cid-miR-146a在LCDV-cn感染中的差異表達及其調控作用

cid-miR-146a在LCDV-cn感染中的差異表達及其調控作用

胡海浩，黃鑒濤，馬嘉霖，楊碩，閆秀英，簡紀常（廣東海洋大學水產(chǎn)學院/廣東省水產(chǎn)動物病害防控與健康養(yǎng)殖重點實驗室/水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制廣東普通高校重點實驗室，廣東湛江524088）魚淋巴囊腫病毒中國株（LymphocystisdiseasevirusChina,LCDV-cn）是牙鲆（Paralichthysolivaceus）淋巴囊腫病的病原[1]，致使患魚在皮膚、鰭、尾部等長有囊腫，給牙鲆養(yǎng)殖造成了重大損失。對LCDVcn及牙鲆淋巴囊腫病的研究已取得一定進展[2-6]，但牙鲆淋巴囊腫病的有效防控依然是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的難題，其原因之一是LCDV-cn的致病機制知之甚少[7]。微小RNA（miRNA）可通過與靶基因結合對靶基因的轉錄進行調控，從而參與多種病理、生理過程[8]。因此，對LCDV-cn感染過程中miRNA的調控作用進行研究，可在miRNA層面解析LCDV-cn的致病機制。研究發(fā)現(xiàn)不同物種miR-146a的序列高度保守，提示miR-146a在生物體的生理、病理過程中可能發(fā)揮重要作用[8]。已有研究表明miR-146a在多種腫瘤中高度表達，調控腫瘤發(fā)生發(fā)展的許多生物學過程，而且miR-146a的調控具有促腫瘤發(fā)展的作用，抑制miR-146a的表達可使腫瘤細胞的致瘤性和侵襲力下降[9-10]。更有研究表明miR-146a調控病毒的感染過程，如在乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus,HBV）感染過程中，miR-146a通過抑制機體抗病毒反應促進HBV復制和蛋白表達[11]；丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus,HCV）感染可誘導miR-146a的表達上調，從而促進病毒感染[12]；在人乳頭瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）感染中，miR-146a發(fā)揮多重作用，調控HPV的感染進展[13]；還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a的上調與EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）感染引起的腫瘤細胞增殖相關[14-15]、有些病人miR-146a的下調可能與新型冠狀病毒（Coronacovid-19virus，COVID-19）感染引起的嚴重癥狀有關[16]、miR-146a可調控人類免疫缺陷病毒（Humanimmunodefdiciencyvirustype1,HIV-1）感染[17]、miR-146a的表達上調可促進石斑魚虹彩病毒（Singaporegrouperiridovirus，SGIV）感染[18]，等。上述研究表明miR-146a在病毒感染和腫瘤發(fā)生中起著重要的調控作用。本課題組前期研究[19]表明，草魚miR-146a（CtenopharyngodonidellamiR-146a，cid-miR-146a）在LCDV-cn感染草魚卵巢細胞系（grasscarpovarycells，GCO）過程中存在顯著差異表達。因此，本研究在LCDV-cn感染GCO過程中，對cid-miR-146a進行鑒定和表達特性分析，并探索cid-miR-146a的調控作用，為在miRNA層面解析LCDV-cn的致病機制等提供基礎。1材料與方法1.1材料與試劑LCDV-cn分離自患淋巴囊腫病的牙鲆，保存于本實驗室；GCO細胞購買于深圳檢驗檢疫局。本研究所用引物見表1，在上海生工生物技術有限公司合成。1.2LCDV-cn感染GCO細胞用25cm2細胞培養(yǎng)瓶于28℃培養(yǎng)GCO細胞，具體操作參照文獻[2,19]，所用培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基[含體積分數(shù)10%胎牛血清（FBS）]，正常傳代約48h單層細胞鋪滿瓶底時，吸出培養(yǎng)液，取1mL的LCDV-cn懸液（滴度濃度105.5TCID50/mL[19]）進行感染（同時設未感染組為對照組），于20℃下孵育1h后，取出病毒懸液，加入4mL維持液（含體積分數(shù)2%FBS的MEM培養(yǎng)基）于20℃下繼續(xù)感染實驗，并定時取樣。