大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用

大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用

原始梢表達(dá)系統(tǒng)和真實(shí)梢表達(dá)系統(tǒng)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。前者是最早被采用,也是目前研究最清楚的表達(dá)系統(tǒng),其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是外源基因表達(dá)的首選。真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾體系,表達(dá)的外源蛋白更接近于天然蛋白質(zhì)。因此,利用真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)目的蛋白越來(lái)越受到重視。在各種表達(dá)系統(tǒng)中,最早采用的是原核表達(dá)系統(tǒng),這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。該項(xiàng)技術(shù)主要是將已克隆入目的基因片斷的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌(一般是大腸桿菌),通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)、純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點(diǎn)是能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物,且所需的成本相對(duì)較低。大腸桿菌的遺傳背景清楚,又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特點(diǎn),成為外源基因的首選表達(dá)系統(tǒng)。1.1融合表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)的核心是表達(dá)載體。目前已知的大腸桿菌表達(dá)載體至少有以下幾種:非融合型表達(dá)、融合型表達(dá)、分泌型表達(dá)。若按啟動(dòng)子類(lèi)型分,目前廣泛使用的大多數(shù)質(zhì)粒表達(dá)載體主要是由λ噬菌體的PL啟動(dòng)子、大腸桿菌乳糖操縱子的lac啟動(dòng)子、色氨酸操縱子的trp啟動(dòng)子,以及pBR322質(zhì)粒的β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子等一批強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)成的。非融合型表達(dá)優(yōu)點(diǎn)在于:表達(dá)的非融合蛋白與天然狀態(tài)下存在的蛋白在結(jié)構(gòu)、功能以及免疫原性等方面基本一致,從而可以進(jìn)行后續(xù)研究。為了提高翻譯效率,人們?cè)谠O(shè)計(jì)表達(dá)載體時(shí)采用了許多辦法:優(yōu)化翻譯起始區(qū)以達(dá)到高效表達(dá)、構(gòu)建一套SD-AUG間隔不等的表達(dá)載體cassette,以供選擇利用。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí),使用“原核翻譯增強(qiáng)子”序列,以提高翻譯效率。鑒于野生型大腸桿菌基因多以多順?lè)醋有问絹?lái)組織,故采用雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體來(lái)獲得目的基因的表達(dá);將“原核翻譯增強(qiáng)子”和雙順?lè)醋咏Y(jié)合到一起,從而提高表達(dá)效率。融合表達(dá)載體通常SD-AUG已固定,翻譯起始信號(hào)組織合理,利于翻譯起始;簡(jiǎn)化蛋白分離純化工藝;可增強(qiáng)mRNA及表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性;有些蛋白質(zhì)融合表達(dá)產(chǎn)生可溶性蛋白。目前成功的融合表達(dá)系統(tǒng)主要有:①GST系統(tǒng):融合蛋白通過(guò)谷胱甘肽——agarose進(jìn)行親和純化后,用凝血酶或Xa-因子切除融合蛋白的GST部分,獲得目的蛋白。但是并非所有GST融合蛋白都是可溶的。切割后目的蛋白N端一般殘留兩個(gè)氨基酸,且切割效率不高。②β-半乳糖苷酶系統(tǒng):通過(guò)藍(lán)白斑篩選得到目的克隆,融合蛋白用氨基苯硫代半乳糖苷酶(TPEG)——Sepharose進(jìn)行親和純化。③麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)系統(tǒng):某些目的蛋白與MBP融合后可分泌到外周質(zhì)中,通過(guò)直鏈淀粉交聯(lián)纖維素親和層析分離純化。④金黃色葡萄球菌蛋白A系統(tǒng):通過(guò)IgG——Sepharose親和層析分離純化,融合蛋白由HIV-1蛋白酶切割。陳燕等將胰島素原基因融合到金黃色葡萄球菌蛋白A的基因上,構(gòu)建成大腸桿菌的融合外分泌表達(dá)載體;結(jié)果高效分泌表達(dá),能方便地從培養(yǎng)基中分離得到具天然結(jié)構(gòu)的胰島素原。