NCAPG對乙型肝炎病毒導致肝癌以及預后影響

NCAPG對乙型肝炎病毒導致肝癌以及預后影響

馬維杰李偉成雨濱州醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院山東煙臺264000原發(fā)性肝癌是世界上最常見的腫瘤之一，也是腫瘤致死的第四大病因[1]。原發(fā)性肝癌按照細胞分型主要分為肝細胞肝癌、膽管細胞型肝癌、混合型肝癌。其中肝細胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)為肝癌的主要類型，約占全部的75%[2]。肝癌預后較差，2018年全球肝癌發(fā)病率為9.3/100000，相應死亡率為8.2%[1]。流行病學證據(jù)表明HCC的危險因素受地區(qū)的影響，在發(fā)展中國家，慢性乙肝病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染為導致肝細胞癌的主要影響因素[3]。HBV通過將自身DNA在癌癥的早期階段整合到宿主基因組中，誘導基因發(fā)生突變，使肝細胞對致癌因子敏感，同時HBV可能誘導體內(nèi)免疫細胞的失衡從而導致肝癌的發(fā)生[4-5]。與未感染人群相比，慢性HBV攜帶者患肝癌的終生風險高10到25倍[6]。因此如何抑制HBV攜帶者發(fā)展為肝癌患者對預防HCC的發(fā)生及預后有著重要的意義。盡管許多參與肝癌發(fā)生發(fā)展和預后的相關基因和通路被廣泛討論，然而對各種基因和通路之間的機制關系仍然比較模糊。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫中選擇GSE62232數(shù)據(jù)集，從而確定HBV與肝細胞癌的發(fā)展及預后相關的核心基因。通過GEO2R，分別獲得正常組織和無病因肝癌、正常組織和HBV導致肝癌的DGES，利用string在線數(shù)據(jù)庫、Cytoscape軟件構建DEGS的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-proteininteraction，PPI)網(wǎng)絡。通過Timerualcan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)NCAPG與腫瘤免疫浸潤水平的關系。對NCAPG進行Kaplan-Meier總體生存分析和相關性分析，最后通過TCGA數(shù)據(jù)庫篩選出NCAPG有關的肝細胞癌臨床數(shù)據(jù)，證明NCAPG屬于一個獨立預后因素。1材料和方法1.1肝細胞癌微陣列數(shù)據(jù)集采集和處理為了獲得hcc的mRNA表達集，在GEO數(shù)據(jù)庫中搜索“l(fā)iver”和“智人”，通過目標方向篩選出所需要的數(shù)據(jù)集GSE62232[7](基于GPL570[HG-U133_Plus_2]AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0Array)，其中包括10名正常人肝組織，10名HBV感染肝癌患者,15名無病因肝癌患者。其中所有數(shù)據(jù)均由公共數(shù)據(jù)庫獲取，本研究不涉及任何人體及動物實驗。1.2差異基因的鑒別和分析通過GRO2R分別鑒別正常肝組織和HBV肝癌患者、無病因肝癌患者之間的差異基因，P值和差異倍數(shù)(foldchange，F(xiàn)C)選擇默認數(shù)值，認為當P2時差異具有統(tǒng)計學意義。通過R軟件和BioConductor軟件包分別篩選之前的差異基因，隨后通過Venn圖檢查交叉基因。從Venn圖中找到目標差異基因(在HBV肝癌患者中獨有的上調(diào)基因)117個。1.3PPI網(wǎng)絡的構建以及hub基因的篩選通過將篩選出的差異表達基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)導入string數(shù)據(jù)庫中用于分析蛋白質(zhì)網(wǎng)絡復合體，提取出綜合得分>0.9的所有蛋白相互作用(PPI)對，一般認為綜合得分越高，基因越相似，PPI網(wǎng)絡的穩(wěn)定性越好。