1.3電鏡負染取10mL滴度濃度（105.5TCID50/mL）的LCDV-cn懸液[19]，于室溫和-80℃反復凍融4次，于4℃、1000g條件下離心30min，取上清用質量分數(shù)3%磷鎢酸進行染色，于廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院進行電鏡觀察。1.4頸環(huán)（Stem-loop）RT-PCR取LCDV-cn感染GCO72h時樣品1瓶（細胞培養(yǎng)瓶），胰酶消化后取1×106個細胞，于室溫、1000g條件下離心3min，棄上清后，加入1mLTrizol，按照TRIzol?LS試劑盒說明書提取RNA，并用10mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。用提取的RNA和頸環(huán)反轉錄引物RT-cid-miR-146a（表1），按照反轉錄試劑盒PrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser說明書進行特異性反轉錄，制備頸環(huán)RT-PCR模板cDNA，保存于-80℃?zhèn)溆谩１?引物序列Table1Primersusedinthisstudy根據(jù)前期研究結果[19]，采用頸環(huán)RT-PCR擴增cid-miR-146a，所用引物cid-miR-146a-F和cid-miR-146a-R見表1。PCR擴增體系為50μL，包含EX-Taq25μL、cDNA3μL（質量濃度約為50μg/mL）、cid-miR-146a-F2μL、cid-miR-146a-R2μL和ddH2O18μL。PCR反應條件為95℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，循環(huán)40次。然后用3%（質量體積比）瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。頸環(huán)RT-PCR擴增獲得目的片段的長度為60bp，包括上游序列4bp（5′-GCGC-3′）、cid-miR-146a序列23bp（5′-TGAGAACTGAATTCCATAGATGG-3′）、頸環(huán)序列33bp（5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATCGAC-3′）。將cid-miR-146a插入至pMD18-T載體，然后轉化至DH5α，于37℃下進行培養(yǎng)。按藍白斑篩選方法選取陽性菌落[1]，并將陽性菌落送往上海生工生物技術有限公司進行測序。1.5定量PCR收集LCDV-cn感染GCO細胞后0、4、8、16、24、48、72、144和196h樣品，然后制備cDNA（同前）用于定量PCR。所用引物cid-miR-146a-F、cid-miR-146a-R、U6F和U6R見表1，定量PCR總體積為10μL，包含TBGreenPremixExTaqII5μL、cDNA1μL、cid-miR-146a-F1μL、cid-miR-146a-R1μL和ddH2O2μL。反應條件為95℃預變性30s，95℃變性5s、60℃退火30s，循環(huán)40次。上調下調實驗中，cid-miRNA-146a在GCO細胞的表達定量。上調下調實驗包括4組：上調組（轉染cid-miR-146amimics模擬物，轉染濃度為20nnmol/L）、下調組（轉染cid-miR-146ainhibitor抑制物，轉染濃度為20nnmol/L）、陰性對照（NC組：轉染NC，轉染濃度為20nnmol/L，）和陽性對照（LCDV-cn正常感染組，無轉染）。cid-miR-146amimics、cid-miR-146ainhibitor和NC的序列分別為5′-UGAGAACUGAAUUCCAUAGAUGG-3′、5′-CCAUCUAUGGAAUUCAGUUCUCA-3′和5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′，于上海生工生物技術有限公司合成。用不含抗生素的MEM（含體積分數(shù)10%FBS）培養(yǎng)GCO細胞，當GCO細胞于12～16h單層生長至70%～90%時，使用Lipo‐fectamineTMRNAiMAX將cid-miR-146amimics、cidmiR-146ainhibitor和NC分別轉染至GCO細胞，培養(yǎng)24h后，用LCDV-cn進行感染，于20℃繼續(xù)培養(yǎng)。