基因工程菌發(fā)酵制藥工藝

基因工程菌發(fā)酵制藥工藝現(xiàn)代生物技術(shù)制藥工藝生物技術(shù)制藥概論基因工程菌發(fā)酵制藥工藝動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝重組蛋白質(zhì)藥物分離、檢測與質(zhì)量控制基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)制藥工藝工程菌的種類與特征基因工程技術(shù)工程菌的構(gòu)建工程菌的分子與細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)工程菌發(fā)酵的動力學(xué)工程菌發(fā)酵的工藝與操作技術(shù)發(fā)酵過程檢測與控制技術(shù)基因工程菌：微生物為操作對象，通過基因工程技術(shù)獲得的表達(dá)外源基因或過量或抑制表達(dá)自身基因的工程生物體。發(fā)酵制藥:利用微生物生長和代謝活動生產(chǎn)藥物的過程，制藥微生物:細(xì)菌、放線菌等原核細(xì)胞生物和酵母、絲狀真菌等真核細(xì)胞生物。工程菌發(fā)酵制藥工程菌發(fā)酵制藥的基本工藝過程上游過程：（1）目標(biāo)基因的克隆，（2）表達(dá)載體的構(gòu)建，（3）工程菌的重組構(gòu)建與保存。下游過程：（1）菌種和生產(chǎn)用培養(yǎng)基的配制，（2）培養(yǎng)基、發(fā)酵罐和輔助設(shè)備的無菌化操作，（3）接菌與工程菌擴大繁殖培養(yǎng)，（4）最適條件下發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，（5）產(chǎn)物的提取、分離與純化，獲得合格產(chǎn)品。工程菌發(fā)酵制藥6.1基因工程菌的種類及特征大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)許多微生物在工業(yè)上通過發(fā)酵生產(chǎn)藥物，由于其遺傳背景、基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)等方面存在一定問題，并不是所有工業(yè)用微生物都可作為基因工程宿主菌而使用。宿主菌的生長發(fā)育及遺傳各有其特點，對營養(yǎng)、環(huán)境等生存因素的要求也不盡同。充分了解和深入研究宿主菌的特征，才能合理選擇，構(gòu)建出最佳的工程菌。工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)G－，單細(xì)胞，桿狀。裂殖，37℃17分鐘繁殖一代。白色至黃白色的菌落，光滑，直徑2－3mm。鞭毛，較長。無芽孢，一般無莢膜。一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌（Eschericliacoli）形態(tài)特征工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)能在僅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的無機鹽的極限培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵糖，產(chǎn)氣產(chǎn)酸?；蚬こ讨惺褂镁辏篕－12株的衍生菌株。基因組：4.6Mb，3000多種蛋白質(zhì)。染色體DNA為環(huán)狀雙鏈，核外遺傳物質(zhì)為質(zhì)粒。生化與遺傳特性工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)不溶性蛋白質(zhì)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成包涵體可溶性蛋白質(zhì)：存在于細(xì)胞質(zhì)周質(zhì)表達(dá):外源蛋白被運輸分泌到周質(zhì)，可溶性。有利分離和減少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。胞外分泌表達(dá)：胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)分泌到胞外的培養(yǎng)液中。通過對表達(dá)載體的改造，通常與分泌蛋白融合表達(dá)或與膜透性蛋白共表達(dá)，蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)液中。產(chǎn)物表達(dá)形式工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典的表達(dá)系統(tǒng)。大量外源基因能超量的表達(dá)，部分藥物上市。具有遺傳背景清楚、目標(biāo)基因表達(dá)水平高（高達(dá)70％），培養(yǎng)周期短，抗污染能力強。不用于加工修飾化（糖基化、酰胺化）蛋白表達(dá)。細(xì)胞死亡后，細(xì)胞壁脂多糖游離出來，形成內(nèi)毒素，具有抗原性，產(chǎn)生熱源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反應(yīng)。優(yōu)點和不足工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)G＋，單細(xì)胞，芽孢。桿狀，無莢膜。裂殖，31分鐘繁殖一代。有鞭毛。污白至微黃色的菌落，粗造，不透明，不閃光。二、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌（Bacillus）形態(tài)特征工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)革蘭氏陽性菌（a）與陰性菌(b)細(xì)胞區(qū)別工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)好氧發(fā)酵，水解淀粉，還原硝酸鹽，液化明膠?，F(xiàn)在至少10余種芽孢桿菌可作為宿主菌?？莶菅挎邨U菌的基因組：4.21Mb，有4100個開放閱讀框架。生長與遺傳特性工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)安全：不產(chǎn)生內(nèi)毒素；大多數(shù)對人畜無致病性；分泌功能強大：產(chǎn)物被加工和直接釋放胞外，很多商品酶是胞外蛋白；發(fā)酵后處理變得簡便，直接分離產(chǎn)物，提高產(chǎn)量。存在問題：對目標(biāo)產(chǎn)物進行降解：蛋白酶分泌量大、種類多。質(zhì)粒不穩(wěn)定性：有時在搖瓶階段就檢測不到了。優(yōu)點與不足工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)酶類：堿性蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶、青霉素酶、頭孢霉素酰化酶等都實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)。營養(yǎng)缺陷和抗生素突變株還能進行核苷藥物（肌苷、黃苷、尿苷等）、抗生素發(fā)酵。真核基因：人生長素、胃蛋白酶抑制劑、IFN、EGF、tPA、乙肝核心抗原等。應(yīng)用工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)鏈霉菌（Streptomyces）重要生產(chǎn)抗生素的工業(yè)微生物。放線菌產(chǎn)生的4000多種抗生素中，鏈霉菌產(chǎn)生的約占90％。鏈霉素、卡那霉素、林可霉素、氯霉素、紅霉素、螺旋霉素、四環(huán)類抗生素等。三、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)絲狀多核單細(xì)胞原核生物，G＋，能形成孢子。固體培養(yǎng)：基內(nèi)菌絲,氣生菌絲。當(dāng)營養(yǎng)耗竭時，激活孢子形成的條件，氣生菌絲成熟并分化成孢子菌絲，斷裂形成分生孢子。