最后通過Cytoscape軟件計算所得的文件，最終選出10個hub基因。1.4hub基因的篩選通過對選中的10個hub基因與癌癥關聯(lián)性以及對其藥物敏感性的測定，初步選定將NCAPG作為本研究的關鍵基因。1.5hub基因與腫瘤免疫浸潤水平的關聯(lián)將選中的hub基因?qū)隩imer中，從中發(fā)現(xiàn)hub基因是否與CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤水平有關。進一步篩選hub基因與其相關亞群浸潤水平之間的關系。1.6hub基因的調(diào)控因子為明白hub基因在hcc中的生物學意義，通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫查找出與hub基因有關的相關基因，分析了NCAPG共表達基因的激酶、miRNA和轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor，TF)的富集。1.7對hub基因的GSEA富集分析通過TCGA-GDC數(shù)據(jù)庫下載與LIHC有關的mRNA信息，篩選出所需要的hub基因，通過運用Java、perl、GSEA(4.1.0)繪制富集分析圖，明確hub基因的功能。1.8hub基因的生存分析使用Kaplan-Meier在線數(shù)據(jù)庫對hub基因進行生存分析，分別分析總生存期(overallsurvival，OS)、無進展生存期(progressionfreesurvival，PFS)，并將其表達在曲線圖中。1.9hub基因的臨床相關性分析將hub基因?qū)險ALCAN數(shù)據(jù)庫，分別選擇在不同種族、年齡、性別等方面表達量差別，進一步分析hub基因與肝癌生存分析的相關性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。1.10hub基因的單、多因素COX回歸通過TCGA-GDC數(shù)據(jù)庫下載與LIHC有關的臨床信息，通過perl軟件進行數(shù)據(jù)清理，隨后通過perl軟件、R語言對其進行單、多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1對DEG的篩選通過對數(shù)據(jù)集GSE62232分析，成功從正常肝組織和HBV肝癌患者對照組中識別出495個DEGs，其中包括178個上調(diào)基因和317個下調(diào)基因。從正常肝組織和不患有HBV肝癌患者對照中識別出241個DEGs，其中包括68個上調(diào)基因和173個下調(diào)基因(表1)。利用在線數(shù)據(jù)庫對GSE62232以P2為截斷點，確定有統(tǒng)計學意義的DEGs進行分析，計算并繪制Venn圖(圖1)。通過Venn圖中分析DEGs之間的交集，發(fā)現(xiàn)有117個DEGs只在HBV相關肝癌患者中高表達，156個DEGs只在HBV相關肝癌患者中低表達。有7個DEGs只在無病因肝癌患者中高表達，12個DEGs只在無病因肝癌患者中低表達。從中選擇將117個DEGs作為下一步研究對象。表1不同表達基因的聚類圖1不同基因之間的Venn圖。2.2PPI網(wǎng)絡的構建以及hub基因的篩選使用string數(shù)據(jù)庫來確定117個DEGs的蛋白質(zhì)集合網(wǎng)絡，通過設置綜合得分>0.9從而得出115個節(jié)點和74條相互作用(圖2A)。(PPI富集P值<0.05(圖2C)。本研究通過將10個hub基因?qū)隚SCALIte中來發(fā)現(xiàn)與hub基因有關的藥物敏感性與基因表達量之間的關系。本研究發(fā)現(xiàn)NCAPG藥物敏感性較好(圖2D)，因此，把NCAPG作為本次研究的主要基因。