán)糊精,HPLC檢測分析環(huán)糊精產(chǎn)量。2結(jié)果與分析2.1-環(huán)糊精的質(zhì)量濃度從圖1可見,對于野生CGTase,在反應(yīng)起始階段,α-環(huán)糊精是主要產(chǎn)物,而只生產(chǎn)少量的β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精;反應(yīng)8h,β-環(huán)糊精的質(zhì)量濃度已經(jīng)開始超過α-環(huán)糊精的質(zhì)量濃度,隨著反應(yīng)時間的延長,α-環(huán)糊精占總環(huán)糊精產(chǎn)物的比例降低,β-環(huán)糊精比例增加,反應(yīng)24h時,β-環(huán)糊精的產(chǎn)量明顯大于α-環(huán)糊精的產(chǎn)量,產(chǎn)物中α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精質(zhì)量比為44.4:53:2.6。與野生酶相比,α-CGT酶突變體Y89D能提高α-環(huán)糊精的生產(chǎn)能力,降低β-環(huán)糊精的生產(chǎn)能力,在反應(yīng)的起始階段,α-環(huán)糊精仍然是主要產(chǎn)物,而β-環(huán)糊精的生成速率與野生酶相比明顯降低,反應(yīng)4h,α-環(huán)糊精的質(zhì)量濃度達到最高,隨后α-環(huán)糊精的質(zhì)量濃度逐漸降低,β-環(huán)糊精的比例逐漸增加,但是增加幅度非常緩慢,反應(yīng)6h,α-環(huán)糊精的質(zhì)量濃度大約是野生CGTase的1.2倍,而β-環(huán)糊精的質(zhì)量濃度下降到野生CGTase的89%,反應(yīng)24h后,產(chǎn)物中幾乎有等量的α-環(huán)糊精和β-環(huán)糊精,α-環(huán)糊精和β-環(huán)糊精比例為52:48,而沒有檢測到γ-環(huán)糊精。這說明突變體Y89D比野生酶更適合α-環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)。由于本實驗中,反應(yīng)4~6h,體系中α-環(huán)糊精的質(zhì)量濃度最高,因此生產(chǎn)時控制反應(yīng)時間在4~6h,不僅可以獲得較高的α-環(huán)糊精產(chǎn)量還可以減少反應(yīng)時間而降低生產(chǎn)成本。2.2不同淀粉的比例對環(huán)糊精生產(chǎn)的影響從表1可見,CGTase作用于淀粉后所產(chǎn)生的α-環(huán)糊精和β-環(huán)糊精量及總的環(huán)糊精產(chǎn)率在不同淀粉類型之間有所不同。4種淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精的總轉(zhuǎn)化率中馬鈴薯淀粉最高為35.07%,木薯淀粉、可溶性淀粉和玉米淀粉分別為32.53%,32.14%和25.81%;4種淀粉中,可溶性淀粉生成的α-環(huán)糊精的比例最高,其次為馬鈴薯淀粉。由于環(huán)糊精生產(chǎn)中通常采用淀粉作為原料,淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成,不同類型的淀粉具有不同的直鏈與支鏈比例,這些結(jié)構(gòu)上的差異,對環(huán)糊精的生產(chǎn)有很大的影響,有研究表明支鏈淀粉含量高的淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精的產(chǎn)率較高,這可能是因為支鏈淀粉只能被淀粉酶部分水解為麥芽糖,而直鏈淀粉可以被淀粉酶完全水解為麥芽糖,而CGTase本身屬于淀粉酶家族的一員,它可以水解淀粉,麥芽糖是小分子糖,它的存在有利于CGTase將環(huán)糊精的環(huán)打開,從而對環(huán)糊精的生成有抑制作用,所以支鏈淀粉含量很高的馬鈴薯淀粉就有利于環(huán)糊精的生產(chǎn),這與本實驗的結(jié)果一致。