水華中藍(lán)藻的分離與鑒定

水華中藍(lán)藻的分離與鑒定

1研究背景1.1水華主要毒素水生鳥類包括原核藻類和真核藻類，廣泛分布于淡水和海水中，包括形成赤潮的生物，以及湖泊和沼澤中的蘭藻。這些生物產(chǎn)生的毒素往往是次生代謝產(chǎn)物,種類繁多,包括肝毒素(Hepatotoxins),神經(jīng)毒素(Neurotoxins)和皮炎毒素(Dermatoxins),其中淡水水華產(chǎn)生的最主要的兩種毒素為微囊藻毒素(Microcystin)和節(jié)球藻毒素(Nodularins),其毒性作用的位點(diǎn)是抑制蛋白磷酸酶活性,從而影響細(xì)胞功能,因此對公共衛(wèi)生、人體安全和動物安全造成了極大的威脅。據(jù)調(diào)查,生長在藍(lán)藻水華多發(fā)區(qū)的人群,其肝癌的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他區(qū)域,在巴西由于藍(lán)藻毒素甚至發(fā)生過嚴(yán)重的死亡事件。因此,有關(guān)水華藻類的研究引起了全球的廣泛關(guān)注和重視,包括我國在內(nèi)的各國政府現(xiàn)在啟動了一些重要的研究計(jì)劃,用于研究與藍(lán)藻有關(guān)的水體安全,藍(lán)藻產(chǎn)毒機(jī)制,藍(lán)藻控制技術(shù)和污染水體修復(fù)等項(xiàng)目,有力地促進(jìn)了水華藻類的研究工作。1.2天然水體中藻絲體的形態(tài)和種類的單一性以及4個領(lǐng)作為水華藻類研究的第一步,水體中藍(lán)藻的鑒定和分離一直是研究的一個重點(diǎn)。傳統(tǒng)的藻類學(xué)鑒定方法是通過形態(tài)學(xué)的觀察來劃分的,這需要大量細(xì)致的工作,時間要求長。一般的形態(tài)學(xué)從色素,色素體,貯藏物質(zhì)等的差別來辨別不同種的藻類細(xì)胞,這是一件費(fèi)時費(fèi)力的事,而且不同的種屬差別很細(xì)微,非長期從事該工作的專業(yè)人員難勝任這項(xiàng)工作,并且藻的形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果顯示,環(huán)境對藻類的形態(tài)有很大的影響,鑒定出具體的種存在的困難較多,如在節(jié)旋藻和螺旋藻的分類中,藻絲體形態(tài)多種多樣,隨著培養(yǎng)條件的變化而變化,另外,要實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)方法的鑒定,往往需要分離培養(yǎng)純的藻株,根據(jù)生活史對其進(jìn)行鑒定。而有些天然水體中的藻種的純系培養(yǎng)不能保證完全可以存活,因此有時也限制了鑒定的進(jìn)行。為此需要從分子上找出直接的證據(jù)以鑒別不同的藻類,從而保證結(jié)果的可靠性。1.3pcr和16srrna基因序列的擴(kuò)增和測序分子生物學(xué)方法由于其操作容易和結(jié)果直接可靠被廣泛應(yīng)用在環(huán)境微生物群體的測定和鑒別上,其工作原理如圖1所示。實(shí)際上,這種方法不單單適用于水生環(huán)境,在許多的研究領(lǐng)域,如土壤、冰、藍(lán)藻結(jié)皮,生物膜甚至于血液中都可以應(yīng)用。分子生物學(xué)方法應(yīng)用于生物類別和活性研究之所以應(yīng)用廣泛而且對于微生物研究具有革命性是因?yàn)樗梢栽跓o需培養(yǎng)未知微生物的條件下提供很好的信息,而培養(yǎng)未知微生物在常規(guī)研究中存在許多問題,而且常常有完全不能成功的危險。許多分子方法都涉及PCR技術(shù)。