2.3NCAPG與腫瘤免疫浸潤水平的關聯(lián)將選中的NCAPG導入Timer中，從中發(fā)現(xiàn)NCAPG基因的表達可能促進CD4+T細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞和樹突狀細胞在腫瘤中浸潤水平，而與CD8+T細胞無關(圖3A)。同時本研究通過針對年齡、性別、種族和腫瘤階段等因素進行了多元Cox回歸，本研究確定了免疫細胞的浸潤程度與患者的預后有關，其中CD4+T細胞浸潤率最高的20%的患者的中位生存時間低于最低20%的患者。這表明，CD4+T細胞可能通過NCAPG在LICH腫瘤表達中起著重要的作用(圖3B)。本研究探討了細胞拷貝數(shù)與免疫浸潤之間的關系，還發(fā)現(xiàn)當NCAPG處于高度擴增的狀態(tài)下可以影響CD4+T細胞、巨噬細胞、CD8+T細胞的浸潤情況(P<0.05)(圖3C)。為進一步表明NCAPG與CD+T細胞之間的關系，運用R語言對其進行進一步篩選發(fā)現(xiàn)，NCAPG與CD4+T細胞中的Th2細胞具有高度正相關性，與DC、中性粒細胞、CD8+T細胞等呈負相關性(圖3D)。A.是由117個DEGs通過設置綜合得分>0.9從而得出115個節(jié)點和74條相互作用的蛋白質(zhì)集合網(wǎng)；B.用Cytoscape(v3.7.2)根據(jù)連接度篩選出PPI中的前10個hub基因。已鑒定的BUB1、CDC20、NDC80、BUBU1B、CENPF、BIRC5、NUF2、TTK、NCAPG和MELK等10個hub基因從(紅色高度值到黃色低度值)；C.箱圖表示所選基因在正常組織和腫瘤組織中的差異表達情況從左到右箱圖分別表示BUB1、CDC20、NDC80、BUBU1B、CENPF、BIRC5、NUF2、TTK、NCAPG、MELK在腫瘤組織和正常組織之間的表達情況；D.CDC20、BUB1、CENPF、BUB1b、NCAPG、NDC80、TTK、MELK、BIRC5等10個hub基因與不同藥物敏感性的關系。A.通過TIMER2.0對NCAPG進行相關免疫細胞浸潤情況分析；B.NCAPG和相關浸潤細胞對HCC預后的影響；C.NCAPG在深度缺失、臂水平缺失、二倍體/正常、臂水平增益和高擴增等情況下在HCC中免疫細胞浸潤水平的比較；D.NCAPG與相關免疫細胞在HCC中的表達關聯(lián)情況。2.4HCC中NCAPG的調(diào)控因子為了進一步探索HCC中NCAPG的調(diào)控因子，本研究通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析了NCAPG及其相關共表達基因的激酶，miRNA和轉(zhuǎn)錄因子(TF)的富集(表2)。前5個最重要的激酶主要與細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)，polo樣激酶1(PLK1)，極光激酶B(AURKB)，檢查點激酶1(CHEK1)和細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)相關。除CDK2外，其余激酶基因均高度表達于腫瘤組織中。轉(zhuǎn)錄因子主要富集在E2F轉(zhuǎn)錄因子組中。miRNA并未發(fā)現(xiàn)明顯富集。表2與NCAPG相關的激酶，miRNA和轉(zhuǎn)錄因子的富集2.5NCAPG的GSEA富集分析為明確NCAPG在體內(nèi)的主要功能，通過GSEA軟件對NCAPG進行富集分析。通過下載與LIHC有關的mRNA信息，繪制富集分析圖(圖4)。本研究發(fā)現(xiàn)NCAPG主要在細胞周期、RNA降解、剪接體、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、胰島素信號通路、核苷酸切除修復等通路中高表達，在補體與凝血反應、脂肪酸代謝、初級膽汁酸生物合成、藥物代謝細胞色素p450、纈氨酸和亮氨酸降解、色氨酸代謝等通路中低表達。