超聲波振蕩法制備殼聚糖縮檸檬醛席夫堿

超聲波振蕩法制備殼聚糖縮檸檬醛席夫堿

殼聚糖是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一天然堿性糖，具有良好的生物降解性、適應性、成膜特性和較強的抗菌、耐候性等特點，但只能溶解在酸性介質(zhì)中，且不能限制其應用范圍。席夫堿具有抑菌、殺菌、抗病毒、抗腫瘤等特殊的生物活性,近年來越來越引起人們的重視。席夫堿反應一直被應用于殼聚糖的化學改性研究中。檸檬醛具有殺驅(qū)昆蟲、防腐和抑殺真菌、霉菌作用,對多種真菌的抗菌效力與公認較好的合成食用防腐劑山梨酸鉀相近,明顯優(yōu)于苯甲酸鈉,而且檸檬醛的抗菌活性pH值范圍較寬廣,不僅對酸性食品有效,對中性食品也有效。檸檬醛具有濃郁的檸檬果香味,不僅是很好的食品增香劑,而且還可以作為食品的良好防腐保鮮劑。殼聚糖與檸檬醛進行席夫堿化反應制備出殼聚糖席夫堿衍生物,并對其進行抗菌作用的研究還未見報道。本文作者將殼聚糖與抗菌活性范圍較廣的檸檬醛進行縮合反應,得到具有良好抗菌活性的殼聚糖席夫堿衍生物,并對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉進行了抗菌活性研究,繪制了抑菌生長曲線。1實驗部分1.1縮合率的計算殼聚糖,脫乙酰度97%,相對分子質(zhì)量1.0×105,青島海匯生物工程有限公司;檸檬醛,上海埃彼化學試劑廠,分析純;其它試劑均為分析純?？s合率(P)按式(1)計算。式中,m1為殼聚糖的質(zhì)量,g;m2為縮合產(chǎn)物的質(zhì)量,g;M1為殼聚糖結(jié)構(gòu)單元的摩爾質(zhì)量(采用的殼聚糖脫乙酰度為97%,可按近似處理不考慮3%的乙?；鶊F),161g/mol;M2為縮合產(chǎn)物結(jié)構(gòu)單元的摩爾質(zhì)量,g/mol。1.3殼體聚糖和席夫堿的抗菌實驗1.3.1材料、儀器和抑菌效率對于細菌采用平板菌落計數(shù)法測定殼聚糖和席夫堿的抑菌效率。配制不同質(zhì)量分數(shù)的殼聚糖溶液和席夫堿溶液(0.5%的乙酸溶液為溶劑)。分別將0.1mL菌懸液和0.1mL不同濃度的樣品溶液均勻涂布在培養(yǎng)基平板上,空白為只加菌懸液而不加樣品溶液。所有平板在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,取出觀察各個平板上的細菌生長情況,計算抑菌效率。Avatar360FTIR型紅外光譜儀,KBr壓片法,美國Nicolet公司;UV-2550型紫外分光光度計,日本島津公司;PE-2400Ⅱ型元素分析儀,美國PE公司;D8Advance型X射線衍射儀,德國Bruker公司。細菌包括革氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)和革氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),真菌有黑曲霉(Aspergillusniger),均由中國海洋大學微生物實驗室提供。細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng),真菌采用沙氏培養(yǎng)基培養(yǎng)。將殼聚糖分散于50mL甲醇中溶脹1h,轉(zhuǎn)移至250mL三口燒瓶中,并置于超聲波清洗器中,開啟超聲波至合成溫度,于恒壓滴液漏斗中緩慢滴加相應量的檸檬醛(溶于20mL無水乙醇),反應一定時間。反應結(jié)束后把所得產(chǎn)品進行抽濾,洗滌,得黃色粉末狀固體產(chǎn)物。用無水乙醇在索氏抽提器上回流萃取12h,50℃下真空干燥得到殼聚糖縮檸檬醛席夫堿衍生物。縮合反應方程式為:抑菌效率的計算見式(2)。式中,N1和N2分別為空白平板和涂有樣品的平板上的菌落數(shù)。對于黑曲霉采用干重法測定殼聚糖和席夫堿的抑菌效率。配制不同質(zhì)量分數(shù)的殼聚糖溶液和席夫堿溶液(0.5%的乙酸溶液為溶劑)。分別將1mL黑曲霉菌懸液和2mL不同濃度的樣品溶液添加到液體沙氏培養(yǎng)基中,空白為只加菌懸液而不加樣品溶液,在28℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,抽濾,干燥并稱重菌體干重,計算抑菌效率。抑菌效率的計算見式(3)。式中,W1和W2分別為不加樣品培養(yǎng)液中的菌絲重和添加樣品培養(yǎng)液中菌絲重。1.3.2菌種生長曲線測定對于細菌采用比濁法,添加一定量的樣品溶液于液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,使其質(zhì)量濃度為0.1g/L,接入濃度為107cfu/mL0.2mL的菌懸液,在37℃恒溫振蕩培養(yǎng),定時取樣測定其吸光度值,用吸光度值的變化反映細菌數(shù)量的變化。以培養(yǎng)時間為橫坐標,不同培養(yǎng)時間細菌懸濁液在620nm下的吸光度OD值為縱坐標,繪制細菌的生長曲線和相同菌種在加入殼聚糖或席夫堿后的抑菌曲線。