枯草芽孢桿菌s9對番茄病害的拮抗作用

枯草芽孢桿菌s9對番茄病害的拮抗作用

病蟲害防治是病毒防治的重要方法之一。眾多的研究表明:利用有益的微生物菌制劑可以達(dá)到減輕或避免使用化學(xué)農(nóng)藥控制植物病害的危害。采用平板對峙法,是探尋對植物病原菌具有拮抗作用的微生物生防因子最初步的方法。本研究共分離了976株細(xì)菌分離物,發(fā)現(xiàn)來自甘蔗根圍的1株枯草芽孢桿菌S9對立枯絲核菌AG4、終極腐霉和尖孢鐮刀菌在PDA平板的對峙培養(yǎng)過程中不形成抑菌圈,但4d后可使上述植物病原真菌的菌絲溶解;盆栽或小區(qū)試驗證實了S9生物防治效果。本文報道有關(guān)研究結(jié)果。1材料和方法1.1t.viride菌株枯草芽孢桿菌(B.subtilis)S9抗利福平200μg/mL菌株:本實驗室菌株,來自甘蔗根圍;綠色木霉(T.viride):本實驗室菌株,來自番茄根圍;鮮紅毛殼菌(C.cupreum)和球毛殼菌(C.globosum):由泰國KMITL學(xué)院KasemSoytong博士提供;立枯絲核菌(R.solani)AG4,終極腐霉(P.ultimum)和西瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.nniveum):本實驗室菌株。1.2生長條件的確定取在PDA平板上培養(yǎng)3d的立枯絲核菌AG4、終極腐霉、西瓜枯萎病菌、綠色木霉、鮮紅毛殼菌和球毛殼菌的菌落邊緣圓片(直徑為6.0mm),分別將其移接到直徑為9.0cm的PDA平板中央,然后,在距平板中心點(diǎn)2.2cm處接上在KMB平板上生長48h的S9菌落圓片(直徑為6.0mm)2片,并使3個圓片保持在同一條直線上,28℃黑暗對峙培養(yǎng),每24h觀察真菌和S9的生長狀況(表1為培養(yǎng)4d的結(jié)果)。每處理設(shè)不接S9菌落圓片為對照,重復(fù)3皿。本試驗重復(fù)3次。1.3冷凍干燥sema從各對峙培養(yǎng)的平板中,切取與S9相接觸上述真菌菌絲的PDA瓊脂圓片(直徑為6.0mm),置于-20℃冰箱中迅速冷凍,然后在冷凍干燥器(VerTisCompany,Inc.,USA)中進(jìn)行真空冷凍干燥,溫控范圍為-42-15℃。將干燥后的樣品置于樣品臺上,用導(dǎo)電膠沾樣,離子鍍膜后在KYKY-1000掃描電子顯微鏡下觀察。1.4真菌生長試驗將上述真菌在300mLPDB液體培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)3～4d,使培養(yǎng)物含有0.20mg/mL真菌生物量,然后接入已在NA平板上生長24h的新鮮S9菌體,上述試驗重復(fù)3次,設(shè)對照。真菌菌絲的鮮重是通過過濾、擠壓去除多余培養(yǎng)液后所得的結(jié)果。1.5調(diào)查和研究方法供試的番茄(早豐番茄,西安市臨潼農(nóng)豐蔬菜良種繁育場)種子先經(jīng)1%的次氯酸鈉表面消毒3min,再用滅菌水漂洗3次,然后在滅菌條件下吸脹24h,倒掉滅菌水并再用新滅菌水漂洗3次,取出番茄種子,置于經(jīng)滅菌的濕濾紙上,滅菌條件下風(fēng)干備用。采用底部直徑為7cm,口部直徑為10cm,高為8cm,且底部有一直徑為2cm孔口的塑料盆缽,裝土前在水孔上疊塞3層經(jīng)滅菌的舊報紙,然后加入滅菌或自然土,使其深度達(dá)7.5cm,播種。播種前滅菌和自然土(為浙江大學(xué)華家池小粉土)都經(jīng)立枯絲核菌(R.solani)AG4麩皮接種物誘導(dǎo)處理,使其含200cfu/g土。處理加枯草芽孢桿菌S9(抗利福平200μg/mL菌株)使其接種密度為108cfu/g土。對照I(CKI)為清水對照,對照Ⅱ(CKⅡ)為不經(jīng)該細(xì)菌處理,但摻入50μg/mL多菌靈。每一處理和對照均設(shè)3個重復(fù),每一重復(fù)播入15粒種子,所有盆缽隨機(jī)排列,每天澆一次營養(yǎng)液[(NH4)2SO44.284g,(NH4)H2PO43.730g,K3PO4·3H2O1.438g,KNO30.546g,濃度為0.1%,N:P:K為19:7:4],保持土壤具有一定濕度,并注意通風(fēng)透光,觀察出苗數(shù),死苗數(shù),測定枯草芽孢桿菌S9和立枯絲核菌AG4消長情況,觀察記錄30d。