⑤純化標(biāo)簽融合:如FLAG-tag和His-tag,甚至將GST、His置于同一個(gè)表達(dá)載體中,進(jìn)行雙標(biāo)簽表達(dá),檢測(cè)、純化更容易。⑥其他融合系統(tǒng),如硫氧還原蛋白等。1.2蛋白質(zhì)分離和代謝真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式一般可分為3類(lèi):細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá),即以包涵體形式存在;細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá);蛋白分泌型表達(dá)。包涵體的形成是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)最大的問(wèn)題,它是細(xì)菌表達(dá)的蛋白在胞內(nèi)相互凝集而形成的無(wú)活性固體顆粒,具很強(qiáng)的折光性。包涵體的形成是由于肽鏈折疊過(guò)程中部分折疊的中間態(tài)之間的特異性錯(cuò)誤聚合,致不形成成熟的天然或完全解鏈的蛋白。包涵體雖然利于分離純化,但是對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的活性不利。涉及包涵體形成的主要理化因素有:電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基的組分、半胱氨酸和脯氨酸的組分、親水性和氨基酸殘基的總數(shù)。為了克服包涵體的形成,常在表達(dá)外源基因的同時(shí),共表達(dá)分子伴侶和折疊酶。分子伴侶是細(xì)胞內(nèi)催化及維持其它蛋白質(zhì)正確構(gòu)象的一類(lèi)蛋白質(zhì)分子,能識(shí)別、結(jié)合并穩(wěn)定部分折疊的蛋白中間體,避免不適當(dāng)?shù)姆肿娱g及分子內(nèi)作用;而它本身卻不是最終形成的功能蛋白質(zhì)的組成部分。大腸桿菌細(xì)胞中存在三種具有廣泛特異性的伴侶復(fù)合物:一是由10kD的GroES與60kD的GroEL兩種熱休克蛋白(Hsp)組成的GroES/EL;二是由DnaK(Hsp70)與DnaJ、GrpE組成的伴侶復(fù)合物,新生肽鏈通過(guò)與DnaJ作用被DnaK識(shí)別,再與GrpE結(jié)合;第三種是Cip系統(tǒng)(CipA與CipX),它的作用可能是識(shí)別易被降解的未折疊肽。折疊酶是指那些催化蛋白質(zhì)特定異構(gòu)反應(yīng)的酶,限制蛋白質(zhì)折疊的速率。大量表達(dá)這些酶可以促進(jìn)重組蛋白在大腸桿菌中的正確折疊。大腸桿菌中研究最多的折疊酶是二硫鍵異構(gòu)酶DsbA(disulfateBindingProteinA),其功能依賴(lài)于膜蛋白DsbB。共表達(dá)有兩種方法:一是采用雙順?lè)醋踊蚨囗樂(lè)醋酉到y(tǒng),將不同基因連同各自的SD序列串連在一起,克隆在同一啟動(dòng)子下游;或?qū)⒉煌瑏喕谋磉_(dá)單元,包括各自的啟動(dòng)子、SD序列和結(jié)構(gòu)基因串連起來(lái)。另一種方法是將不同基因克隆到兩個(gè)相容表達(dá)載體中,通過(guò)共轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)不同亞基在同一宿主中的共表達(dá)。Caspers等人將酪氨酸激酶Csk、Fyn或Lck等與DnaK、DnaJ、GroES等共表達(dá),得到了可溶蛋白。此外,還可通過(guò)改變發(fā)酵條件,如降低發(fā)酵溫度、加入不能代謝的糖、降低培養(yǎng)基的pH值等來(lái)改善蛋白的溶解性。蛋白分泌型表達(dá)又可根據(jù)表達(dá)場(chǎng)所的不同分為周質(zhì)分泌表達(dá)和胞外分泌表達(dá)。所謂周質(zhì)是指在大腸桿菌一類(lèi)革蘭氏陰性細(xì)菌中,位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。在大腸桿菌中,已成功使用了各種不同類(lèi)型的信號(hào)肽,將細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì),如PhoA、OmpA、OmpT、LamB、β-內(nèi)酰胺酶、腸毒素ST-Ⅱ、LT-A、LT-B、金黃色葡萄球菌蛋白A、人生長(zhǎng)激素信號(hào)肽等。氧化性的周質(zhì)間隙可以模擬真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境,便于新生肽鏈折疊成天然結(jié)構(gòu),獲得具完全生物活性的重組蛋白。一些可被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解的蛋白質(zhì)在周質(zhì)中穩(wěn)定性提高。但周質(zhì)空間小,有時(shí)會(huì)發(fā)生二硫鍵的錯(cuò)配。胞外表達(dá)使重組蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化,便于大規(guī)模培養(yǎng)。目前使外源蛋白分泌到培養(yǎng)基的系統(tǒng)主要有α-溶血素(haemolysinA,HLyA)系統(tǒng)和大腸桿菌素釋放蛋白(bacteriocinreleaseprotein,BRP)系統(tǒng)。郭斯若等還報(bào)道了一種L-型細(xì)菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)。