吸光度測定空白為未接種細菌的液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。1.3.3黑曲霉菌體的制備對于霉菌采用菌體干重法,添加一定量的樣品溶液于液體沙氏培養(yǎng)基中,使其質(zhì)量濃度為0.1g/L,接入黑曲霉懸浮液1mL,在28℃恒溫振蕩培養(yǎng),定時取樣,用布氏漏斗抽濾,干燥并稱量菌體干重。以培養(yǎng)時間為橫坐標,不同培養(yǎng)時間的菌體干重為縱坐標,繪制霉菌的生長曲線和相同菌種在加入殼聚糖或席夫堿后的抑菌曲線。2結(jié)果與討論2.1殼聚糖的結(jié)構(gòu)表征殼聚糖和殼聚糖縮檸檬醛席夫堿的紅外吸收光譜如圖1所示。殼聚糖紅外譜圖中1597.23cm-1處為氨基N—H變形振動峰,2875.72cm-1處為C—H伸縮振動吸收峰,3417.71cm-1處歸屬于殼聚糖分子中O—H伸縮振動和N—H伸縮振動的吸收峰,1082.40cm-1處為C—OH的吸收峰。產(chǎn)物在1648.30cm-1出現(xiàn)C=N伸縮振動吸收峰;1610.60cm-1是C=C伸縮振動吸收峰,3064.25cm-1是不飽和雙鍵=C—H的吸收峰,1597.2cm-1處氨基N—H變形振動峰消失,可推知殼聚糖上的氨基與含醛基的檸檬醛發(fā)生了縮合反應,生成了碳氮雙鍵。圖2為殼聚糖和殼聚糖縮檸檬醛席夫堿的X射線衍射譜圖,由圖2可知,殼聚糖是一種結(jié)晶性高分子,在衍射角2θ為10°和20°附近出現(xiàn)強衍射峰。用檸檬醛縮合改性后形成的席夫堿,在位于2θ為10°時的結(jié)晶衍射峰消失,2θ為20°附近衍射峰明顯減弱,說明殼聚糖發(fā)生了化學改性,與檸檬醛發(fā)生了縮合反應。2.2反應物摩爾比n殼聚糖n檸檬醛對縮合率和取代度的影響采用正交實驗法[L9(33)]研究各因素對席夫堿反應縮合率和取代度的影響,以得到最佳反應條件,取代度由元素分析數(shù)據(jù)計算得到,如表1~表4所示。由表1~表4結(jié)果可知,3個因素對縮合率和取代度的影響作用大小順序皆為:反應溫度>反應物配比>反應時間。欲使縮合率和取代度最大,宜采用反應物摩爾比n(殼聚糖)∶n(檸檬醛)=1∶6,反應溫度40~50℃,反應時間10h。在最優(yōu)化條件下,進行優(yōu)化條件重復實驗,縮合率可達86%,取代度為0.82。2.3殼體聚糖和席夫堿的抗菌實驗2.3.1濃度對抗菌效果的影響殼聚糖及席夫堿的抑菌效率測試見表5~表7。從表5和表6中可以看出,殼聚糖和殼聚糖縮檸檬醛席夫堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有抑制作用,且抗菌效果都隨著濃度的增加而逐漸增強。殼聚糖縮檸檬醛席夫堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為1g/L,顯著優(yōu)于殼聚糖,說明殼聚糖縮檸檬醛席夫堿的抑菌效果明顯強于殼聚糖。從表7中可知,殼聚糖對黑曲霉沒有明顯的抑制作用,而殼聚糖縮檸檬醛席夫堿在質(zhì)量濃度為5.0g/L時能對黑曲霉起到100%的抑制作用,說明在殼聚糖分子鏈上引入檸檬醛席夫堿結(jié)構(gòu)后,增強了殼聚糖的抑菌活性,擴大了抑菌范圍。2.3.2殼聚糖添加量的確定圖3、圖4為細菌生長曲線。由圖3和圖4可知,殼聚糖和殼聚糖縮檸檬醛席夫堿的存在顯著地抑制了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)4h后便開始繁殖,吸光度增大,當添加殼聚糖后,生長適應期均延長為8h;而添加殼聚糖縮檸檬醛席夫堿后,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)12h后才開始繁殖。表明殼聚糖和殼聚糖縮檸檬醛席夫堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長均具有抑制作用,且殼聚糖縮檸檬醛席夫堿的抑菌效果優(yōu)于殼聚糖。2.3.3殼聚糖的抗菌作用機制圖5為霉菌生長曲線。由圖5可知,殼聚糖對黑曲霉不僅沒有抑制作用,反而有助于其生長。原因可能是黑曲霉屬于真菌類,真菌的細胞壁含有殼聚糖,黑曲霉中就有較高的殼聚糖含量,使得黑曲霉對殼聚糖的抗菌性能有一定的抗性,這決定了殼聚糖對黑曲霉沒有抑制能力,反而可能用于促進細胞的生長和繁殖。添加殼聚糖縮檸檬醛席夫堿后,黑曲霉菌體干重比對照有所減少,說明席夫堿可有效地抑制黑曲霉的生長,擴大了殼聚糖的抑菌范圍?？咕饔脵C制可以歸納為5種類型:(1)抑制核酸的合成;(2)抑制蛋白質(zhì)的合成;(3)改變細胞膜的通透性;(4)干擾細胞壁的合成;(5)作用于能量代謝系統(tǒng)和作為抗代謝物。殼聚糖不僅具有天然抗菌性能,而且抗菌譜廣。目前殼聚糖的抗菌作用存在若干不同的機理,其抗菌機制也因菌種的不同而不同。本研究利用殼聚糖的抗菌活性,在其分子鏈上引入檸檬醛席夫堿結(jié)構(gòu),制得抗菌活性優(yōu)于殼聚糖的席夫堿衍生物。3n檸檬醛的制備(1)殼聚糖與檸檬醛在超聲波振蕩下反應