PCR利用引物(核苷酸順序需要特殊設(shè)計(jì))作為DNA復(fù)制的起點(diǎn),如果操作得當(dāng),結(jié)果就是感興趣核苷酸片斷的擴(kuò)增產(chǎn)物,通過簡單的凝膠電泳就可分離產(chǎn)物。選擇不同的基因用于擴(kuò)增取決于需要解決的問題。在原核生物研究中,應(yīng)用于鑒定工作最廣泛的是16SrRNA基因。把復(fù)雜環(huán)境中的DNA分離出來,利用不同的通用引物(如大概定位于基因的保守區(qū))去擴(kuò)增混合的16SrRNA已經(jīng)成為常規(guī)的做法。在這個基礎(chǔ)平臺上,許多有關(guān)的工作都可以開展,如利用足跡法來估計(jì)生物的種類,分析擴(kuò)增基因的序列,定量樣品中基因的數(shù)目等等。隨著測序費(fèi)用的下降和網(wǎng)上提供的免費(fèi)生物信息學(xué)資源和建樹資源的增多,測序工作變得越來越容易,從而使得分子鑒定被廣泛應(yīng)用在各個領(lǐng)域,如藻種的鑒定、產(chǎn)毒藻株的鑒別、水體生物演替等研究方面?，F(xiàn)就相關(guān)工作介紹如下。2srrna基因序列及測序?qū)λ{(lán)藻分子鑒定和表型鑒定的作用rRNA存在于所有的細(xì)菌中,功能穩(wěn)定,因此常用于系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建,絕大部分細(xì)菌rRNA基因以16SrRNA-23SrRNA-5SrRNA的順序操縱子的形式存在于細(xì)菌基因組中,每一種rRNA基因被ITS(InternallyTranscribedspacers)隔開,16SrRNA和23SrRNA之間的ITS序列長度和組成變化多樣,既可以只含有tRNAGlu或tRNAAla的編碼序列,也可以同時包含tRNAGlu和tRNAAla基因編碼序列。5SrRNA一級和二級結(jié)構(gòu)簡單,因此在許多細(xì)菌上率先得以測序,并建立了5SrRNA序列的數(shù)據(jù)庫,但在藍(lán)藻中很少有通過5SrRNA基因的測序建立系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系或鑒定藻的種類。隨著大量的DNA測序工作的進(jìn)行,許多16SrRNA基因的序列得以測出,這就能通過選擇合適的引物,直接從細(xì)菌基因組中擴(kuò)增出相應(yīng)的rRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系及分子鑒定的研究。16SrRNA在原核生物中相對的高保守性和廣泛存在性使其成為研究不同原核生物相互關(guān)系的最佳方法,也能利用這個特點(diǎn)做藍(lán)藻的分子鑒定。根據(jù)16SrRNA的特點(diǎn),已經(jīng)有一系列通用引物設(shè)計(jì)出來用以擴(kuò)增16SrRNA基因片段,但屬以下不能用這種方法區(qū)分。同時位于16SrRNA和23SrRNA之間的ITS區(qū)由于其特點(diǎn),不但能區(qū)分屬,而且屬以下的類別也能被區(qū)分開來。利用rRNA基因的特點(diǎn)能對藍(lán)藻從分子水平上進(jìn)行較為系統(tǒng)的分類和鑒定研究。利用16SrRNA區(qū)分出了波羅的海中節(jié)球藻屬(Nodularia)中形態(tài)上有差異的兩簇(Cluster),即:無毒性和偽空泡的節(jié)球藻和具毒性和偽空泡的節(jié)球藻。Moffitt等通過比較21種節(jié)球藻16SrRNA基因序列,也得到了相似的結(jié)果,并通過16SrRNA基因序列的比較,設(shè)計(jì)出了產(chǎn)節(jié)球藻毒素的株系的特異性引物,從而能通過PCR擴(kuò)增區(qū)分出產(chǎn)毒藻株和非產(chǎn)毒的節(jié)球藻。