生長特性工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)基因組：約8.7Mb，7800個基因；染色體是線性，質(zhì)粒是線性的。遺傳特性工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)工業(yè)化成熟，有適合載體，就可用于大規(guī)模生產(chǎn)；絕大多數(shù)為非致病菌，不產(chǎn)生內(nèi)毒素；高密度培養(yǎng)，生長期長，穩(wěn)定期仍維持合成蛋白質(zhì)；產(chǎn)物分泌到胞外，分離純化較容易。前景：通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗生素是人們正追求的目標(biāo)。可用于次生代謝產(chǎn)物生物合成及其調(diào)控基因的表達(dá)，通過代謝工程，提高產(chǎn)量或生產(chǎn)新型雜合抗生素。優(yōu)點與不足工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)單細(xì)胞真核生物，球形、橢圓形、卵形或香腸形。芽殖、裂殖為主。在特定條件下才產(chǎn)生子囊孢子。在固體培養(yǎng)基上，菌落乳白色，有光澤，邊沿整齊。四、酵母表達(dá)系統(tǒng)形態(tài)特征工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)孢子萌發(fā)產(chǎn)生單倍體細(xì)胞，兩個性別不同單倍體細(xì)胞結(jié)合形成二倍體接合子或營養(yǎng)細(xì)胞，進行芽殖。能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖等。生長繁殖迅速，倍增期約2小時。釀酒酵母有17條染色體1996年完成其全基因組測序，遺傳背景相當(dāng)清楚?；蚪M：120.68Mb，閱讀開放開架5887個，編碼約6000個基因生長與遺傳特征工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)五種類型的載體，——安全、無毒。營養(yǎng)缺陷選擇外來質(zhì)粒。培養(yǎng)條件簡單、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成熟。亞細(xì)胞器分化，進行蛋白質(zhì)的翻譯后正確修飾和加工，并具有良好的蛋白質(zhì)分泌能力。缺點：釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，制約了高密度發(fā)酵。修飾的蛋白質(zhì)糖基化側(cè)鏈過長，會引起副作用。優(yōu)點與不足工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)1981年Hitzman等：酵母表達(dá)人干擾素Merck公司：乙肝疫苗，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的釀酒酵母表達(dá)的第一個基因工程疫苗Novo－Nordisk公司：人胰島素Immunex公司：人粒細(xì)胞集落刺激因子應(yīng)用工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)菌絲體分枝的真核細(xì)胞微生物，是非常重要的一類發(fā)酵和制藥工業(yè)微生物。工業(yè)酶：淀粉糖化酶、果膠酶、脂肪酶、半乳糖苷酶有機酸：馬來酸、乳酸、草酸、檸檬酸、氨基酸藥物：維生素、抗生素（青霉素、頭孢霉素、灰黃霉素等）、生物堿（麥角堿、圓弧菌素等）等五、絲狀真菌工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)在固體培養(yǎng)基上，形成基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，菌落圓形，較大而松疏，不透明，呈現(xiàn)絨毛狀、棉絮狀、網(wǎng)索狀等，產(chǎn)生色素，呈現(xiàn)各種顏色。孢子萌發(fā)形成菌絲，生長分枝形成初級菌絲體，不同性別菌絲體接合形成次級菌絲體，二倍體細(xì)胞。黑霉青霉形態(tài)與生長特征工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)用天然質(zhì)粒作為載體只成功了少數(shù)幾例。以細(xì)菌質(zhì)粒為基本結(jié)構(gòu)，插入真菌啟動子和選擇基因、功能基因構(gòu)建表達(dá)載體。已有多種真菌實現(xiàn)了DNA的轉(zhuǎn)化，建立了轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。黑曲霉和木霉表達(dá)凝乳酶、毛霉表達(dá)天門冬酰胺蛋白酶、米曲霉表達(dá)脂酶、淀粉酶和葡萄糖淀粉酶等。藥用蛋白質(zhì)表達(dá)宿主菌主要有構(gòu)巢曲霉系統(tǒng)，載體包括aclA啟動子、真菌分泌信號肽的公共序列和glaA終止序列，已實現(xiàn)了重組人細(xì)胞因子藥物的分泌表達(dá)。載體研究工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)（1）工業(yè)化發(fā)酵技術(shù)成熟，發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)量高；（2）米曲霉和黑曲霉是FDA和WHO認(rèn)定的安全生產(chǎn)菌，是優(yōu)先可接受的宿主菌；（3）分泌能力強，有利于分離純化下游工序；（4）蛋白質(zhì)的翻譯后的加工修飾，糖基化、二硫鍵形成及肽鏈的正確折疊等，表達(dá)出功能蛋白質(zhì)。缺點：許多基礎(chǔ)研究滯后，限制著其深入應(yīng)用?；虮磉_(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、載體、轉(zhuǎn)化、外源基因整合優(yōu)點與不足工程菌發(fā)酵制藥表達(dá)系統(tǒng)6.2基因工程技術(shù)概念：無性繁殖生成的遺傳均一的生物群體。個體克隆：植物細(xì)胞培養(yǎng)形成完整的植株，動物胚胎/體細(xì)胞的核移植，發(fā)育形成個體。細(xì)胞克?。河梢粋€細(xì)胞生成一群細(xì)胞即細(xì)胞群?；蚩寺。河缮倭浚▎慰截悾┗驍U增產(chǎn)生大量（高拷貝）基因。分子克隆策略：化學(xué)合成－已知序列（60－80bp）;生物合成（基因擴增）(已知部分或全部序列)；文庫篩選應(yīng)用：測序，功能研究，診斷與檢測，物質(zhì)生產(chǎn)…一、基因克?。–lone）PCR原理與技術(shù)1、原理1971年，Kleppe等首先描述了基因合成的基本原理PCR技術(shù)發(fā)明人：KaryMullis（Cetus公司）1983年，構(gòu)想DNA鏈的合成。1985年，Klenow片段擴增出哺乳動物單拷貝基因1993年，獲得諾貝爾化學(xué)獎。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：Polymerasechainreaction，PCR分子生物學(xué)技術(shù)，生物體外進行，擴增DNA片段。通常不超過10kb,特定方法擴增40kb左右。PCR原理：細(xì)胞內(nèi)的在DNA聚合酶催化下的DNA的復(fù)制過程，利用反復(fù)相同程序，DNA聚合酶在體外擴增特定的DNA片段。變性94℃退火55℃延伸72℃第1輪第2輪第3輪指數(shù)增加加熱方式：水加熱，空氣加熱，電熱絲加熱，半導(dǎo)體+電熱絲致冷方式：水致冷，空氣致冷，壓縮機致冷，半導(dǎo)體致冷溫控系統(tǒng)儀器構(gòu)造：三傳感器，雙區(qū)域溫度--溫度梯度樣品池傳感熱敏元件熱泵熱池2、PCR儀原理計算機芯片控制過程參數(shù)ThePCRJetfromMegaBasegivesfastPCRwithlargesamples.2、PCR儀，熱循環(huán)儀Morereactionsinthesamespacewith1,536wells3、操作過程PCR反應(yīng)的基本組分：DNA模板：含靶基因的DNA片段引物：1對人工合成的短寡核苷酸，18－25nt，決定擴增的起始和終止位置及擴增長度DNA聚合酶：作用是催化合成復(fù)制擴增的區(qū)域底物：4種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)，A、T、G、C緩沖體系:提供適合聚合酶行使功能的化學(xué)環(huán)境。