然后，收集LCDV-cn感染GCO細胞0、4、8、16、24、48、72、144和196h樣品，制備cDNA用于cid-miR‐NA-146a的定量。定量PCR所用引物、定量PCR體系和反應條件同上述cid-miRNA-146a的表達定量。cid-miRNA-146a靶基因Flt1的表達定量。樣品制備同上述上調下調實驗。定量PCR所用引物RT-Flt-F、RT-Flt-R、18s-F和18s-R見表1，定量PCR體系和反應條件同上述cid-miRNA-146a的表達定量。根區(qū)溫度對嫁接黃瓜苗葉綠素熒光參數(shù)的影響……………劉念奇，宋陽，孫世君，高宇，吳佳旺，崔曉晗（118）LCDV-cnmcp（主要衣殼蛋白，majorcapsidprotein）的表達定量（代表LCDV-cn的復制[7]）。樣品制備同上述上調下調實驗。定量PCR所用引物RT-LCDV-MCP-F、RT-LCDV-MCP-R、18s-F和18s-R見表1，定量PCR體系和反應條件同上述cid-miR-146a的表達定量。1.6統(tǒng)計分析應用SPSS24軟件，用2-ΔΔCt法[23]進行單因素方差分析，并統(tǒng)計差異顯著與否（P<0.05或P<0.01）。1.7cid-miR-146a靶基因預測應用RNAhybrid（https://bibiserv.cebitec.unibielefeld.de/rnahybrid/）、miRanda（/）和TargetScan（/fish_62/）軟件預測cid-miR-146a的靶基因。3個軟件預測到的共同靶基因作為靶向目標進行后續(xù)研究。1.8雙熒光素酶系統(tǒng)驗證cid-miR-146a的靶基因應用RNA22預測cid-miR-146a靶基因的靶位點，根據(jù)靶位點設計擴增靶基因片段的引物為pmirGLO-Flt1-F和pmirGLO-Flt1-R（表1）。RT-PCR總體積為50μL，包含ExTaq?酶25μL、pmirGLOFlt1-F2μL、pmirGLO-Flt1-R2μL、cDNA3μL、ddH2O18μL。PCR反應條件為95℃3min；95℃30s、55℃30s、72℃1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸5min。將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，進行亞克隆。通過菌落PCR（引物見表1）和測序進行驗證。將驗證正確的靶基因片段插入至雙熒光素酶啟動子pmirGLO載體上，構建pmirGLO-Flt1載體，并進行亞克隆。通過菌落PCR和測序進行驗證。將正確構建的pmirGLO-Flt1載體分別與cid-miR-146amimics、cid-miR-146ainhibitor和NC共轉染至GCO細胞，于20℃培養(yǎng)48h，檢測各組細胞熒光素酶活性。1.9生物信息學方法預測cid-miR-146a調控LCDV-cn感染的信號通路應用GO（/）和KEGG（https://www.genome.jp/kegg/）數(shù)據(jù)庫對cid-miR-146a可能參與的信號通路進行富集分析。2結果與分析2.1LCDV-cn感染GCO細胞的過程LCDV-cn感染GCO細胞后，呈現(xiàn)的細胞病變效應（cytopathiceffect,CPE）與文獻[2]一致。LCDVcn感染GCO細胞后3d，細胞聚集、呈現(xiàn)明顯的“疤痕”現(xiàn)象，“疤痕”一直持續(xù)到約感染后6d，6d之后細胞逐漸脫落、裂解，出現(xiàn)空洞（圖1）。圖1LCDV-cn感染GCO細胞Fig.1GCOcellschallengedwithLCDV-cn2.2感染用LCDV-cn懸液電鏡負染LCDV-cn以滴度濃度105.5TCID50/mL[19]進行后續(xù)感染實驗，感染用病毒懸液進行電鏡負染可看到病毒粒子（直徑約110nm）（圖2）。圖2感染用LCDV-cn懸液電鏡負染Fig.2ElectronmicroscopeofnegativestainingwithLCDV-cnsuspensionforinfection2.3cid-miR-146a的擴增電泳結果表明28S、18S和5SrRNA條帶完整清晰(圖3)，說明提取的樣品總RNA無降解，可用于后續(xù)實驗。頸環(huán)RT-PCR擴增后，電泳檢測表明獲得目的片段（圖4(a)）。經(jīng)菌落PCR（圖4(b)）和測序驗證獲得的片段是正確的，即為cid-miR-146a。