核酸理化性質(zhì)講義

核算理化性質(zhì)-講義目錄一般物理性質(zhì)；核酸的紫外吸收；變性；復(fù)性；雜交；教學(xué)目的：了解核酸的一般物理性質(zhì)及DNA序列的測定方法，掌握核酸的紫外吸收特性、變性和復(fù)性及核酸的分離、提純和定量測定。教學(xué)重點：核酸的紫外吸收及變性和復(fù)性；教學(xué)難點：核酸的變性和復(fù)性一般物理性質(zhì)1.1形態(tài)圖DNA——白色纖維狀固體圖 RNA——白色粉末狀固體1.2溶解性微溶于水；不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有機溶劑；用乙醇可以沉淀核酸。RNA核蛋白體（RNP）易溶于0.14mol/LNaCl溶液；DNP可溶于1~2mol/L的NaCl溶液；RNA在堿性溶液中不穩(wěn)定；DNA在堿性溶液中穩(wěn)定。顯色反應(yīng)：利用核糖和脫氧核糖不同的顯色反應(yīng)鑒定DNA與RNA。核糖與地衣酚（3,5-二羥甲苯）試劑反應(yīng)呈鮮綠色。脫氧核糖與二苯胺試劑反應(yīng)生成藍色化合物，而核糖無此反應(yīng)。1.3粘度圖DNA溶液粘度極高（因其分子直徑小而長度大）圖 RNA溶液粘度要小得多 ★核酸變性或降解后，粘度降低1.4兩性解離圖概念：核酸為兩性電解質(zhì)，因核苷酸含有磷酸基與堿基，磷酸基和堿基可以解離，在不同pH條件下解離程度不同，在一定條件下可形成兼性離子，表現(xiàn)為兩性離子狀態(tài)，通常表現(xiàn)為酸性。效果：由于磷酸基團的酸性很強，所以pI（等電點）較低，整個分子相當于多元酸。應(yīng)用：利用核酸的兩性解離可以通過調(diào)節(jié)核酸溶液的pH來沉淀核酸，也可通過電泳分離純化核酸。紫外吸收性質(zhì)2.1機理：嘌吟和嘧啶具有共軛雙鍵，能強烈吸收紫外光。2.2性質(zhì)1：在260nm處有最大吸收峰。對于純的DNA或RNA，可以通過測得A260來推測其核酸含量。A260/A280值可以反映核酸的純度。性質(zhì)2：純的DNA：A260/A280=1.8 純的RNA：A260/A280=2.02.3.定義：增色效應(yīng)（hyperchromiceffect）是變性后DNA溶液的紫外吸收作用增強的效應(yīng)。原因：DNA分子對紫外光的吸收峰在260nm。DNA分子中堿基間電子的相互作用是紫外吸收的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，但雙螺旋結(jié)構(gòu)有序堆積的堿基又“束縛”了這種作用。變性DNA的雙鏈解開，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故產(chǎn)生增色效應(yīng)。

差異：不同來源DNA的變化不一，如大腸桿菌DNA經(jīng)熱變性后，其260nm的光密度值可增加40%以上，其它不同來源的DNA溶液的增值范圍多在20~30%之間。影響：變性后DNA在260nm下的紫外吸收光密度的觀測值通常較變性前有明顯增加。核酸復(fù)性后，光吸收值又回復(fù)到原有水平（減色效應(yīng)）。2.4測定核酸和核苷酸的紫外吸收的意義：★測定核酸在細胞和組織中的分布★測定核酸或嘌吟、嘧啶衍生物或核酸在純?nèi)芤褐械臐舛惹疤崾侵类岩?、嘧啶衍生物的摩爾吸光系?shù)K（在一定pH下是常數(shù)）A（吸收值）=K（吸光系數(shù)）b（溶液厚度）c（溶液濃度）堿基的光吸收值受pH影響，所以測定時要注意一定的pH條件。核算的變性3.1.