石蠟油：防止蒸發(fā)；管蓋（可加熱）封閉反應(yīng)管PCR的條件與循環(huán)參數(shù)第1步：1個循環(huán)，94℃變性，1－5min。破壞氫鍵，雙鏈DNA解離,形成單鏈。第2步：25－40個循環(huán)，變性(94-96℃，1-2min)——退火（降低溫度使得引物結(jié)合到模板的特定序列上。55℃，1-2min)——延伸（DNA聚合酶由引物的3端開始，沿著DNA鏈合成新的互補鏈。72℃，1000bp/min)。第3步：強化延伸，72℃，7－13min第4步：終止反應(yīng)（4℃）PCR反應(yīng)在熱循環(huán)儀（PCR儀）中自動化進行。反應(yīng)控制：溫度的加熱或冷卻過程，關(guān)鍵是每步反應(yīng)溫度精確，升溫和降溫的時間控制。二、基因重組技術(shù)基因重組概念：在體外，將不同的基因通過切割、連接，重組形成雜合分子。插入到合適的載體分子上，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。隨著細(xì)胞的繁殖，基因得以真實復(fù)制擴增和表達(dá)。應(yīng)用：測序，修飾和改造基因，表達(dá)編碼產(chǎn)物。傳統(tǒng)的重組技術(shù)酶切反應(yīng)載體目標(biāo)基因可連接的末端連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化重組分子重組子1、DNA片段的酶切限制性內(nèi)切酶催化雙鏈DNA分子斷裂，形成相應(yīng)的片段。反應(yīng)體系組成：雙鏈DNA、限制性內(nèi)切酶、緩沖液組成反應(yīng)條件：一般在37℃反應(yīng)1小時。2、DNA片段的連接DNA連接酶催化兩條斷開的DNA雙鏈分子，形成3,5-磷酸二酯鍵，得到重組DNA分子。反應(yīng)體系組成：2個DNA片段（具有可連接的末端）、連接酶、緩沖液條件：一般在10－26℃下，反應(yīng)0.5-8小時3、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化；將重組DNA分子導(dǎo)入到宿主細(xì)胞的過程。Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化：重組分子與宿主細(xì)胞在CaCl2中混合，冰浴30min，42℃熱擊（90s），冷卻3min。轉(zhuǎn)染:利用噬菌體或病毒的感染，把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)。PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，電穿孔轉(zhuǎn)化,基因槍轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化等。4、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴增培養(yǎng)宿主細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化后立即進行短時間的培養(yǎng)，使細(xì)胞增殖達(dá)到一定數(shù)目，以利于篩選和鑒定。5、重組子的篩選與鑒定從混合體系中把期望重組子（只含有目標(biāo)基因的重組子）分離出來，去除其他非期望重組子和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。載體遺傳標(biāo)記篩選：抗生素抗性篩選，營養(yǎng)缺陷性篩選，α互補篩選，噬菌斑篩選目標(biāo)基因序列的檢測：菌落原位雜交，測序測定，產(chǎn)物檢測。6.3基因工程菌的構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體的設(shè)計表達(dá)載體的構(gòu)建工程菌的構(gòu)建表達(dá)載體：在質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，在多克隆位點處插入外源基因表達(dá)盒所構(gòu)成。外源基因表達(dá)盒：啟動子、功能基因和終止子組成。融合載體：在目標(biāo)基因的上游或下游設(shè)計運載蛋白基因、信號蛋白基因、寡肽標(biāo)簽，表達(dá)融合蛋白。增加溶解性和防止產(chǎn)物降解，定向分泌和親和純化。啟動子是最關(guān)鍵的元件，決定著表達(dá)的類型和產(chǎn)量。目標(biāo)基因終止子啟動子一、表達(dá)載體的設(shè)計表達(dá)載體結(jié)構(gòu)工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建lac啟動子：受cAMP激活蛋白（CAP）的正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控。CAP－cAMP復(fù)合物與操縱子結(jié)合后，促進了RNA聚合酶與啟動子結(jié)合，開啟基因轉(zhuǎn)錄。lacI形成四聚體，與操縱基因結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄起始IPTG等乳糖類似物是lac操縱子的誘導(dǎo)物IPTG與lacI結(jié)合，解除lacI的阻遏作用，激活基因轉(zhuǎn)錄。大腸桿菌系統(tǒng)的啟動子工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建最大程度誘導(dǎo)lac啟動子需要CAP參與，在缺乏葡萄糖時，CAP活性很高。因此，培養(yǎng)基不能使用葡萄糖作碳源。使用lacI溫度敏感突變體lacI(ts)、lacIq(ts)，可改變lac啟動子為溫度敏感型。在低溫（30℃）下抑制表達(dá)，高溫（42℃）下啟動基因表達(dá)。實現(xiàn)溫敏控制，而不使用IPTG。工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建tac啟動子、trc啟動子：僅受lacI調(diào)控，不受CAP調(diào)控，基因表達(dá)水平比lac啟動子更高。T7噬菌體啟動子：受T7RNA聚合酶高度調(diào)控的，比大腸桿菌RNA聚合酶高數(shù)倍。受lacI阻遏，被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。T7啟動子是目前基因表達(dá)水平最高的。優(yōu)點:T7RNA聚合酶只識別染色體外T7啟動子，持續(xù)合成，轉(zhuǎn)錄大腸桿菌RNA聚合酶不能有效轉(zhuǎn)錄基因。工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建PL、PR啟動子:受溫度敏感型阻遏物cIts857調(diào)控，在低溫（30℃）下阻遏物有活性，抑制轉(zhuǎn)錄，而高溫（42℃）下阻遏物失活，驅(qū)動轉(zhuǎn)錄。優(yōu)點：溫度誘導(dǎo)，成本低。對宿主菌有毒性的產(chǎn)物的表達(dá)非常有利。缺點：產(chǎn)物容易聚集形成包涵體。工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建融合色氨酸調(diào)控的cI基因PL啟動子和融合蛋白等，研究構(gòu)建了融合蛋白載體硫氧還蛋白融合系統(tǒng)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)半乳糖苷酶系統(tǒng)麥芽糖結(jié)合蛋白系統(tǒng)等