cidmiR-146a的序列為5′-UGAGAACUGAAUUCCAU‐AGAUGG-3′（23bp），經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，cidmiR-146a與其他物種miR-146a同源（表2）。表2已知的miR-146a序列Table2KnownmiR-146asequences圖3提取的樣品總RNAFig.3ExtractedtotalRNAofsamples圖4cid-miR-146a頸環(huán)RT-PCR和菌落PCRFig.4Stem-loopRT-PCRandcolonyPCRofcid-miR-146a2.4cid-miR-146a在LCDV-cn感染GCO中的表達特性依據(jù)LCDV-cn感染GCO細胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象的變化特點，選取LCDV-cn感染后0、4、8、16、24、48、72、144和196h樣品，進行差異表達分析。由圖5可知，從0到72h，cid-miR-146a的表達量逐漸增加，144和196h時cid-miR-146a的表達量下降。圖5cid-miR-146a在LCDV-cn感染GCO過程中的表達Fig.5Expressionofcid-miR-146ainGCOcellsinfectedwithLCDV-cn2.5cid-miR-146a靶基因的預測RNAhybrid預測到cid-miR-146a的靶基因為Gimap8（GTP酶免疫相關蛋白8，GTPaseimmuneassociatedprotein8）、LEPR（瘦素受體，leptinreceptor）、Flt1（Fms相關酪氨酸激酶1，F(xiàn)ms-relatedtyrosinekinase1）和DLGAP5（Discs大同源相關蛋白5，Discslargehomologousaffinityprotein5），其總評分值分別為-0.41、-0.01、-0.32和-0.046（評分值為負數(shù)，靶基因的概率大）。miRanda預測到cid-miR-146a的靶基因為PDIA3（蛋白質二硫鍵異構酶A3,proteindisulfide-isomeraseA3）、irak1（細胞介素-1受體相關激酶-2）、LOX（賴氨酰氧化酶，lysyloxidase）和Flt1（Fms相關酪氨酸激酶1，F(xiàn)ms-relatedtyrosinekinase1），其總評分值分別為-0.013、-0.046、-0.19和-0.31。TargetScan預測到cid-miR-146a的靶基因為DIO-1（碘代甲狀腺氨酸脫碘酶1，iodothyroninedeiodinase1）、Flt1（Fms相關酪氨酸激酶1，F(xiàn)msrelatedtyrosinekinase1）和Gimap8（GTP酶免疫相關蛋白8，GTPaseimmune-associatedprotein8），其總評分值分別為-0.18、-0.32和-0.41。預測到的靶基因與癌癥和腫瘤發(fā)生、抗原呈遞和感染反應相關。此3個軟件均預測到Flt1是cid-miR-146a的靶基因，因此后續(xù)以Flt1為靶標開展實驗。應用RNA22預測到Flt1含有結合cid-miRNA-146a的位點（折疊能為-72.38kJ/mol，P值為0.353），F(xiàn)lt1與cid-miRNA-146a結合的位點序列為：5′-UACA‐AAAGGGAGGUUCAGUUCUC-3′（圖6），位于Flt1mRNA（GenBank編碼：XM_039667029）的280-302堿基（圖6）。圖6cid-miR-146a靶向Flt1基因的結合位點Fig.6BindingsitesofthegeneFlt1targetedwithcid-miR-146a2.6cid-miR-146a的靶基因Flt1驗證選取含靶位點的Flt1片段，其長度為456bp，位于Flt1mRNA的249-704堿基。經(jīng)RT-PCR擴增后將目的Flt1片段插入至pmirGLO載體，菌落PCR、XhoⅠ和SalⅠ雙酶切（圖7）和測序結果說明目的片段是正確的，成功構建pmirGLO-Flt1，并應用雙光素酶報告基因系統(tǒng)驗證靶基因。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測雙熒光素酶的活性結果顯示（圖8）：共轉染cid-miR-146amimics和pmirGLO-Flt1后，雙熒光素酶活性顯著下降，并與其它兩組（共轉染cid-miR-146ainhibitor或NC）差異顯著（P<0.05），表明Flt1確實是cid-miR-146a的靶基因。