藻藍(lán)蛋白 實驗報告

藻藍(lán)蛋白的分離與純化姓名：郭均學(xué)院：食品與生物工程班級：食安09-2學(xué)號：200906041069藻藍(lán)蛋白的分離與純化實驗?zāi)康暮鸵?、了解藻藍(lán)蛋白的生理意義及功能，藻藍(lán)蛋白的一般提取和純化的方法；2、掌握蛋白含量測定方法；3、掌握鹽析和離子交換層析純化蛋白的分析技術(shù)。二、實驗原理藻藍(lán)蛋白（PC）是一類普遍存在于藻藍(lán)蛋白中的光合輔助色素，也是一種天天然色素蛋白，具有水溶性，可用作視頻著色劑。此外，它具有強(qiáng)烈的熒光，在分子生物學(xué)上被制成熒光探針，是一種無毒、無副作用的理想光敏劑。藻藍(lán)蛋白還具有重要的醫(yī)療價值，不但能提高機(jī)體的非特異性免疫功能，而且對特異性免疫功能有促進(jìn)作用。另外它還有清除自由基的能力，可以抗疲勞，延緩衰老，對人體的生理功能有重要的生物學(xué)意義。利用鹽析沉淀蛋白質(zhì)的基本原理：鹽在水溶液中電離所形成的正負(fù)離子可吸收水分子，從而奪取蛋白質(zhì)分子上的水化膜，還可以中和部分電荷，致使蛋白質(zhì)聚集，從而達(dá)到鹽析沉淀蛋白質(zhì)的目的。由于各種蛋白顆粒大小、所帶電荷的多少及親水程度不同，當(dāng)使用某種中性鹽對其進(jìn)行鹽析時，所需的最低鹽濃度各不相同。研究表明可用25%硫酸銨飽和度沉淀除去雜質(zhì)，55%硫酸銨沉淀藻藍(lán)蛋白。鹽析出來的蛋白質(zhì)，需通過脫鹽以除去硫酸銨等鹽類物質(zhì)。最常用脫鹽的方法是透析。蛋白質(zhì)是大分子物質(zhì)，它不能透過半透膜，故不斷更換蒸餾水或緩沖液可將鹽類等小分子雜志透析掉。蛋白質(zhì)含量測定有紫外分光光度計法和顯色法（Folin-酚法、考馬斯亮藍(lán)法等），本實驗采用考馬斯亮藍(lán)法測定提取藻藍(lán)蛋白的含量，考馬斯亮藍(lán)G-250在酸性溶液中為棕紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用后變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收由465nm變?yōu)?95nm，在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與595nm處吸光值成正比。離子交換層析法純化蛋白質(zhì)，常用的陽離子交換劑有弱酸性的羧甲基纖維素（CM纖維素），陰離子交換劑有弱堿性的二乙胺基乙基纖維素（DEAE-纖維素）。蛋白質(zhì)的混合物與纖維素離子的交換劑的酸性基團(tuán)或堿性基團(tuán)結(jié)合，結(jié)合力的大小取決于彼此間相反基團(tuán)的靜電引力，這又與溶液的pH有關(guān),因為pH決定離子交換劑和蛋白質(zhì)的解離程度。鹽類的存在可以降低離子交換劑的解離基團(tuán)與蛋白質(zhì)相反電荷之間的靜電引力。因此，被吸附的蛋白質(zhì)的洗脫通過改變pH或離子強(qiáng)度來實現(xiàn)，與離子交換劑結(jié)合力小的蛋白質(zhì)先從層析柱中洗脫下來。本實驗以藍(lán)藻為材料，采用反復(fù)凍融、分步鹽析法對藻藍(lán)蛋白進(jìn)行提取和初步純化，采用考馬斯亮藍(lán)法測定提取藻藍(lán)蛋白的含量，然后使用DEAE-纖維素柱層析對提取的藻藍(lán)蛋白進(jìn)一步純化（由于來源不同和種類的差別，目前研究報道的藻藍(lán)蛋白等電點(diǎn)尚無一致結(jié)論，但都在3.4-4.8之間，其中鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白的等電點(diǎn)為4.3，在pH6.5磷酸鹽緩沖液中帶負(fù)電，所以選擇DEAE-纖維素陰離子交換柱）。預(yù)期得到純度較高的藻藍(lán)蛋白。三、試劑與儀器1、試劑螺旋藻藻粉0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.5）:配置0.2mol/LpH6.5硫酸緩沖液；稱取磷酸二氫鈉32.21g溶于蒸餾水稀釋至1000mL為A液。稱取磷酸二氫鈉71.64g溶于蒸餾水稀釋至1000mL為B液。取A液68.5mL,B液31.5mL,混勻后即可。稀釋0.2mol/LpH6.5硫酸緩沖液20倍得0.01mol/LpH6.5硫酸緩沖液。標(biāo)準(zhǔn)蛋白（0.1mg/mL）:結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度配制成0.1mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液?？捡R斯亮藍(lán)G-250：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，加蒸餾水稀釋至1000mL。