其他啟動子系統(tǒng)：工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建調(diào)控類型啟動子表達(dá)條件糖半乳糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng)mgl，阿拉伯糖基因araB葡萄糖抑制表達(dá)，巖藻糖、阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)無機磷堿性磷酸酶基因，甘油3磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)無機磷大于5mmol/L抑制表達(dá)，小于1mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)溶氧丙酮酸甲酸裂解酶基因,硝酸還原酶基因，血紅蛋白基因富氧時抑制表達(dá)，貧氧或微氧時激誘導(dǎo)表達(dá)pH賴氨酸脫羧酶基因cadApH>8抑制表達(dá)，pH<6誘導(dǎo)表達(dá)工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建二、表達(dá)載體構(gòu)建目標(biāo)基因的擴增——PCR反應(yīng)組成：引物，模板dNTPs，DNA聚合酶，緩沖液酶切與連接反應(yīng)：轉(zhuǎn)化：培養(yǎng)與篩選：工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建重組克隆的PCR快速鑒定篩選工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建酶切鑒定工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建三、工程菌的構(gòu)建對于一種表達(dá)載體，不是如何一種菌株都能對其進行有效表達(dá)。不同菌株表達(dá)能力不同，同一菌株的不同轉(zhuǎn)化細(xì)胞之間可能也存在差異。對宿主菌必需進行篩選。工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建不同誘導(dǎo)時間下的表達(dá)工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建蛋白質(zhì)存在形式分析包涵體表達(dá)工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建可溶性表達(dá)工程菌發(fā)酵制藥工程菌構(gòu)建工程菌發(fā)酵的物質(zhì)需求工程菌發(fā)酵的環(huán)境需求工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性6.3工程菌發(fā)酵制藥的分子與細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)碳源第一營養(yǎng)要素，其作用在于為正常生理活動和過程提供能量來源，也為細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的合成提供碳骨架。一、工程菌發(fā)酵的物質(zhì)需求工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)碳源種類:糖類、有機酸、脂類和蛋白質(zhì)類遲效碳源：酪蛋白水解產(chǎn)生的脂肪酸不同工程菌利用碳源的能力不同：大腸桿菌能利用蛋白胨、酵母粉等蛋白質(zhì)的降解物酵母只能利用葡萄糖、半乳糖等單糖類物質(zhì)真菌不僅可以利用單糖，還能利用多糖如淀粉等高濃度表現(xiàn)出底物抑制作用。葡萄糖優(yōu)先利用會造成培養(yǎng)基的酸化，在發(fā)酵控制中是一個值得注意的問題。工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)氮源為工程菌生長主要提供氮素來源氨基酸和蛋白質(zhì)、核苷和核酸及其他含氮物質(zhì)。可直接很好地吸收利用無機氮如氨水、銨鹽等一般不能利用硝態(tài)氮，缺乏把NO3－轉(zhuǎn)化成NH4＋的酶體系。幾乎都能利用有機氮源如蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、黃豆餅粉、尿素等。不同工程菌對氮源利用能力差異很大，具有很高選擇性。有機氮源利用程度與細(xì)胞是否產(chǎn)生分泌相應(yīng)降解酶有關(guān)。工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)無機鹽生長提供必需的礦物質(zhì)磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量元素鐵、銅、鋅、錳、鉬等微量元素的鹽離子水和其他營養(yǎng)物質(zhì)中的無機鹽成分足以滿足細(xì)胞的生長，一般情況下，在培養(yǎng)基中不單獨添加。磷調(diào)節(jié)微生物生長與生產(chǎn)。發(fā)酵培養(yǎng)中值得重視。工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)維持細(xì)胞生長所必需的微量有機物，不起碳源和氮源作用。維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分含有各種生長因子，一般在培養(yǎng)基中不單獨添加。生長因子工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)選擇劑工程菌往往是具有營養(yǎng)缺陷或攜帶選擇性標(biāo)記基因，這些特性保證了工程菌的純正性和質(zhì)粒的穩(wěn)定性。選擇標(biāo)記兩類：營養(yǎng)缺陷互補和抗生素抗性?？敲顾?、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等抗生素作為選擇劑工程酵母菌常用氨基酸營養(yǎng)缺陷型，亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、色氨酸等。工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)誘導(dǎo)表達(dá)型工程菌，在細(xì)胞生長到一定階段，必需添加誘導(dǎo)物，以解除目標(biāo)基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。使用Lac啟動子表達(dá)系統(tǒng)，基因表達(dá)階段需要IPTG誘導(dǎo)。甲基營養(yǎng)型酵母，加入甲醇進行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)物成為產(chǎn)物表達(dá)必不可少的?？股氐却紊a(chǎn)物發(fā)酵，添加前體和促進劑，提高產(chǎn)量。前體可以是產(chǎn)物的中間體，也可以是其中的一部分。促進產(chǎn)物生成的物質(zhì)為促進劑。誘導(dǎo)劑工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)二、工程菌發(fā)酵的環(huán)境需求溫度影響表現(xiàn)為三個基本點：最低溫度、最適溫度、最高溫度。低于最低溫度和高于最高溫度生物無法生長繁殖，甚至死亡，在最適溫度下，生長繁殖最快。嗜溫生物，生存溫度為10－50℃，最適溫度為25－45℃。大腸桿菌和酵母生長的最低溫度為10℃，大腸桿菌生長的最適溫度為37℃，最高溫度為45℃。酵母生長的最適溫度為30℃，最高溫度為40℃。工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)生長與發(fā)酵溫度不一致，不僅要考慮生長速率，還有考慮發(fā)酵速率、產(chǎn)物生成速率等因素。較高溫度表達(dá)包涵體，較低溫度下有利于表達(dá)可溶性蛋白質(zhì)。溫度誘導(dǎo)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，生長期維持37℃，生產(chǎn)期提高溫度42℃。對于熱敏感的蛋白質(zhì)，生產(chǎn)期可采用先高溫，然后低溫，變溫表達(dá)，避免蛋白質(zhì)降解。工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)溶解氧工程菌都是好氧微生物，生長過程需要大量分子氧作為氧化還原呼吸鏈的最終電子受體，與氫離子生成水。細(xì)胞內(nèi)的其他一些反應(yīng)也需要氧參與。無氧呼吸會導(dǎo)致大量的能量消耗，產(chǎn)生有機酸，對細(xì)胞生長極為不利，甚至有害。當(dāng)溶解氧水平過高，導(dǎo)致培養(yǎng)基過度氧化，細(xì)胞成分由于氧化而分解，不利于菌體生長代謝。發(fā)酵過程中保證充分的供氧顯得十分重要。工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)pH值細(xì)菌喜歡偏堿性環(huán)境。大腸桿菌適宜pH為6.5～7.5，放線菌適宜pH為7.0～8.0，高于9.0和低于4.5不能生長。真菌喜歡微酸性環(huán)境，絲狀真菌適宜pH為6.0～6.5，酵母適宜pH為5.0～6.0，高于10.0和低于3.0不能生長。發(fā)酵過程常常產(chǎn)酸，使環(huán)境pH不斷下降，所以生產(chǎn)中要采用有效措施控制pH的變化。工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)pH影響產(chǎn)物的穩(wěn)定性，不同菌種的最適生長pH和最適生產(chǎn)pH不同。干擾素：酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下容易降解。中性條件下干擾素的生產(chǎn)能力比弱酸性條件下有所下降，酸性環(huán)境（pH5.5）有利于發(fā)揮菌株生產(chǎn)能力。大腸桿菌在葡萄糖培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)生并積累乙酸，在供氧不足時更明顯。乙酸使菌體生長速率下降，乙酸抑制生長是非競爭性的，即使增加葡萄糖濃度也不能解除其抑制作用，乙酸也抑制基因表達(dá)，如抑制干擾素合成。工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)滲透壓環(huán)境滲透壓高于細(xì)胞滲透壓：細(xì)胞會失水，發(fā)生質(zhì)壁分離。環(huán)境滲透壓低于細(xì)胞滲透壓：引起細(xì)胞過度膨大而破裂。只有細(xì)胞與環(huán)境滲透壓相同，等滲狀態(tài)，才能正常生長。影響滲透壓:各種有機和無機物質(zhì)，糖和鹽類影響最大。工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)可見光和紫外線、X射線、γ射線、β射線等對菌生長往往沒有好處，反而會抑制其生長，甚至可起到殺傷作用。在培養(yǎng)期間要避光，并防止有外來輻射發(fā)生。光線工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)質(zhì)粒穩(wěn)定性：1）質(zhì)粒復(fù)制不穩(wěn)定性。不正常的起始和終止、延伸時斷裂及錯配等都會造成質(zhì)粒不穩(wěn)定性，并產(chǎn)生單鏈質(zhì)粒和高分子量畸型質(zhì)粒。2）質(zhì)粒分配不穩(wěn)定性。細(xì)胞分裂時，質(zhì)粒也分配，在子代細(xì)胞中分配不均一而導(dǎo)致部分細(xì)胞完全丟失質(zhì)粒。3）質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。質(zhì)粒中DNA的缺失、插入、變或重排等使質(zhì)粒DNA的序列結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，引起復(fù)制和表達(dá)的不穩(wěn)定性。4）培養(yǎng)環(huán)境條件引起的質(zhì)粒不穩(wěn)定性。基質(zhì)，溫度等。三、工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)隨著溫度升高，質(zhì)粒的穩(wěn)定性下降?；跍囟茸兓姆植竭B續(xù)培養(yǎng)：第一個反應(yīng)器，30℃生長培養(yǎng)，增加質(zhì)粒穩(wěn)定性，然后流入第二個反應(yīng)器，42℃誘導(dǎo)表達(dá)。溫度控制相當(dāng)重要：誘導(dǎo)時期和適宜的誘導(dǎo)溫度。1、培養(yǎng)條件對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響溫度對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響:工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)pH值對穩(wěn)定性的影響：需要設(shè)法控制pH在合適的范圍內(nèi)工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)氧溶解氧和攪拌對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響培養(yǎng)基質(zhì)對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響：培養(yǎng)操作方式對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響:質(zhì)粒穩(wěn)定性是質(zhì)粒、宿主菌與培養(yǎng)環(huán)境三者之間相互作用的結(jié)果，各種影響因素對不同宿主菌的作用不同。通過基因操作策略構(gòu)建高穩(wěn)定性的重組質(zhì)粒：重組缺陷菌株為受體菌。使用無轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒。使用par基因。優(yōu)化培養(yǎng)條件及過程控制而提高質(zhì)粒穩(wěn)定性：誘導(dǎo)性表達(dá)型質(zhì)粒，如溫度敏感和化學(xué)物質(zhì)刺激后，才合成目標(biāo)產(chǎn)物，把生長和生產(chǎn)階段分開。對于一定結(jié)構(gòu)質(zhì)粒，篩選適宜宿主菌，優(yōu)化培養(yǎng)條件與工藝，提高穩(wěn)定性，對基因工程藥物生產(chǎn)具有重要的意義。3、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的策略工程菌發(fā)酵制藥分子細(xì)胞基礎(chǔ)