2.6Hub基因的生存分析將NCAPG導入Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫中獲得預后信息。本研究發(fā)現(xiàn)NCAPG基因的異常表達水平與HCC的預后不良有關，在NCAPG高表達組中的OS、PFS均低于低表達組，P<0.05(圖5A)。圖4NCAPG的GSEA富集分析A.TCGALIHC隊列中的總生存期(OS)、無病生存期(DFS)；B.基于性別、年齡和其他標準(UALCAN)分層的HCC患者亞組中的NCAPG轉(zhuǎn)錄。箱圖顯示了NCAPG在LIHC樣品亞組中的表達。從左到右分別顯示正常個體或1、2、3或4期LIHC患者中NCAPG的相對表達。正常、高加索人、非裔美國人、亞洲LIHC患者中NCAPG的相對表達。正常個體或具有1、2、3或4級腫瘤的LIHC患者中NCAPG的相對表達。正常個體和男性或女性LIHC患者中NCAPG的相對表達。任何年齡的正常個體或21～40、41～60、61～80或81～100歲的LIHC患者中NCAPG的相對表達。正常和LIHC樣本中NCAPG的相對表達。中心標記是中位數(shù)；盒子的邊緣是第25個和第75個百分位數(shù)；C.多因素Cox回歸用于評估年齡、性別、登記、階段、TNM分期以及NCAPG對于HCC預后影響。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。2.7NCAPG基因的臨床相關性及其臨床數(shù)據(jù)分析在UALCAN數(shù)據(jù)庫中分別選擇在不同種族、年齡、性別、疾病階段、甲基化等方面進行分析，發(fā)現(xiàn)在HCC患者組中NCAPG的表達量均高于正常對照組(圖5B)。因此，本研究認為，NCAPG的表達可以作為一個潛在的HCC的診斷指標。由于單基因分析中可因人群分布差異從而導致假陽性結果，因此，通過COX回歸進行臨床樣本的校正，排除相關差異。通過TCGA—GDC下載與LIHC有關的臨床信息，從中得出377例文件，通過perl軟件進行數(shù)據(jù)清理，從中得出HCC的377例臨床數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行整理，從中選擇出231例所有信息均未失訪的樣品，隨后通過perl軟件、R語言對其進行單、多因素分析(圖5C)。3討論NCAPG為編碼凝縮蛋白復合物的亞基，負責有絲分裂和減數(shù)分裂過程中染色體的凝結和穩(wěn)定[8]。編碼蛋白的磷酸化激活凝縮蛋白復合物。先前的研究表明NCAPG為肝細胞癌的重要癌基因[9]，但是對于導致NCAPG上調(diào)的病因以及其機制仍不清楚。在本研究中，主要通過生物信息分析技術從GEO數(shù)據(jù)庫中找出正常組織和無病因肝癌、正常組織和HBV導致肝癌的DEGs圖譜，并從中篩選出在HBV相關肝癌中表達的117個上調(diào)的DEGS和156個下調(diào)的DEGs，從上調(diào)的DEGS中通過PPI蛋白質(zhì)聚合體網(wǎng)絡中選擇前10位的hub基因。通過KEGG富集分析本研究發(fā)現(xiàn)這10個hub基因最顯著的富集途徑為細胞周期。而細胞周期紊亂是導致癌細胞異常增殖的主要原因[10]。正常細胞的增殖依賴于接收到適當?shù)挠薪z分裂信號，同時細胞只有在G1期結束時才進入細胞周期，細胞周期蛋白驅(qū)動正常細胞進入分裂周期，并通過激活細胞周期蛋白依賴性激酶來調(diào)控細胞凋亡，從而調(diào)控細胞生長。然而細胞周期蛋白的上移導致細胞生長周期紊亂以及細胞凋亡失調(diào)[11]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)NCAPG基因的表達可能促進CD4+T細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞和樹突狀細胞在腫瘤中浸潤水平，而與CD8+T細胞無關。腫瘤組織中的免疫細胞與臨床預后密切相關，有可能作為藥物靶標來提高患者的預后率。