0.5mol/LNaOH0.5mol/LHCINaCl硫酸銨透析袋DEAE-纖維素奈氏試劑：將10g碘化汞和7g碘化鉀溶于水中，另將24.4氫氧化鉀溶于內(nèi)有70mL水的100mL容量瓶中，并冷卻至室溫。將上述碘化汞和碘化鉀溶液注入容量瓶中，邊加邊搖動。加水至刻度，搖勻，放置2天后使用。試劑保存在棕色試劑瓶中，暗處。四、實驗步驟（一）藻藍(lán)蛋白的提取及初步純化1、藻藍(lán)蛋白抽提：采用反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液浸提蛋白。具體操作：取螺旋藻粉1g，加入0.01mol/LPh6.5的磷酸鹽緩沖液10ml，充分?jǐn)嚢杈鶆颉Ｊ覝亟?0min-1h后，在-20℃和38℃之間反復(fù)凍融數(shù)次（3-5次）。細(xì)胞破碎后，將懸浮液移入離心管，加入10mL0.01mol/LPh6.5的磷酸鹽緩沖液，混勻，靜止30min，4000r/min離心20min，上清液即為抽提得到的藻藍(lán)蛋白混合液。2、分步鹽析：采用不同濃度的硫酸銨分步鹽析初步純化出藻藍(lán)蛋白。具體操作：取上清液，用25%飽和度的硫酸銨4℃鹽析30min，然后4000r/min離心20min，所得上清液用55%飽和度的硫酸銨4℃鹽析24h，4000r/min離心20min，棄去上清液，離心收集得到的沉淀即為藻藍(lán)蛋白。3、透析去鹽得到的沉淀用10ml0.01mol/LPh6.5的磷酸鹽緩沖液溶解，然后將藻藍(lán)蛋白粗提液置于透析袋（截留分子質(zhì)量為10kD）中在500mL0.01mol/LPh6.5的磷酸鹽緩沖液（或H20）中透析袋中倒出純化后的藻藍(lán)蛋白，于4℃下保存?zhèn)溆谩＃ǘ┰逅{(lán)蛋白含量測定1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；2、樣品含量測定；3、計算結(jié)果。具體操作步驟如下：取潔凈干燥的試管若干，按表1-1比例配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。原始標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度為0.1mg/mL。表1-1標(biāo)準(zhǔn)溶液配置管號123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白（mL）00.20.40.60.81.0蒸餾水（mL）1.00.80.60.40.20混勻此6組試管中的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，分別加入4mL考馬斯亮藍(lán)G-250，搖勻（充分混合），室溫放置5min后在595nm波長處比色，以1號管調(diào)零點(diǎn)，得到5組標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在595nm處的吸光值A(chǔ)595。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以A595值為縱坐標(biāo)作圖，得到的趨勢線即標(biāo)準(zhǔn)曲線。將提取的藻藍(lán)蛋白溶液1mL適當(dāng)稀釋（6-10倍左右），再取0.2mL，補(bǔ)充水到1mL，同上進(jìn)行比色操作，得到其595nm處的吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線推算其含量。（三）藻藍(lán)蛋白純度的測定測定A620和A280值，純度可以用A620/A280來表示。將上述稀釋后的樣品，用可見分光光度計，測定其在620nm波長處的吸光值A(chǔ)620；再將樣品轉(zhuǎn)出，裝入石英比色皿，放入紫色分光光度計，測定其在280nm波的吸光值A(chǔ)280。由于藻藍(lán)蛋白在620nm波長處有特征吸收峰，其純度可以用A620/A280來表示。因此，根據(jù)在可見和紫外分光光度計中得到的數(shù)據(jù)就可以用推算出提取的藻藍(lán)蛋白樣品的純度。（四）藻藍(lán)蛋白的進(jìn)一步純化1、DEAE-纖維素處理、裝柱和平衡2、上樣、洗脫3、測定純化的蛋白濃度和純度，并分別計算回收率和純化倍數(shù)。具體操作：稱取所需DEAE纖維素用蒸餾水浸泡過夜，其間換幾次水，每次除去細(xì)小顆粒。抽干，改用0.5mol/LNaOH溶液浸泡30min，抽干（可用布氏漏斗），用無離子水漂洗，使pH至8左右（用pH試紙檢查）。再改用0.5mol/LHCL溶液浸泡30min，去酸溶液，用無離子水洗至pH6左右。脫氣后裝柱，用三倍柱床體積的0.01mol/LPh6.5的磷酸鹽緩沖液平衡。