工程菌生長的發(fā)酵模型批式操作的基本動力學(xué)過程影響動力學(xué)的因素質(zhì)粒穩(wěn)定性的動力學(xué)基質(zhì)利用、產(chǎn)物生成動力學(xué)6.5工程菌的發(fā)酵動力學(xué)

發(fā)酵動力學(xué):研究工程菌生長、基質(zhì)利用和產(chǎn)物生成之間的相互關(guān)系，為工程化控制提供依據(jù)。發(fā)酵體系：多相（氣液固）、多組分（基質(zhì)、代謝產(chǎn)物）、細(xì)胞變化（分裂、變異、死亡）的非線性系統(tǒng)。

工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)

一、工程菌生長的發(fā)酵模型模型I：細(xì)胞均一的非結(jié)構(gòu)模型。細(xì)胞之間、不同時期組成及代謝特性沒有差異，均衡生長模型，研究細(xì)胞群體生長代謝規(guī)律。模型Ⅱ：細(xì)胞均一的結(jié)構(gòu)模型。細(xì)胞之間無差異但細(xì)胞的組成不同模型Ⅲ：細(xì)胞非均一的非結(jié)構(gòu)模型。細(xì)胞之間有差異，但不考慮細(xì)胞內(nèi)部組成和結(jié)構(gòu)的差異。模型Ⅳ：離散結(jié)構(gòu)模型。細(xì)胞之間有差異不均一。細(xì)胞內(nèi)部組成多組分、結(jié)構(gòu)有差異，是細(xì)胞培養(yǎng)過程實際情況。

細(xì)胞非均一的結(jié)構(gòu)模型細(xì)胞均一的結(jié)構(gòu)模型細(xì)胞均一的非結(jié)構(gòu)模型細(xì)胞非均一非結(jié)構(gòu)模型細(xì)胞水平的結(jié)構(gòu)模型群體水平結(jié)構(gòu)模型工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)二、工程菌發(fā)酵培養(yǎng)的基本動力學(xué)過程把菌體生物量、基質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度等隨發(fā)酵時間的變化所作的曲線稱為動力學(xué)曲線。速率表示:單位時間內(nèi)某一參數(shù)的變化；比速率表示:單位細(xì)胞的生物量為基準(zhǔn)，表示該參數(shù)的變化速率。工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)以單位時間內(nèi)菌體濃度或質(zhì)量（X）的變化,生長速率r和比生長速率μ分別為：比生長速率是生長速率的標(biāo)準(zhǔn)化，反映了菌體活力的大小。r=dX/dtμ=(dX/dt)/(1/X)

菌體生物量與時間的關(guān)系是S形曲線。分為四個階段，即延滯期、指數(shù)生長期（對數(shù)生長期）、減速生長期、靜止期和衰亡期。工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)接種后，生物量沒有增加的一段時間。延滯期的長短是由菌體與環(huán)境相互作用的程度決定，不同接種量、不同菌種和菌齡等而表現(xiàn)不同。接種對數(shù)期的菌種，延滯期比其他階段都短，生產(chǎn)中用對數(shù)期進行放大和發(fā)酵生產(chǎn)。1.延滯期工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)2.對數(shù)生長期工程菌快速生長繁殖階段，生物量增加呈現(xiàn)對數(shù)速度增長。菌體生長速率與生物量是一級動力學(xué)關(guān)系：dX/dt=μmaxX

對數(shù)期比生長速率達(dá)到最大值，并保持不變。工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)生長速率下降的一段時間。原因：基質(zhì)濃度下降，有害物質(zhì)積累。生長速率與菌體濃度仍符合一級動力學(xué)關(guān)系。3.減速期工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)4.靜止期或穩(wěn)定期凈生長速率為零的一段時間。增殖與死亡同步進行，生長速率與死亡速率相等。dX/dt=(μ-kd)X=0目標(biāo)產(chǎn)物生成階段，進行補料，延長靜止期，提高產(chǎn)物。工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)4.衰亡期死亡速率大于生長速率的一段時間。死亡速率也符合一級動力學(xué)：dX/dt=-kdX分批發(fā)酵，大多數(shù)在衰亡期到來前結(jié)束發(fā)酵，進行放罐。工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)三、影響動力學(xué)的因素1.基質(zhì)濃度菌體生長過程，基質(zhì)逐漸被吸收利用，濃度呈現(xiàn)降低?；|(zhì)濃度的減少可用基質(zhì)消耗速率和比消耗速率表示：rs

=dS/dtqs

=(dS/dt)/(1/X)

比消耗速率表示基質(zhì)被利用的效率，可用于不同微生物之間的發(fā)酵效率的比較。工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)限制性基質(zhì)濃度與比生長速率的關(guān)系可用Monod方程表示：μ=μmaxS/(Ks+S)μmax意義：基質(zhì)對菌體的生長效率，用于不同基質(zhì)之間的比較。Ks意義：菌體對基質(zhì)的親和力，Ks越小，親和力越大，即越能被菌體良好利用。

S很低，Ks+S＝Ks，μ=μmaxS/Ks，濃度與比生長速率成正比。S很高，Ks+S＝S，μ=μmax，菌體以最大比生長速率進行生長。

工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)2.溫度隨溫度升高而速率增加，超過一定的溫度點后，隨溫度升高，速率迅速下降。細(xì)胞生長速率和比生長速率與溫度關(guān)系分別為：dX/dt=(μ-kd)X

μ=Aexp(-Eg/RT)3.pH值pH值對菌體生長速率的影響與溫度的影響類似工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)四、基因工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定性動力學(xué)根據(jù)重組基因亞細(xì)胞定位，工程菌分為兩類：1）不含有重組質(zhì)粒，外源基因被整合到宿主的基因組中，不存在外源基因的丟失等問題。這類工程菌發(fā)酵的動力學(xué)與非工程菌相似，可以不考慮細(xì)胞組分、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和個體之間的差異，用細(xì)胞均一的非結(jié)構(gòu)模型即均衡生長模型就能滿足此類工程菌生長的需求分析。工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)2）攜有重組質(zhì)粒，外源基因以重組質(zhì)粒的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，大多數(shù)工程菌屬于此類。這里討論重組質(zhì)粒類工程菌的發(fā)酵動力學(xué)過程。質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的變化和分配的不均一是質(zhì)粒不穩(wěn)定的根本原因。工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)發(fā)酵過程中質(zhì)粒失去功能，形成兩類細(xì)胞攜有質(zhì)粒的重組細(xì)胞：進行產(chǎn)物的表達(dá)，質(zhì)粒數(shù)目往往不相同，每個細(xì)胞的結(jié)構(gòu)是非均一的，細(xì)胞之間也存在差異。