變性denaturation的概念核酸在某些物理或化學(xué)因素的作用下，雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起理化性質(zhì)的改變（A260值升高、粘度下降、沉降系數(shù)加快、……）及生物活性的降低或喪失?！锔鶕?jù)變性因素區(qū)分為堿變性、熱變性等。如DNA的堿變性、DNA的熱變性，其中以DNA的熱變性更具典型意義。3.2引起變性的因素物理因素：熱（熱變性）；紫外、輻射等；化學(xué)因素：過酸（酸變性）；過堿（堿變性）；有機溶劑；尿素 原因：使氫鍵斷裂，破壞堿基堆集力，從而引起核酸二級結(jié)構(gòu)的破壞。3.3熱變性曲線（熔解曲線）DNA的熱變性是個突變過程，類似結(jié)晶的熔解。在DNA發(fā)生熱變性的過程中，A260隨溫度的變化曲線。——解曲線不同DNA的熔解曲線不同，但很類似。都是——S形曲線2.4Tm值：將紫外吸收的增加量達到最大增量一半時的溫度稱熔解溫度 （meltingtemperature,Tm）。★影響Tm的因素（1） G-C比：G-C的相對含量，值高Tm高，已知Tm,依據(jù)經(jīng)驗公式求G-C的含量或Tm值。（G+C）%=（Tm—69.3）X2.44（2） 均一性：質(zhì)DNA（polyA-T）或（polyG-C）熔鏈溫度發(fā)生在一個較小的范圍內(nèi)，異質(zhì)DNA熔鏈溫度發(fā)生在一個較寬的范圍內(nèi)。：（3） 溶液離子強度：（4）溶液的pH：（5）變性劑：核酸的復(fù)性4.1復(fù)性：變性核酸的互補鏈在適當條件下重新締合成雙螺旋的過程。將熱變性的DNA驟然降溫，不能復(fù)性形成無規(guī)則線團，如緩慢降溫，可以復(fù)性，叫退火。4.2影響復(fù)性速度的因素：單鏈片段的濃度，濃度越高，復(fù)性越快；單鏈片段的大小，片段越大,擴散慢，錯配頻率高，復(fù)性越慢；片段內(nèi)重復(fù)序列的多少,片段內(nèi)重復(fù)序列的多，復(fù)性快；溶液一定的離子強度，能消除磷酸基負電荷造成的斥力，可加快復(fù)性速度。4.3復(fù)性過程用二級反應(yīng)動力學(xué)公式處理：dCCo1+Cot-Co1+Cot-kdt0Cot曲線：在核酸復(fù)性研究過程中，確定一定的溫度、離子強度、核酸片段大小等條件下，以C/Co對Cot作圖，可以得到Cot曲線。在一定條件下復(fù)性的速度可用Cot班來衡量，Co為完全變性時的初始濃度，以核苷酸的摩爾濃度表示，t為時間（s），Cot1/2表示復(fù)性一半的Cot值5核酸的分子雜交核酸分子雜交技術(shù)是目前分子生物學(xué)中應(yīng)用很廣的技術(shù)，它可以鑒定核酸分子之間的同源性，是分子克隆技術(shù)的重要組成部分。5.1分子雜交（簡稱雜交，hybridization）是應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì)，使兩條來源不同的具有一定同源性（即具有堿基互補關(guān)系）的DNA單鏈分子或DNA單鏈分子與RNA分子經(jīng)退火形成雙鏈DNA分子或DNA-RNA異質(zhì)雙鏈分子（heteroduplex）的過程。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間，也可在RNA與DNA鏈之間形成。雜交首先透過加熱或堿處理使雙螺旋解開成為單鏈，然后在一定條件下使互補核酸鏈實現(xiàn)復(fù)性。5.2雜交技術(shù)簡介southern:用DNA作為探針雜交DNA。檢測目標DNA的存在與否northern:用DNA或