在卷曲魚腥藻(Anabaenacircinalis)中的研究也表明利用16SrRNA基因測序結(jié)果而生成的進(jìn)化樹也可用來區(qū)分產(chǎn)貝毒素和不產(chǎn)貝毒素兩類,以上研究可區(qū)分表型明顯的屬間種,如產(chǎn)毒和不產(chǎn)毒的種,從系統(tǒng)進(jìn)化樹上看,在劃分到一組的一些種之間的差別很小,可能不能用這種方法區(qū)分,柱孢藻屬(Cylindrospermum)內(nèi)7個藻株的16SrRNA基因的序列測定相似形達(dá)到了>99.8%,對5個平裂藻(Merismopedia)的16SrRNA基因測序,其相似程度在96%—97%,更加說明了這一點(diǎn)。單純利用16SrRNA基因鑒定屬內(nèi)所有種帶來難度,但區(qū)分屬以上該方法有巨大的優(yōu)越性。從魚腥藻PCC7120(AnabaenaPCC7120)中設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增16SrRNA和23SrRNA基因間的ITS區(qū),得到了兩種形式的ITS序列,但其中一種似乎是另一種序列的一部分,比較這兩種序列和已知的ITS序列,推導(dǎo)出了ITS的保守區(qū)和變化區(qū),能利用這來設(shè)計(jì)引物或寡核苷酸探針在不同的分類水平上鑒定藍(lán)藻的種類,該方法已經(jīng)成功的應(yīng)用于將微囊藻屬(Microcystis)劃分為三個簇,從而更加精細(xì)的描述了屬以下的相互關(guān)系,也為藻種更細(xì)致的分子鑒定提供了基礎(chǔ)。通過ropC1基因的擴(kuò)增和測序也可區(qū)分出不同種,但不能鑒定出不同的株系,從而進(jìn)一步通過序列比對建立了一對特異的PCR引物對,用該基因建立的進(jìn)化樹STRR技術(shù)建立起來的進(jìn)化樹相似。對淡水藻類的DNA序列知之甚少,需要對數(shù)據(jù)庫查找,以找出保守的位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物來開展工作?？赏ㄟ^對標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物的PCR擴(kuò)增和測序來作為分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn),取自然條件下的水樣來擴(kuò)增,利用擴(kuò)增產(chǎn)物的序列和標(biāo)準(zhǔn)比較就可以了。引物設(shè)計(jì)在許多文獻(xiàn)中都有提及,可利用已知的引物或利用登陸的序列再設(shè)計(jì)引物,這是比較簡單的事。3功能蛋白基因編碼蛋白的基因也可用來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,但由于這些基因存在的主要目的是其編碼的蛋白質(zhì)在生物中所起的生理功能,因此只要蛋白質(zhì)的組成,或更進(jìn)一步,蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域不發(fā)生變化,他們的就不會被淘汰。由于兼并密碼子的存在,可能使這些功能蛋白的基因核苷酸水平上發(fā)生一點(diǎn)變化,也不會影響到蛋白質(zhì)的組成和其正常的生理功能,因此即使是在保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中,核苷酸水平在不同的藻種中也可能不同。這和rRNA基因由于在生命活動中需要的是它們特異的二級結(jié)構(gòu),因此核苷酸的組成在特定的區(qū)域不發(fā)生變化的情況大大不同。因此,功能性蛋白的基因能被用于進(jìn)行更精細(xì)的藻種鑒定,在藍(lán)藻中已報道的幾種用于分子鑒定的蛋白質(zhì)基因包括藻藍(lán)蛋白基因,DNA依賴的RNA聚合酶基因ropC1,和特定毒素合成有關(guān)的基因,和異形胞形成有關(guān)的基因。