無質(zhì)粒的宿主細(xì)胞：已有很多模型對質(zhì)粒穩(wěn)定性進行預(yù)測。首先建立假設(shè)，盡可能是符合實際。然后動力學(xué)計算，最后實驗驗證。工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)發(fā)酵過程中質(zhì)粒失去功能，形成兩類細(xì)胞，即攜有質(zhì)粒和無質(zhì)粒細(xì)胞。質(zhì)粒丟失率P，發(fā)酵過程中兩類細(xì)胞濃度的變化率分別為：-連續(xù)發(fā)酵，基質(zhì)濃度恒定，兩類細(xì)胞生長動力學(xué)方程：衡態(tài)發(fā)酵，重組細(xì)胞與宿主細(xì)胞比生長速率相等，即D＝μ+＝μ-。重組細(xì)胞逐漸減少，失去質(zhì)粒細(xì)胞逐漸增加工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)攜有質(zhì)粒細(xì)胞數(shù)目隨繁殖代數(shù)增加而減少，可用下列方程表示：Fn=[1-α-P]/[1-α-P2n(α+P-1)]這是非結(jié)構(gòu)模型。原則上講，任何一種重組微生物，只要滿足上述假設(shè)應(yīng)該能驗證該模型。在分批發(fā)酵培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件隨培養(yǎng)時間而發(fā)生變化，因此α和P常常是變數(shù)。工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)五、工程菌的基質(zhì)利用、產(chǎn)物生成的動力學(xué)(一)基質(zhì)利用的動力學(xué)在工程菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中，通過細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)把基質(zhì)轉(zhuǎn)化為四類物質(zhì)：（1）代謝產(chǎn)物，包括初級代謝產(chǎn)物及次生代謝產(chǎn)物；（2）胞外生物大分子；（3）生物量的細(xì)胞組成成分。（4）目標(biāo)產(chǎn)物：氨基酸、異源蛋白藥物等。

細(xì)胞內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)基質(zhì)代謝產(chǎn)物生物大分子產(chǎn)物生物量目標(biāo)產(chǎn)物工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)1.重組菌基質(zhì)消耗的動力學(xué)重組細(xì)胞消耗基質(zhì)用于生長、活性維持和產(chǎn)物生成三部分，而宿主細(xì)胞消耗基質(zhì)僅用于生長和活性維持二部分。分批發(fā)酵，重組細(xì)胞和宿主細(xì)胞的基質(zhì)消耗速率分別為：相應(yīng)地，比消耗速率分別為：工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)2.產(chǎn)物生成的動力學(xué)菌體生長、能源利用和產(chǎn)物生成速度的變化以及其之間的動力學(xué)關(guān)系出發(fā)，發(fā)酵過程可分為三種模型：I型：菌體生長與產(chǎn)物生成偶聯(lián)型。菌體生長與產(chǎn)物生成直接關(guān)聯(lián)，生長期與生產(chǎn)期是一致，產(chǎn)物是菌體能量代謝的結(jié)果，基質(zhì)初級分解代謝的直接產(chǎn)物。組成型表達(dá)的工程菌產(chǎn)物屬于此類型。菌體生長、基質(zhì)消耗、能源利用和產(chǎn)物生成動力學(xué)曲線幾乎平行，變化趨勢同步，都有最大值，出現(xiàn)的時間接近。工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)II型：生長與產(chǎn)物生成半偶聯(lián)介于偶聯(lián)和非偶聯(lián)模型之間，產(chǎn)物生成與基質(zhì)消耗、能量利用之間存在間接關(guān)系。在生長期期內(nèi)，無產(chǎn)物生成，在生長的中后期生成大量的產(chǎn)物，如氨基酸的發(fā)酵，一部分組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)藥物屬于此類型。工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)III型：生長與產(chǎn)物生成非偶聯(lián)型。產(chǎn)物降解：