L-型細(xì)菌缺乏細(xì)胞壁,通過(guò)連接合適的信號(hào)肽,可以用于許多外源蛋白的可溶性、功能活性形式的分泌表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中。1.3外源基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及基因表達(dá)效率主要影響因素有:密碼子的使用、增強(qiáng)子的使用、mRNA的穩(wěn)定性及翻譯起始效率、啟動(dòng)子的選擇、載體選擇、蛋白酶的影響等。原核生物中,由于不同tRNA含量上的差異產(chǎn)生了對(duì)密碼子的偏愛(ài)性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn):AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC8種密碼子是大腸桿菌的稀有密碼子。蛋白翻譯過(guò)程中,如果稀少密碼子連續(xù)出現(xiàn),會(huì)抑制蛋白質(zhì)合成,發(fā)生密碼子錯(cuò)配。因此對(duì)含較高比例稀有密碼子的外源基因進(jìn)行表達(dá)時(shí),應(yīng)針對(duì)密碼子的偏愛(ài)性采取措施,如用非連續(xù)性多核苷酸定點(diǎn)突變方法對(duì)cDNA中稀有密碼子進(jìn)行同義突變,或提高某種氨基酸的tRNA濃度。GSrimivasan等報(bào)道Methanosarcinabarkeri甲胺轉(zhuǎn)甲基酶基因中UAG密碼子編碼了一個(gè)賴(lài)氨酸衍生物。故在重組蛋白表達(dá)時(shí)應(yīng)避免使用UAG作終止密碼子,防止轉(zhuǎn)錄過(guò)程的通讀。已知大腸桿菌格外偏愛(ài)終止密碼子UAA,尤其當(dāng)在其下游連上一個(gè)U而形成UAAU四聯(lián)核苷酸的情況下,轉(zhuǎn)譯終止的效率會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)。增強(qiáng)子是基因表達(dá)的重要調(diào)控元件,在原核細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似增強(qiáng)子序列,在一定程度上能提高大腸桿菌系統(tǒng)的表達(dá)效率。羅文新等用T7啟動(dòng)子和Ω序列對(duì)PET24(+)載體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)進(jìn)行改造,并通過(guò)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)來(lái)檢測(cè)表達(dá)效率,結(jié)構(gòu)表明Ω序列能顯著增強(qiáng)PET24(+)載體的表達(dá)效率。mRNA的穩(wěn)定性與外源蛋白的合成有很大關(guān)系,也是影響表達(dá)效率的重要因素之一。轉(zhuǎn)錄出的mRNA5′上游的SD序列與ATG間的堿基數(shù)和堿基組成對(duì)目的基因的翻譯效率很重要。有報(bào)道認(rèn)為,間距以6-11個(gè)堿基最好,堿基組成以C+G比例不超過(guò)50%為好。說(shuō)明SD序列與ATG間的距離適當(dāng),能更有效地促進(jìn)翻譯的效率。一般認(rèn)為,降低翻譯起始區(qū)(TIR)二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可以提高mRNA的穩(wěn)定性,利于外源基因的表達(dá)。沈蕓等通過(guò)改變?cè)休d體的TIR區(qū)的序列,成功構(gòu)建出了一個(gè)高效表達(dá)的載體。在大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)中,通過(guò)采用可誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子,多數(shù)情況下真核基因可得到有效的轉(zhuǎn)錄。目前構(gòu)建的表達(dá)載體一般都采用較強(qiáng)且易于誘導(dǎo)的啟動(dòng)子,如PL、Lac、Tac和T7啟動(dòng)子等。由于大腸桿菌防御系統(tǒng)的自身保護(hù)作用,細(xì)胞內(nèi)的重組基因和蛋白可能會(huì)被其核酸酶和蛋白酶降解,這種降解作用具有一定的專(zhuān)一性和選擇性。因此,闡明大腸桿菌中核酸酶和蛋白酶的作用規(guī)律,對(duì)mRNA和基因產(chǎn)物采取一定的保護(hù)措施,可以使一些原先不能在原核生物中表達(dá)的真核基因獲得表達(dá)。目前已發(fā)現(xiàn)了一些促進(jìn)mRNA穩(wěn)定性的序列,如ompA基因mRNA5′端非翻譯區(qū)末端的一段序列。有研究表明,大腸桿菌的重復(fù)性基因外回文序列能防止3′→5′外切酶的作用,進(jìn)而能穩(wěn)定mRNA并提高表達(dá)水平。另外,Invitrogen等公司都已經(jīng)開(kāi)發(fā)出蛋白酶缺陷型菌株,以減少外源蛋白被降解的可能,從而提高重組蛋白的表達(dá)水平。2原核及真核系統(tǒng)的翻譯后的化學(xué)計(jì)量特征雖然原核表達(dá)技術(shù)已十分成熟,且能在較短的時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物,但還存在許多難以克服的缺點(diǎn),如目的蛋白常以包涵體形式表達(dá),致使產(chǎn)物純化困難;原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善,表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低等。