考慮到工業(yè)化生產(chǎn)以及后期提取的成本因素,由于可溶性淀粉的價格較昂貴,因此綜上分析,選用馬鈴薯淀粉生產(chǎn)α-環(huán)糊精不僅可以降低成本還可以獲得高淀粉轉(zhuǎn)化率。2.3內(nèi)鏡反應(yīng)機理從圖2可以看出,α-環(huán)糊精的產(chǎn)量隨著加酶量的增加先上升后下降,當(dāng)加酶量達到5~10U/g時,α-環(huán)糊精的產(chǎn)量最高,隨著加酶量的繼續(xù)增加,α-環(huán)糊精的產(chǎn)量一直下降,而β-環(huán)糊精的產(chǎn)量隨著加酶量的增加一直上升,加酶量越大,越有利于β-環(huán)糊精的生成(數(shù)據(jù)未列出)。CGTase是一種多功能型酶,它能催化4種不同的反應(yīng):環(huán)化反應(yīng)、偶合反應(yīng)、歧化反應(yīng)和水解反應(yīng),這4種反應(yīng)的機理基本相同,僅僅是受體分子不同。1)環(huán)化反應(yīng):它是CGTase的特征反應(yīng),α-(1→4)葡聚糖分子通過分子內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成環(huán)糊精,反應(yīng)一般從α-(1→4)葡聚糖的非還原性末端開始;2)偶合反應(yīng):偶合反應(yīng)是環(huán)化反應(yīng)的逆反應(yīng),它可以將環(huán)糊精的環(huán)打開,然后轉(zhuǎn)移到葡萄糖和麥芽糖等受體上,其中二糖被認為是最為有效的受體糖,這個反應(yīng)一般發(fā)生在轉(zhuǎn)化后期,這可以解釋在淀粉轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精的過程中,隨著反應(yīng)時間延長產(chǎn)物由α-環(huán)糊精向β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象,在反應(yīng)體系中存在高濃度麥芽低聚糖或葡萄糖的情況下容易發(fā)生偶合反應(yīng);3)歧化反應(yīng):直鏈寡糖分子間進行糖基轉(zhuǎn)移的作用,生成重合度不同的各種糖分子,如果底物是淀粉,主要發(fā)生在CGTase催化反應(yīng)的初始階段,表現(xiàn)為糊化液黏度快速下降;4)水解作用:即CGTase可以在一定程度上催化環(huán)糊精的分解。本實驗中隨著加酶量的增加,相應(yīng)CGTase的歧化、偶合反應(yīng)能力也隨著增強,反應(yīng)體系中的小分子糖濃度增加,高濃度小分子糖的存在更有利于發(fā)生偶合反應(yīng),從而將生成的α-環(huán)糊精的環(huán)打開,然后轉(zhuǎn)移到小分子糖受體上生成β-環(huán)糊精。因此在生產(chǎn)中要控制好CGTase的添加量,尤其是生產(chǎn)α-環(huán)糊精時,使加酶量保持在5~10U/g的范圍內(nèi),不僅可以提高α-環(huán)糊精的產(chǎn)量還可以降低生產(chǎn)成本。2.4溫度對-環(huán)糊精生成的影響從表2可以看出,溫度對α-糊精產(chǎn)率影響作用比較顯著,30℃時,淀粉總轉(zhuǎn)化率最高可達到39%,其中α構(gòu)型與β構(gòu)型質(zhì)量比為65:35,隨著溫度的繼續(xù)升高,淀粉總轉(zhuǎn)化率逐漸降低,且α-環(huán)糊精在環(huán)糊精中的比例也逐漸下降,說明溫度越低越有利于α-環(huán)糊精的生成。酶是一種蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列與生物功能密切相關(guān),一級結(jié)構(gòu)的變化往往導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物功能的變化。