圖7pmirGLO-Flt1雙酶切Fig.7DoubleenzymedigestionofpmirGLO-Flt1圖8雙熒光素酶活性檢測Fig.8Detectionofluciferaseactivity2.7cid-miR-146a在上調下調GCO細胞中的表達量對cid-miR-146a進行上調下調后，定量PCR結果表明（圖9）：在cid-miR-146a上調和下調的GCO細胞中，cid-miR-146a的表達量與陽性對照組和陰性對照組中的表達量存在顯著差異（P圖9上調下調實驗中cid-miRNA-146a在GCO細胞的表達Fig.9Expressionofcid-miRNA-146ainGCOcellsfortheup-downregulationexperiment2.8cid-miR-146a對其靶基因Flt1的調控對cid-miR-146a進行上調下調后，靶基因Flt1定量PCR結果表明（圖10）：在cid-miR-146a上調組，F(xiàn)lt1的表達量最少，與其它組的表達量存在顯著差異（P<0.05）；在cid-miR-146a下調組，F(xiàn)lt1的表達量最多，與其它組的表達量存在顯著差異（P圖10GCO細胞中Flt1的表達Fig.10ExpressionofthegeneFlt1inGCOcells2.9cid-miRNA-146a對LCDV-cn復制的調控對cid-miR-146a進行上調下調后，LCDV-cnmcp基因定量PCR結果（mcp的表達代表LCDV-cn的復制）表明（圖11）：在cid-miR-146a上調組，mcp基因的表達量最多，峰值在72h，與其它組的表達量差異顯著（P<0.05）；在cid-miR-146a下調組，mcp基因的表達量最少，與其它組的表達量差異顯著（P圖11GCO細胞中mcp基因的表達Fig.11ExpressionofthemcpgeneinGCOcells2.10生物信息學預測cid-miR-146a在LCDV-cn感染過程中調控的信號通路應用GO和KEGG預測到cid-miR-146a調控的信號通路可能包括Toll樣受體（Toll-likereceptor）信號通路（P值為0.0056）、NF-кB（nuclearfactorκB）信號通路（P值為0.0094）和ErbB（receptortyrosinekinases）信號通路（P值為0.02667）等。Toll樣受體可識別病原體、快速激活先天免疫，NF-кB可調節(jié)涉及免疫、細胞存活等的基因，ErbB可調控細胞增殖、分化和存活等（https://www.genome.jp/kegg/）。3討論miRNA在病毒感染和腫瘤發(fā)生中起著重要的調控作用，miR-146a作為不同生物中比較保守的miRNA，已成為抗病毒感染和抗腫瘤等研究的熱點[9-18]。高通量測序表明在LCDV-cn感染GCO過程中，cid-miR-146a的表達存在顯著差異[19]，本研究以cid-miR-146a為目標miRNA，探索cid-miR-146a對其靶基因和LCDV-cn復制的調控作用。LCDV-cn感染GCO后的CPE現(xiàn)象呈現(xiàn)出“疤痕”和空洞，與Zhang等[2]的研究一致。在本研究中，LCDV-cn感染GCO后CPE現(xiàn)象的變化與cid-miR-146a的表達變化時間點呈正相關：在LCDV-cn感染GCO后，細胞聚集“疤痕”形成的過程（圖2），cidmiR-146a的表達一直上調（圖4）；細胞脫落、裂解、“疤痕”消失的過程（圖2），cid-miR-146a的表達下調（圖4）。總之，在LCDV-cn感染GCO細胞過程中，cid-miR-146a的表達先上升（3d前）后下降（6d后）。在病毒感染的不同時期，cid-miR-146a呈先上調后下調的表達模式，這在其它病毒感染中也得以發(fā)現(xiàn)，如，在HPV感染中，在感染的起始階段miR-146a表達上調，在感染后期miR-146a表達下調[13]。本研究表明cid-miR-146a靶向Fms相關酪氨酸激酶1(FLT1)的編碼區(qū)而發(fā)揮其調控作用。FLT1是血管內皮生長因子（VEGF）受體之一，F(xiàn)lt1廣泛表達于腫瘤細胞，與血管生成和腫瘤發(fā)生相關[24]。在本研究中，LCDV-cn感染后引起的淋巴囊腫病是一種皮膚瘤（可自愈），在較大的囊腫上有肉眼可見的紅色血管[25]，說明在LCDV-cn引起的皮膚瘤發(fā)展過程中確實存在著血管生成。研究表明在多種腫瘤中Flt1的表達異常，如，在神經(jīng)膠質瘤中Flt1的表達高度上調[24]、在頭頸鱗狀上皮細胞癌中Flt1選擇性上調表達[26]等。本研