真核系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾體系,表達(dá)的外源蛋白更接近于天然蛋白質(zhì)。因此,利用真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)目的蛋白越來(lái)越受到重視。目前,基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。2.1甲醇酵母蛋白質(zhì)的代謝主要包括釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等表達(dá)系統(tǒng)。其中甲醇酵母基因表達(dá)系統(tǒng)是一種最近發(fā)展迅速的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng),也是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng),主要有H.polymorpha、CandidaBodinii、PichiaPastoris三種,其中PichiaPastoris作為基因表達(dá)系統(tǒng)使用得最多、最廣泛。由于它具有無(wú)可匹敵的高表達(dá)特性,已被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的工具之一。甲醇酵母的表達(dá)載體采用整合型質(zhì)粒。利用醇氧化酶(甲醇代謝的關(guān)鍵酶)基因-1(AOX1)的啟動(dòng)子(PAOX1)和轉(zhuǎn)錄終止子(3′AOX1)構(gòu)建成整合型表達(dá)載體。PAOX1是一個(gè)極強(qiáng)的啟動(dòng)子,醇氧化酶的產(chǎn)量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白質(zhì)的30%,所以能使外源蛋白質(zhì)在它的控制下高效產(chǎn)生。其次,在載體中加入釀酒酵母的分泌信號(hào)和前導(dǎo)肽序列(α因子)構(gòu)建分泌型載體,一方面可以減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷,另一方面可以減少宿主細(xì)胞蛋白水解酶對(duì)外源蛋白質(zhì)的降解,pPIC9K,pMETαA、B、C均為此類(lèi)載體。此外,還可使多拷貝目的基因整合入甲醇酵母染色體,形成多個(gè)表達(dá)單元,產(chǎn)生高產(chǎn)的菌株,此類(lèi)載體有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。在以葡萄糖或甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí),甲醇酵母中AOX1基因的表達(dá)受到抑制,而在以甲醇為唯一碳源時(shí),能誘導(dǎo)基因表達(dá),使外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量更高。受體菌采用蛋白水解酶缺陷型,從而大大減少產(chǎn)物的降解。常用的甲醇酵母受體菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。目前已有多種蛋白質(zhì)的基因在該表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)成功,包括蛋白酶、酶抑制劑、受體、單鏈抗體等。有多種蛋白質(zhì)在甲醇酵母中的產(chǎn)生水平均為在細(xì)菌、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物等表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)量的(10～100)倍。如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)在釀酒酵母中的產(chǎn)量為7.4mg/L,而在甲醇酵母中為450mg/L,提高了60倍。據(jù)報(bào)道,外源蛋白質(zhì)在甲醇酵母中的產(chǎn)量最高可達(dá)12g/L。國(guó)內(nèi)也有較多在甲醇酵母中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)成功的報(bào)道。相信隨著對(duì)甲醇酵母研究的進(jìn)一步深入,它在生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)方面將日益展示出誘人的前景。2.2外源基因調(diào)控蛋白表達(dá)的作用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國(guó)內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達(dá)。它具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能,如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等,使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白;其最高表達(dá)量可達(dá)昆蟲(chóng)細(xì)胞蛋白總量的50%;可表達(dá)非常大的外源性基因(～200kD);具有在同一個(gè)感染昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因的能力;對(duì)脊椎動(dòng)物是安全的。