大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中外源蛋白的分離與純化

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中外源蛋白的分離與純化

自20世紀(jì)90年代以來，基因重組技術(shù)取得了很大進(jìn)展，越來越多的訂單細(xì)菌（或工程細(xì)胞）被建立。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌由于遺傳背景清楚,容易培養(yǎng)以及有大量可供選擇的克隆載體與表達(dá)載體,使之成為人們克隆表達(dá)外源基因的主要細(xì)菌。然而,在實(shí)踐過程中,一個(gè)十分棘手的問題是許多外源基因在大腸桿菌、酵母等表達(dá)體系中表達(dá)時(shí),往往以包涵體形式存在,高效表達(dá)的重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集,形成不溶的、無活性的固體顆粒。一般含有50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))以上的重組蛋白,其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白、環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA,以及脂體、脂多糖等,大小為0.5～1μm,具有很高的密度(約為1.3mg/ml),無定形,非水溶性,可溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。因此如何分離純化這些工程菌所表達(dá)的重組蛋白則是基因工程技術(shù)產(chǎn)業(yè)化所面臨的重要問題。這一工藝過程復(fù)雜,需要較高的技術(shù)和先進(jìn)的設(shè)備條件,且無固定模式可以借鑒,主要靠經(jīng)驗(yàn)和實(shí)踐摸索,具有很高的挑戰(zhàn)性。1在復(fù)合營(yíng)養(yǎng)方面的問題(1)表達(dá)量過高,研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體,表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快,以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊,二硫鍵不能正確配對(duì),過多蛋白間的非特異性結(jié)合,蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。(2)重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白,真核糖蛋白無法糖基化使中間體溶解度下降,導(dǎo)致不溶解包涵體形成。(3)重組蛋白分泌序列的存在阻礙折疊,導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊分子的產(chǎn)生。(4)重組蛋白的氨基酸組成,一般來說含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。(5)包涵體形成動(dòng)力學(xué)研究表明,包涵體是由部分變性的中間體聚合而成。因此,任何影響中間體穩(wěn)定的因素,如pH值(pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體)離子強(qiáng)度和溫度都可以引起蛋白聚合反應(yīng)。(6)在細(xì)菌分泌的某個(gè)階段,蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價(jià)鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。(7)有報(bào)道認(rèn)為,豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達(dá),當(dāng)培養(yǎng)條件不佳時(shí),容易形成包涵體。2蛋白水解酶的作用包涵體的形成具有有利的一面,也有不利的一面。有利的一面是包涵體的形成去除了幾乎全部的細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)。同時(shí),因包涵體形成避免了蛋白水解酶對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的降解而大大提高產(chǎn)率,通常其表達(dá)量可占菌體總蛋白的10%～30%,甚至高達(dá)50%。不利的一面是溶解包涵體進(jìn)行復(fù)性折疊的過程中需要加變性劑和去垢劑,而引起蛋白質(zhì)的不可逆修飾以及性質(zhì)改變,這些試劑價(jià)格昂貴,且復(fù)性的操作過程不好控制;另一方面復(fù)性過程常伴有蛋白質(zhì)水解和沉淀,有些還形成異構(gòu)體。因此復(fù)性是蛋白質(zhì)工程中最關(guān)鍵、最復(fù)雜的問題。包涵體的處理一般有如下幾個(gè)步聚。2.1單因素處理法分離可溶性蛋白提取包涵體時(shí),首先要裂解細(xì)菌,為了防止在裂解細(xì)菌的過程中目的蛋白質(zhì)變性,常常采取一些保護(hù)措施:合適的緩沖體系,如磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、檸檬酸緩沖液;加入保護(hù)劑,如還原劑DDT(2-巰基蘇糖醇)、2-巰基乙醇;加2.2洗滌包涵體洗滌包涵體前先8000r/min,4℃離心15min,可使大多數(shù)包涵體沉淀,與可溶性蛋白分離。為了除去包涵體上粘附的雜質(zhì),如膜蛋白或核酸,利用洗滌液洗滌包涵體沉淀,常用去污劑Tritonx-100或脫氧膽酸鈉和低濃度變性劑(如2mol/L尿素或鹽酸胍等)洗滌以除去脂類,但過高濃度的尿素或鹽酸胍會(huì)使包涵體溶解。2.3還原劑和尿素包涵體一般只溶于強(qiáng)的變性劑如尿素、鹽酸胍,它是通過離子間的相互作用,打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵,使多肽伸展,SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等去垢劑,可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵,溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。另外,對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì),分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑,如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇(DTT),常用濃度2～10mM。另外,尿素和鹽酸胍屬中強(qiáng)度變性劑,易經(jīng)透析和超濾除去。它們對(duì)包涵體氫鍵有較強(qiáng)的可逆性變性作用,所需濃度尿素6～8M,鹽酸胍5～7M。一般來講,鹽酸胍溶解力強(qiáng)于尿素,它能使尿素不能溶解的包涵體溶解,但缺點(diǎn)是容易使SDS電泳條帶變形。尿素的溶解度為70%～90%,其分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?；?特別是在堿性pH值下長(zhǎng)期保溫時(shí),但用尿素溶解具有不電離,呈中性,成本低,蛋白質(zhì)復(fù)性后除去尿素不會(huì)造成大量蛋白質(zhì)沉淀,以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點(diǎn),故目前已被廣泛采用。2.4復(fù)性中蛋白的復(fù)性過程由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學(xué)活性,加上劇烈的處理?xiàng)l件,使蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞,因此重組蛋白的復(fù)性特別必要。通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu),同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性開始,到2M左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言,從4M開始,到1.5M時(shí)復(fù)性過程結(jié)束。包涵體蛋白的復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,除與控制蛋白質(zhì)復(fù)性的過程相關(guān)外,還在很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān),有些蛋白非常容易復(fù)性,在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上,而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法,很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之幾,一般說來,蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。復(fù)性中常采用的方法有以下幾種:(1)稀釋復(fù)性法,直接加入水或緩沖液,放置過夜,缺點(diǎn)是體積增加較大,變性劑稀釋速度太快,不易控制。(2)透析復(fù)性法,好處是不增加體積,通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度,有人稱易形成沉淀,且不適合大規(guī)模操作,無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。(3)超濾復(fù)性,在生產(chǎn)中較多使用,規(guī)模較大,易于對(duì)透析速度進(jìn)行控制,缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況,且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆地變性。(4)柱上復(fù)性,是最近研究較多并成功地在生產(chǎn)中應(yīng)用的一種復(fù)性方法,常用于復(fù)性的層析方法有疏水層析(HIC)法、親和層析(AFC)法等。3新型設(shè)備在制劑中的應(yīng)用關(guān)于包涵體形成的具體因素一