為確證病苗是由本病原真菌引起,還須作重新分離鑒別。所有試驗數(shù)據(jù)都經(jīng)統(tǒng)計分析,按鄧肯氏新復(fù)極差法(Ducan’snewmultiple-rangetest)作多項比較。本試驗重復(fù)3次。2結(jié)果與分析2.1不同溶菌作用的西瓜枯菌回復(fù)突變試驗平板對峙培養(yǎng)表明,在PDA平板上與枯草芽孢桿菌S9培養(yǎng)4d的立枯絲核菌AG4、終極腐霉及西瓜枯萎病菌均產(chǎn)生不同程度的溶菌作用,其中對立枯絲核菌AG4作用特別明顯;而對植物病原拮抗真菌綠色木霉Ta、鮮紅毛殼菌和球毛殼菌的作用不明顯。切取與枯草芽孢桿菌S9培養(yǎng)4d的真菌菌絲交接處,光學(xué)顯微鏡檢查初步證實了上述結(jié)果(表1)。2.2溶菌作用的影響在光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)行,掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)S9對上述植物病原真菌具有不同程度的溶菌作用,而對植物病原拮抗真菌沒有影響,結(jié)果與PDA平板對峙培養(yǎng)結(jié)果相一致。圖1示S9對立枯絲核菌AG4的溶菌作用。其過程如下:S9首先吸附在AG4菌絲的表面,然后在菌絲表面形成溶菌斑,進(jìn)而通過消解的菌絲表面進(jìn)入菌絲內(nèi)部生長繁殖,最后S9在AG4菌絲體殘體中大量繁殖。2.3各細(xì)菌、不同生物量的生長試驗表明,在液體共培養(yǎng)測定中S9對植物病原真菌具有明顯的抑制作用。共培養(yǎng)120h后,可使尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌及終極腐霉的生物量降為0,而對拮抗真菌綠色木霉、鮮紅毛殼菌和球毛殼菌幾乎沒有影響。培養(yǎng)120h后,綠色木霉和球毛殼菌生物量仍有0.19mg/mL,鮮紅毛殼菌仍有0.17mg/mL(圖2)。2.4aga/agd對番茄根腐病的防治作用試驗表明,經(jīng)20d盆栽后,枯草芽孢桿菌S9可以在番茄根圍定殖,根部種群密度為5.8×107(cfu/g鮮根),并能夠顯著地防治由立枯絲核菌AG4引起的番茄根腐病(表2)。在自然土壤中,其防治效果可以達(dá)到82.3%,顯著高于50%多菌靈處理的對照;在滅菌土壤中,可以達(dá)到85.4%,也顯著高于50%多菌靈處理的對照(表3)。3枯草芽孢桿菌s9是一種特殊的計算成分,存在著一種平板對峙培養(yǎng)表明,在PDA平板上與枯草芽孢桿菌S9培養(yǎng)4d的立枯絲核菌AG4、終極腐霉及西瓜枯萎病菌均產(chǎn)生不同程度的溶菌作用,但沒有產(chǎn)生明顯的拮抗圈。以往的眾多研究報道指出,拮抗細(xì)菌的首次篩選都是通過平板上對病原菌抗生作用強(qiáng)弱作為標(biāo)志進(jìn)行的,并已得到了很有益的拮抗細(xì)菌制劑。由于不同的拮抗細(xì)菌具有不同的拮抗機(jī)制,因此必須謹(jǐn)慎對待,本研究正是提供這方面的啟示。掃描電鏡觀察表明,枯草芽孢桿菌S9是以某種方式緊貼或粘著在立枯絲核菌AG4菌絲上生長而生長的,這種生長的方式一旦建立是很難分開的,發(fā)生這種粘著可能存在化學(xué)物質(zhì)或物理的趨導(dǎo)。S9在溶解變薄的地方可以形成一個空洞而進(jìn)入菌絲之內(nèi),表明在該過程中細(xì)菌必須分泌一些酶類,但分泌哪幾類酶,是否與該真菌的細(xì)胞壁表面某種受體進(jìn)行互作還有待研究。細(xì)菌菌體進(jìn)入真菌的細(xì)胞后可使真菌細(xì)胞壁表面出現(xiàn)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化,我們認(rèn)為這是細(xì)菌進(jìn)一步在真菌細(xì)胞繁殖并分泌溶菌物質(zhì)的結(jié)果。提取S9溶菌物質(zhì)有著極為重要的研究價值。一方面枯草芽孢桿菌S9對植物病原真菌具有拮抗作用,盆栽