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高,至今已有很多外源基因在此蛋白的強(qiáng)大啟動(dòng)子作用下獲得高效表達(dá)。在病毒感染晚期,由于大量外源蛋白的表達(dá)引起昆蟲(chóng)細(xì)胞的裂解,胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)釋放出來(lái),與目的蛋白混在一起,從而使蛋白的純化變得困難。另外水解酶的釋放會(huì)降解重組蛋白。為了克服以上這些困難,Farrel等介紹了一種新型的鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)主要包括三個(gè)調(diào)節(jié)外源蛋白表達(dá)序列:①絲蛾Bombyxmori的肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子;②B.mori的核型多角體病毒(BmNPV)的ie-1基因(編碼IE-1蛋白,作為轉(zhuǎn)錄激活因子,在體外激活肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子);③BmNPV的同源重復(fù)序列3(HR3,可作為肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的增強(qiáng)子)。三者協(xié)同作用,從而大大地提高外源蛋白的表達(dá)水平。另外,一種新型的宿主范圍廣的雜合核多角體病毒(HyNPV)被應(yīng)用于昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建,該病毒由AcNPV及BmNPV發(fā)展而來(lái)。Lee等構(gòu)建了桿狀病毒-S2表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)能將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞,不會(huì)引起宿主細(xì)胞的裂解,且蛋白表達(dá)水平與鱗翅目細(xì)胞相似。因此,桿狀病毒-S2系統(tǒng)是一個(gè)很有應(yīng)用前景的昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。張志芳等研究發(fā)明了一種利用昆蟲(chóng)激素提高昆蟲(chóng)/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)效率的方法,包括應(yīng)用昆蟲(chóng)蛻皮激素(MH)、昆蟲(chóng)保幼激素(JH)及MH和JH的聯(lián)合使用以提高外源基因和多角體蛋白基因在昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效率,以及昆蟲(chóng)桿狀病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的復(fù)制效率。通過(guò)這種方法可以大大提高外源基因和多角體蛋白基因在昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效率,增加外源蛋白和多角體病毒粒子產(chǎn)量,節(jié)約生產(chǎn)成本。2.3誘導(dǎo)細(xì)胞外源基因表達(dá)由哺乳動(dòng)物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì),在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含原核序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號(hào)等。將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的方法主要有:一是感染性病毒顆粒感染宿主細(xì)胞,二是通過(guò)脂質(zhì)體法、顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法及DEAE-葡聚糖法等非病毒載體的方法。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因時(shí),一般不需要誘導(dǎo);但當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒害時(shí)應(yīng)采取誘導(dǎo)。誘導(dǎo)型載體主要與啟動(dòng)子有關(guān),如熱休克蛋白啟動(dòng)子可在高溫下被誘導(dǎo)。朱曉東等構(gòu)建了由四環(huán)素調(diào)控的增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)基因和乙肝病毒(HBV)前核心蛋白基因的表達(dá)載體,結(jié)果利用四環(huán)素誘導(dǎo)可有效地提高外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。外源蛋白的表達(dá)有時(shí)會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生不利影響,導(dǎo)致外源基因不能穩(wěn)定表達(dá)。Mielke等構(gòu)建了一種能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)異二聚體蛋白的載體系統(tǒng),無(wú)序繁瑣的