α-CGTase突變體Y89D相比于野生酶,其一級結(jié)構(gòu)的改變可能會使該酶的熱穩(wěn)定性有所降低,因此低溫條件更有利于該酶合成α-環(huán)糊精;同時在高溫條件下,CGTase的天然構(gòu)象可能被破壞,酶分子變性失活,所以造成淀粉轉(zhuǎn)化率降低。因此本實驗選用30℃作為生產(chǎn)α-環(huán)糊精的反應(yīng)溫度。2.5ph值對酶催化反應(yīng)的影響從圖3可以看出,α-CGTase突變體Y89D轉(zhuǎn)化淀粉生成α-環(huán)糊精的最適pH值為5.0。pH5.0時,反應(yīng)6h,Y89D突變體轉(zhuǎn)化淀粉生成的α-環(huán)糊精產(chǎn)量最高達到13.5g/L,明顯高于其他pH值條件下α-環(huán)糊精的產(chǎn)量。隨著pH值的繼續(xù)升高,在pH6.0~8.0范圍內(nèi),α-環(huán)糊精的產(chǎn)量及合成速率相比于pH5.0時都有所下降。當(dāng)pH值降低到4.0時,α-環(huán)糊精的產(chǎn)量最低。pH值之所以對酶催化有很大影響,從酶反應(yīng)動力學(xué)的角度看,很可能是因為它改變了酶活性部位有關(guān)基團的解離狀態(tài)。在最適pH值時,酶分子上活性基團的解離狀態(tài)最適于酶與底物的結(jié)合;而高于或低于最適pH值時,酶活性部位基團解離狀態(tài)不利于酶與底物的結(jié)合,酶活力也相應(yīng)降低,因此淀粉轉(zhuǎn)化率也很低。另外,pH值除了對酶活性有很大影響外,對酶的穩(wěn)定性也有很大影響。過高過低的pH值會改變酶的活性中心的構(gòu)象,甚至改變整個酶分子的結(jié)構(gòu)使其變性失活。因此本實驗選用pH5.0作為α-環(huán)糊精生產(chǎn)的條件。2.6-環(huán)糊精的生產(chǎn)有文獻報道,向反應(yīng)體系中添加有機溶劑可以提高環(huán)糊精的生成量,本實驗考察了乙醇、異丙醇、正丁醇、正癸醇對α-環(huán)糊精生產(chǎn)的影響,結(jié)果如圖4所示。由圖4可見,所有有機溶劑都能提高α-環(huán)糊精的產(chǎn)量,乙醇和異丙醇對α-環(huán)糊精產(chǎn)量的提高不是很明顯,而添加正丁醇和正癸醇能顯著提高α-環(huán)糊精的產(chǎn)量,但是從反應(yīng)時間看,正癸醇比正丁醇更有利于α-環(huán)糊精的生產(chǎn)。添加正癸醇反應(yīng)6h,α-環(huán)糊精的產(chǎn)量即可達到26.5g/L,是未添加有機溶劑時的2倍,此時淀粉的轉(zhuǎn)化率最高達到了60%,是對照組的1.4倍,其中α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精質(zhì)量比為83:17:0;而添加正丁醇反應(yīng)8h,α-環(huán)糊精的產(chǎn)量才可達到25.7g/L,此時淀粉的轉(zhuǎn)化率最高只有59%,其中α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精質(zhì)量比為79:20:1,因此正癸醇更有利于α-環(huán)糊精的生產(chǎn)。不溶性的有機溶劑如正癸醇能提高環(huán)糊精的產(chǎn)量一方面是因為有機溶劑能與生成的環(huán)糊精形成不溶性絡(luò)合物,經(jīng)過沉淀,連續(xù)從反應(yīng)系統(tǒng)中去除環(huán)糊精,改變反應(yīng)的平衡,使其向著環(huán)糊精的生成方向不斷進行,有利于環(huán)糊精生產(chǎn);另一方面,環(huán)糊精與有機溶劑形成包絡(luò)物的同時,也解除了環(huán)糊精本