生長期與產(chǎn)物生成期在獨立的兩個階段，先形成物質(zhì)消耗和生長高峰，然后菌體靜止期，產(chǎn)物大量生成，出現(xiàn)產(chǎn)物高峰。誘導(dǎo)型基因工程菌，往往在靜止期，加入誘導(dǎo)物，基因轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)物表達(dá)。工程菌發(fā)酵制藥動力學(xué)6.6工程菌發(fā)酵的工藝與操作技術(shù)發(fā)酵的基本過程培養(yǎng)基制備與質(zhì)量控制滅菌操作與技術(shù)一、工程菌發(fā)酵的基本過程三個基本階段：工程菌的鑒定與保存種子的擴大培養(yǎng)接種與發(fā)酵培養(yǎng)工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)（1）篩選單細(xì)胞克隆：（2）鑒定單細(xì)胞克?。海?）表達(dá)量篩選：（4）鑒定表達(dá)產(chǎn)物的正確性：（5）質(zhì)粒穩(wěn)定性試驗：（6）培養(yǎng)工藝優(yōu)化：1．基因工程菌的篩選鑒定與保存從大量被轉(zhuǎn)化的宿主菌中篩選出含有完整表達(dá)載體或外源基因、遺傳穩(wěn)定、高效表達(dá)出目標(biāo)產(chǎn)的重組菌?；蚍肿硬僮鳎l(fā)酵試驗，最終以發(fā)酵結(jié)果決定。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)低溫斜面保保存：液體石蠟密封保存：真空冷凍干燥保存：液氮超低溫保存：工程菌的保存對于已構(gòu)建好的工程菌要及時保存，避免優(yōu)良菌種的污染、變異、質(zhì)粒丟失甚至是死亡。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)種子培養(yǎng)擴大的次數(shù)主要是由種子罐級數(shù)決定。細(xì)菌生長快，種子用量比例少，種子罐次數(shù)相應(yīng)少。種子罐的級數(shù)越少，越有利于簡化工藝和控制，并可減少由于多次移種而帶來染菌的機會。2.工程菌種子的擴大培養(yǎng)將保存于試管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面或搖瓶進行活化后，再經(jīng)過種子罐發(fā)酵培養(yǎng)逐級擴大培養(yǎng)，而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)3.發(fā)酵培養(yǎng)將種子以一定的比例接入發(fā)酵罐，在適宜條件下培養(yǎng)。目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)的關(guān)鍵階段和工序。接種應(yīng)該注意：菌齡和接種量。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)按用途分：選擇性、鑒別性、富營養(yǎng)培養(yǎng)基等按物理性質(zhì)分為：固體，半固體、液體培養(yǎng)基按化學(xué)組成可分為：人工合成、半合成、天然培養(yǎng)基按發(fā)酵過程中所處位置和作用分為：斜面或平板固體培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基。二、培養(yǎng)基制備及其質(zhì)量控制技術(shù)1、培養(yǎng)基的種類工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)固體培養(yǎng)基：處于生產(chǎn)工藝流程的前端，作用是提供工程菌的生長繁殖，包括細(xì)菌和酵母的固體斜面或平板培養(yǎng)基，鏈霉菌和絲狀真菌孢子培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基添加0.8-1.5%的瓊脂粉制成固體培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：搖瓶和種子罐培養(yǎng)基,為液體。培養(yǎng)基成分必需完全，營養(yǎng)豐富，添加選擇劑和缺陷化合物等對生長和選擇必需的物質(zhì)。用速效性、容易被利用的碳、氮源和無機鹽等物質(zhì)，但濃度不宜高。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)發(fā)酵培養(yǎng)基：工程菌進行目標(biāo)產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)，不僅要滿足菌體的生長和繁殖，還要滿足菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物，是發(fā)酵生產(chǎn)中最關(guān)鍵和最重要的培養(yǎng)基。營養(yǎng)物質(zhì)濃度要高些，要添加選擇劑、特定的元素、前體和促進劑等對產(chǎn)物合成有利的物質(zhì)。補料培養(yǎng)基：間歇或連續(xù)補加各種必要的營養(yǎng)物質(zhì)，如碳源、氮源、前體等。補料培養(yǎng)基一般單一成分配制，發(fā)酵過程中各自獨立控制加入。或按一定比例制成符合補料培養(yǎng)基加入。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)控制水質(zhì)：水是培養(yǎng)基主要成分，恒定水源和恒定水質(zhì)很重要。主要參數(shù)包括pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度、各種礦物特別是重金屬的種類和含量。2、控制培養(yǎng)基的方法工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)來源與種類:玉米獎、淀粉等農(nóng)副產(chǎn)品和蛋白胨、酵母粉等，因品種、產(chǎn)地、加工、貯存條件不同而質(zhì)量差異較大?；瘜W(xué)原料如各種無機鹽類化合物，雜質(zhì)含量也不相同，純度對培養(yǎng)基的質(zhì)量也會造成影響。不同碳源、氮源對菌種生長的能力和產(chǎn)物的生產(chǎn)能力很不相同，對代謝產(chǎn)物的生成影響很大?？刂婆囵B(yǎng)基原料的質(zhì)量：工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)碳氮配比：原料對目標(biāo)基因表達(dá)載體調(diào)控原件的影響：lac啟動子，葡萄糖產(chǎn)生阻遏效應(yīng)，乳糖有誘導(dǎo)效應(yīng)。對trp啟動子，色氨酸有調(diào)控作用。葡萄糖為碳源時，代謝副產(chǎn)物較多。酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物合成與分泌。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)控制培養(yǎng)基的黏度：固體不溶性成分，淀粉、黃豆粉等增加培養(yǎng)基黏度，影響發(fā)酵的通氣攪拌等物理過程直接影響菌體對營養(yǎng)的利用目標(biāo)產(chǎn)物的分離提取造成困難高黏度的培養(yǎng)基，也不易徹底滅菌。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)控制滅菌操作：常用高壓蒸氣滅菌，但控制不當(dāng)，容易直接影響培養(yǎng)基的有效成分甚至是活性。較高溫度下長時間滅菌，營養(yǎng)成分會破壞，甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)。磷酸鹽與碳酸鈣、鎂鹽、銨鹽也能反應(yīng)，生成沉淀或絡(luò)合物，降低利用度。維生素、激素等在高溫下分解破壞、失活。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)制藥生產(chǎn)用培養(yǎng)基的確定原則：（1）無法從生化反應(yīng)原理來推斷和計算出最佳培養(yǎng)基配方，只能根據(jù)生理學(xué)和生物化學(xué)理論，參照前人所用的經(jīng)驗培養(yǎng)基，結(jié)合基因工程菌的特殊生物學(xué)和產(chǎn)品特征要求，進行大量細(xì)致和周密的試驗研究。（2）單因素試驗：研究碳源、氮源、無機元素、誘導(dǎo)物及其濃度等對菌體生長和生產(chǎn)能力的影響。（3）均勻設(shè)計和正交試驗等數(shù)理統(tǒng)計方法，優(yōu)化培養(yǎng)基的組成和濃度。（4）先搖瓶進行試驗，再小發(fā)酵罐試驗，逐級放大。在綜合考慮各種因素，產(chǎn)量、純度、成本等后，確定一個適宜的生產(chǎn)配方。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)雜菌：除生產(chǎn)菌以外的任何微生物。污染：感染雜菌的培養(yǎng)或發(fā)酵體系。污染的后果是嚴(yán)重，滅菌是控制雜菌的有效措施培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備及空間滅菌、通入空氣的凈化除菌消毒：殺滅或清除病原微生物，達(dá)到無害化程度，殺滅率99.9%以上。殺菌：殺滅或清除一切微生物，達(dá)到無活微生物存在的過程，殺滅率99.9999%以上。滅菌：微生物殺滅率99.999999%以上。三、滅菌操作與技術(shù)工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)化學(xué)滅菌：用化學(xué)物質(zhì)殺滅生物細(xì)胞的滅菌操作?；瘜W(xué)滅菌劑有氧化劑類如高錳酸鉀等，有機化合物如乙醇、甲醛等。皮膚表面、器具、實驗室和工廠的無菌區(qū)域的臺面、地面、墻壁及空間的滅菌。物理滅菌：各種物理條件如高溫、輻射、超聲波及過濾等進行滅菌。效果好，操作方便，廣泛使用。滅菌方法：工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)1、細(xì)胞高溫死亡動力學(xué)與滅菌的關(guān)系細(xì)胞受熱死亡的過程為一級動力學(xué)反應(yīng)：－dC/dt=kdC細(xì)胞濃度與時間成反比，細(xì)胞濃度越高，滅菌時間越長。

濕熱滅菌效果優(yōu)于干熱滅菌。以殺死芽孢的溫度和時間為指標(biāo)。確保徹底滅菌，實際操作中增加50％的保險系數(shù)。培養(yǎng)基pH、原料成分及泡沫對蒸汽滅菌效果有影響。高溫會使?fàn)I養(yǎng)成分受到一定程度破壞。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)2、培養(yǎng)基滅菌的操作方式分批滅菌操作又稱間歇滅菌：將制備好的培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，與設(shè)備一起滅菌的一種操作，也稱實罐滅菌。適合于中小型發(fā)酵罐。滅菌過程：加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫。每段對滅菌的貢獻，取決于升溫和降溫的時間長短，時間越長，貢獻越大。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)連續(xù)滅菌操作，高溫短時滅菌操作：加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個階段由不同的設(shè)備執(zhí)行。培養(yǎng)基不斷地從加熱升溫罐進入連消塔與高壓蒸汽直接混勻，達(dá)到滅菌溫度（130－140度）進入滅菌溫度維持罐;進入冷卻器;再轉(zhuǎn)入已滅菌發(fā)酵罐工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)3、介質(zhì)過濾滅菌操作技術(shù)不耐熱的成分及通入的空氣用過濾除滅，介質(zhì)過濾除菌。原理：空氣通過過濾介質(zhì)，顆粒在離心場產(chǎn)生沉降慣性碰撞產(chǎn)生摩擦黏附，顆粒布朗運動使微粒之間相互集聚成大顆粒，顆粒接觸介質(zhì)表面，直接被截留。靜電引力也有一定作用。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)提高空氣的潔凈度，除去顆粒：通過提高空氣吸入口的位置和加強過濾，粗過濾器。除去空氣中油和水：分級冷卻，使空氣冷卻到20℃～25℃。油和水凝結(jié)成油滴和水滴，在空氣貯罐內(nèi)沉降大液滴。旋風(fēng)分離器分離5μm以上的液滴，絲網(wǎng)除沫器分離5μm以下液滴。獲得無菌空氣：加熱提高空氣溫度達(dá)30－35℃，降低濕度。經(jīng)過總過濾器后，再在發(fā)酵罐前的分過濾器中進行除菌，進入發(fā)酵罐。工藝過程：三個主要工段。工程菌發(fā)酵制藥操作技術(shù)6.6工程菌發(fā)酵過程的檢測與控制技術(shù)