本研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤相關浸潤細胞中CD4+T細胞高表達的預后較差。本研究是否可以認為NCAPG通過介導T細胞中的某一途徑從而使T細胞免疫作用發(fā)生改變，從而促進腫瘤細胞的增殖分化，也有可能的解釋是肝癌患者的宿主免疫系統(tǒng)將NCAPG識別為新抗原，從而導致T細胞聚集，但為何CD4+T細胞聚集卻導致預后較差，這需要進一步實驗驗證。為了進一步確認NCAPG與免疫細胞之間的關系，本研究通過篩選實驗數(shù)據(jù)對其進行分析發(fā)現(xiàn)，NCAPG在HCC中與Th2細胞具有高度相關性、與CD8+T細胞具有負相關性且具有統(tǒng)計學意義。Th2細胞屬于CD4+T細胞中的一種，是一種能夠分泌Th2型細胞因子(如白細胞介素IL-4、IL-5、IL-10等)的T細胞亞型[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，當NCAPG高表達時促進了Th2細胞的表達，抑制了Th1細胞的表達從而導致Th1/Th2失衡。Th1/Th2失衡可促進HBV轉(zhuǎn)變?yōu)镠CC的概率[15-16]。Budhu[17]等發(fā)現(xiàn)，在HBV+的HCC患者中，與孤立性HCC相比，存在靜脈轉(zhuǎn)移的HCC患者中促炎性Th1樣細胞因子產(chǎn)生較少，抗炎性Th2樣細胞因子產(chǎn)生較多，存在Th1/Th2失衡。這也可能是NCAPG高表達時預后較差的原因之一。CD8+T細胞識別源自吞噬和蛋白水解裂解的HBV蛋白的病毒肽，激活B細胞，并分泌IFN-γ和TNF-α，從而抑制HBV的復制和基因表達[5,18]。Wang[19]等研究發(fā)現(xiàn)，在慢性乙肝病毒患者體內(nèi)的HBV特異性CD8+T細胞存在功能耗竭的情況，當在急性免疫激活狀態(tài)下再度感染HBV時，特異性CD8+T細胞不能有效的發(fā)揮抗病毒能力，表明衰竭的特異性CD8+T細胞與慢性HBV復制和由此進一步導致的疾病進展有關。本研究發(fā)現(xiàn)當NCAPG高表達時CD8+T細胞表達量減少，NCAPG可能在慢性肝炎的過程中誘導CD8+T細胞的耗竭過程，從而促進HBV的復制，導致HCC的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，抗PD-1抗體可恢復HCC中CD8+T細胞的功能[20]，那抗PD-1抗體是否可以作用于NCAPG高表達的患者中從而降低HBV患者向HCC轉(zhuǎn)換的比值，這需要進一步驗證。Xiao[21]研究表明，NCAPG高表達與多種腫瘤如HCC、乳腺癌、肺癌或卵巢癌的不良生存密切相關。這是否可以認為NCAPG基因作用于這些癌癥的共同通路中，這對研究NCAPG作用機制提供了一定的方向。本研究通過研究NCAPG共表達網(wǎng)絡的調(diào)控因子發(fā)現(xiàn)，NCAPG與包括CDK1，PLK1，AURKB，CHEK1和CDK2在內(nèi)的激酶網(wǎng)絡相關。這些激酶對于調(diào)節(jié)基因組穩(wěn)定性、有絲分裂的進行、發(fā)展以及細胞周期具有重大意義，并在LIHC中存在差異表達和影響存活預后。實際上，CDK1除了調(diào)控細胞分裂以及細胞分化等功能外，還可以維持胚胎干細胞的表觀遺傳特性[22]。CDK1可作為有絲分裂期間巨噬細胞自噬的主要調(diào)節(jié)劑，在有絲分裂期間抑制巨噬細胞的自噬作用，從而維持基因組的穩(wěn)定性[23]。本研究通過對NCAPG單獨基因的GSEA分析發(fā)現(xiàn)，其基因高表達時可促進巨噬細胞內(nèi)吞作用，可能會導致CDK1功能發(fā)生改變，進而影響DNA的復制、修復等方面。丙型肝炎病毒可誘導AURKB活性下降，導致HCV感染性增大[24]。本研究通過GSEA分析也發(fā)現(xiàn)了NCAPG上調(diào)可以影響剪切體形態(tài)，本研究有理由相信AURKB-Sv1可能是由