將初步純化得到的藻藍(lán)蛋白液上DEAE-纖維素柱，采用0.01mol/LPh6.5的磷酸鹽緩沖液洗脫（含0.4mol/LNaCL）進(jìn)行洗脫，柱上層的深藍(lán)色部分大多被迅速洗脫下來，只殘留少量藍(lán)色。流速控制在10d/min，用小試管收集洗脫液，每管收集2mL（或30滴），收集10-12管（呈現(xiàn)藍(lán)色的液體內(nèi)含有目的蛋白）。測定每管樣品的A620，橫坐標(biāo)洗脫體積、縱坐標(biāo)A620值，繪制洗脫曲線。合并所有的管中的樣品，A620和A280值，計算純度。（注意：開始洗脫時就需要收集洗脫液，測量洗脫液體積，用于繪制洗脫曲線）然后用0.01mol/LPh6.5的磷酸鹽緩沖液（含0.6mol/LNaCL）洗脫，洗脫下的是別藻藍(lán)蛋白。柱料的再生：用0.5ml/LHCL溶液處理柱料，洗2-3倍柱床體積，用H20洗至pH6.0，0.01mol/LPh6.5的磷酸鹽緩沖液平衡。五、數(shù)據(jù)處理和實驗結(jié)果1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表1-2標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液吸光度管號123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白（mL）00.20.40.60.81.0蒸餾水（mL）1.00.80.60.40.20吸光度（A595）0.0000.2010.4140.4840.6610.740所測樣品吸光度A595=0.706，可推算出樣品中藻藍(lán)蛋白含量m=0.917g2.洗脫曲線的繪制表1-3柱層析洗脫液吸光度試管編號1234567A6200.0020.0050.0930.2510.3810.2240.132試管編號8910111213A6200.0810.0520.0520.0290.0080.0093.藻藍(lán)蛋白純度計算鹽析后蛋白純度=A620/A280=0.385/0.517=0.745柱層析后蛋白純度=A620/A280=0.226/0.103=2.1944.回收率和純化倍數(shù)計算蛋白得率=鹽析后蛋白含量/1g藻粉=0.917/1.00=91.7%純化倍數(shù)=柱層析后蛋白純度/鹽析后純度=2.194/0.745=2.94六、思考題1.蛋白含量測定的方法有哪些？各有什么特點(diǎn)？（1）.凱氏定氮法：是測定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和最簡單的方法之一，被作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗法。適用范圍廣泛，測定結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜費(fèi)時，實際消耗量大。(2).雙縮脲法：試劑單一，方法簡便，但靈敏度差，測定范圍為1~20mg蛋白質(zhì)。適用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白測定，常用于谷物蛋白的含量測定。(3).紫外吸收法：簡單靈敏快速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定，測定后仍能回收使用。但準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)較多，適用于與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。(4).考馬斯亮藍(lán)法：方法簡便，易于操作，所用試劑少，顯色劑易于配置，且干擾物質(zhì)少。但用于不同蛋白測定時有較大偏差。適用于要求靈敏度高、快速定量測定微量蛋白質(zhì)。(5).Folin-酚試劑法:優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，缺點(diǎn)是費(fèi)時較長，要精確控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性差，干擾物質(zhì)較多。2.鹽析分離蛋白的原理是什么？其原理：當(dāng)一定高濃度的中性鹽加入到蛋白質(zhì)溶液中時，因中性鹽與水的親和力大，又是強(qiáng)電解質(zhì)，一方面結(jié)合大量自由水，降低水分活度；一方又奪取蛋白質(zhì)表面的水化膜，增大蛋白質(zhì)之間相互作用的機(jī)會，還可以中和部分電荷，使其聚集絮結(jié)成沉淀析出，從而使蛋白質(zhì)分離。3.離子交換層析純化蛋白質(zhì)的原理其原理：離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。4.藻藍(lán)蛋白的功能有哪些？有以下幾個功能：(1)作為食用色素：藻藍(lán)蛋白是水溶性色素，無毒，純藍(lán)，清亮可愛，可作為食品著