生物學(xué)參數(shù)的檢測與控制物理學(xué)參數(shù)的檢測與控制化學(xué)參數(shù)的檢測與控制產(chǎn)物誘導(dǎo)與發(fā)酵終點控制微生物發(fā)酵生產(chǎn)水平:取決于生產(chǎn)菌種性能，合適的環(huán)境條件。掌握菌種在發(fā)酵過程中的代謝變化規(guī)律和監(jiān)測手段，測定菌體濃度、糖、氮消耗及產(chǎn)物濃度，以及測定發(fā)酵罐中的培養(yǎng)溫度、pH、溶氧等參數(shù)的情況，并予以有效地控制，使生產(chǎn)菌種處于產(chǎn)物合成的優(yōu)化環(huán)境之中。工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制發(fā)酵過程的主要參數(shù)：物理參數(shù)化學(xué)參數(shù)生物學(xué)參數(shù)發(fā)酵過程各種參數(shù)處于不斷變化狀態(tài)以反映工程菌生長和產(chǎn)物形成的相關(guān)物理、化學(xué)和生物學(xué)參數(shù)為指標(biāo)，用設(shè)備外在的各種裝置進行檢測和監(jiān)測細(xì)胞代謝的變化，可以實現(xiàn)對發(fā)酵過程的控制。工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制1.細(xì)胞形態(tài)工程菌體的形態(tài)變化能反映代謝變化。顯微鏡檢測：用于種子質(zhì)量、區(qū)分發(fā)酵階段、控制代謝過程和發(fā)酵周期的參數(shù)。不同微生物的形態(tài)差別很大，形態(tài)檢測可發(fā)現(xiàn)是否污染，便于控制。一、生物學(xué)檢測主要的參數(shù)與控制工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制2．菌種真實性試驗在含有抗生素或營養(yǎng)缺陷的選擇性平板培養(yǎng)基和無選擇劑的培養(yǎng)基上生長，檢測細(xì)胞所含的質(zhì)粒數(shù)目和質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的變化，確保發(fā)酵生產(chǎn)過程中菌株的生化特性和質(zhì)粒的穩(wěn)定性。這個過程可與雜菌檢測同時進行。如果發(fā)酵生產(chǎn)周期短，可在發(fā)酵結(jié)束時取樣，檢測菌種和質(zhì)粒穩(wěn)定性，以控制產(chǎn)物的質(zhì)量。工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制3.細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度：單位體積發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)菌體細(xì)胞的含量，可用干重或鮮重表示，對于單細(xì)胞工程菌也可以用細(xì)胞數(shù)目表示。通過活細(xì)胞平板稀釋培養(yǎng)或染色后計數(shù)，總細(xì)胞數(shù)可用計數(shù)器測定。根據(jù)菌體濃度決定適宜地補料量、供氧量等，以得到最佳生產(chǎn)水平。工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制菌體濃度與生長速率有密切關(guān)系：比生長速率大菌種，菌體濃度增長迅速，反之緩慢。在一定濃度范圍內(nèi)，比生長速率隨著菌體濃度增加而增加.超過上限后，濃度增加會引起比生長速率下降，即前饋抑制.工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制菌體濃度影響產(chǎn)物形成速率：在適宜的比生長速率下，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率與菌體濃度成正比關(guān)系。菌體濃度過高，營養(yǎng)消耗過快，有毒物質(zhì)積累。臨界濃度：攝氧速率與氧傳遞速率平衡時的菌體濃度,是菌體遺傳特性與發(fā)酵罐氧傳質(zhì)特性的綜合反映。發(fā)酵過程中要把菌體濃度控制在適宜的范圍之內(nèi)，采用中間補料、控制CO2和O2量來實現(xiàn)。不同菌種和產(chǎn)品，其控制方法也不盡相同。工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制4.發(fā)酵污染雜菌的檢測與控制種子污染培養(yǎng)基滅菌不徹底空氣帶菌設(shè)備及其附件滲漏工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制二、物理參數(shù)的檢測與控制溫度壓力攪拌培養(yǎng)基粘度通氣量流加速率工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制1.溫度的檢測與控制測定：由熱電阻等熱敏原件測定，溫度計上讀出。發(fā)酵溫度：產(chǎn)能因素和失能因素的共同作用產(chǎn)生熱：生物熱和攪拌熱散失熱：蒸發(fā)熱、顯熱和輻射熱。發(fā)酵熱是隨時間而變化，引起發(fā)酵溫度波動。對數(shù)期的生物熱可作為發(fā)酵熱平衡的主要依據(jù)。工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制1）選擇最適溫度并嚴(yán)格控制，以期高產(chǎn)。2）生長階段選擇適宜的菌體生長溫度，生產(chǎn)階段選擇最適宜的產(chǎn)物生產(chǎn)溫度，進行變溫控制下的發(fā)酵。3）隨溫度升高而目標(biāo)產(chǎn)物的降解加強，產(chǎn)物的降解酶對溫度更敏感，而較高溫起激活作用，降低溫度抑制降解是優(yōu)先考慮的措施。4）兩段變溫發(fā)酵培養(yǎng)就是一種比較理想的控制模式。前期：較高溫度發(fā)酵，獲得足夠高的菌體密度；后期：低溫培養(yǎng)發(fā)酵，對菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物的能力的抑制不明顯，但可有效抑制目標(biāo)產(chǎn)物的降解，總體提高工程菌的生產(chǎn)能力。

工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制2.壓力的檢測與控制檢測：罐壓是指罐體內(nèi)的壓力，由壓力表讀出。罐壓的影響：CO2和O2的溶解度，增加罐壓，氣體的溶解度提高壓力影響工程菌生長，不同生物對壓力耐受不同?？刂乒迚?調(diào)節(jié)進或出口閥門，改變進入或排出氣體或空氣流量，維持工藝所需壓力。工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制3.攪拌的檢測與控制攪拌的影響：氣體的傳遞速度和發(fā)酵液的混合均勻程度攪拌指標(biāo)：攪拌轉(zhuǎn)速和攪拌功率。增加攪拌轉(zhuǎn)速將提高溶氧系數(shù)。過度攪拌轉(zhuǎn)速對菌體產(chǎn)生機械剪切。攪拌控制：發(fā)酵中不同階段對氧需求進行調(diào)節(jié)。工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制4.通氣的檢測與控制檢測：通氣量來表征。通氣影響供氧、廢氣的排出及其他傳遞過程。通氣量的調(diào)節(jié)：通過閥門的開閉實現(xiàn)。5.其他參數(shù)的檢測與控制表觀黏度：黏度越高，對氧等氣體的傳遞阻力越大。發(fā)酵液的黏度反映了細(xì)胞生長狀態(tài)或形態(tài)，隨著菌體濃度增加，黏度增加，溶解氧降低，CO2擴散困難。補料流加速率：控制流體進料的參數(shù)，用每分鐘流入的體積表示。

工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制三、化學(xué)參數(shù)的檢測與控制基質(zhì)濃度pH溶解氧尾氣泡沫補料誘導(dǎo)表達(dá)與終點工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制1.基質(zhì)濃度的檢測與控制基質(zhì)濃度：發(fā)酵液中糖、氮、磷等發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，可采用相關(guān)方法進行在線或離線檢測。碳源控制：經(jīng)驗方法和動力學(xué)方法，通過補料控制。代謝類型確定補料時間、數(shù)量和方式。動力學(xué)方法：菌體比生長速率、糖比消耗速率、產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率等參數(shù)控制。工程菌發(fā)酵制藥檢測與控制氮源控制：補加有機氮源，如酵母粉、玉米漿、尿素等。補加無機氮源：氨水和硫酸銨。無機氮