后兩種在環(huán)境監(jiān)測中有重要的意義。3.1藍(lán)藻多系的pcr擴(kuò)增鑒定PC是在藍(lán)藻門,紅藻門及隱藻門光合系統(tǒng)Ⅱ中天線色素分子之一。其中藍(lán)藻在淡水藻類中是最常見的,藍(lán)藻中整個PC操縱子編碼兩個藻膽色素亞基β和α(分別定義為cpcB和cpcA)以及3個連接多態(tài),cpcB和cpcA之間的基因間隔區(qū)(IntergenicSpacer,IGS)是一個高變區(qū),可用作藍(lán)藻株系的鑒定。利用PC的IGS序列的長度就能準(zhǔn)確地預(yù)測來自水樣中藍(lán)藻的屬,PCR產(chǎn)物的測序能區(qū)分不同的藻種;利用PC的IGS序列能區(qū)分開巴西微囊藻的15個種,已報道的一個例外是對14種澳大利亞泡沫節(jié)球藻的cpcBA-IGS的測序結(jié)果沒有差異,但用RAPD擴(kuò)增出現(xiàn)了多態(tài)性。3.2專一性引物的設(shè)計(jì)ropC1編碼RNA聚合酶的γ亞基,在基因組中以單拷貝的形式存在,ropC1被認(rèn)為是一個更能體現(xiàn)差異的基因,通過ropC1基因的擴(kuò)增和測序可區(qū)分不同的藻,在利用柱孢藻(Cylindrospermopsisraciborskii)的ropC1的測序結(jié)果的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)了一對柱孢藻專一性引物,從而能專一性的擴(kuò)增這種柱孢藻。在卷曲魚腥藻(Anabaenacircinalis)的研究中也有類似的報道,而且專一性的擴(kuò)增可簡化為直接采用水樣。3.3全細(xì)胞pcr技術(shù)有關(guān)用分子方法鑒定有毒藻類的文章數(shù)目在近年里劇增。在微囊藻毒素合成基因簇發(fā)表以前,雖然有一些分子起點(diǎn)的鑒定有毒藻類的研究進(jìn)行,但取得的結(jié)果不盡理想。最近,隨著發(fā)表的微囊藻毒素合成基因mcy所提供的專一性目標(biāo)的出現(xiàn),有力地促進(jìn)這方面的工作。這些序列被全球的研究者應(yīng)用于設(shè)計(jì)和構(gòu)建基于PCR方法的毒素基因檢測。由于PCR的擴(kuò)增使得這個方法極其靈敏。隨著測序和毒素合成途徑基因的發(fā)表,分子方法會很快用于這些基因的檢測。在這個研究領(lǐng)域,我國的研究人員開發(fā)出一種利用全細(xì)胞PCR技術(shù)進(jìn)行鑒別有毒微囊藻株系的方法,通過它不但可以快速準(zhǔn)確地對實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物進(jìn)行鑒別,而且對自然水體中的微囊藻進(jìn)行鑒別,因此對水體的安全評價有著重要的意義。而在其它有毒藻類研究領(lǐng)域,現(xiàn)在已經(jīng)有與節(jié)球藻毒素和柱孢藻毒素合成有關(guān)的基因的檢測也有報道,可以預(yù)見,相關(guān)的分子鑒定會很快開展起來。3.4其他基因中其他基因以上是幾種常用于藻類鑒定中的基因,它們在藍(lán)藻中廣泛存在,同時還有一部分基因,如和固氮有關(guān)的基因nifH,以及形成偽空泡的基因gvp,它們雖然只在一部分藍(lán)藻中存在,但在實(shí)際研究中如水華形成的機(jī)理,水體中毒素的監(jiān)測中同樣具有重要的意義。4根據(jù)pcr，不同的海藻類型被鑒定為多態(tài)性4.1pcr測序進(jìn)行測序的原因多利用PCR擴(kuò)增rDNA,rDNA-ITS,及PC-IGS的序列,所得到的序列酶切后檢查片段長度的多態(tài)性(即RFLP技術(shù)),也可用于藻種的鑒定。但這種檢驗(yàn)實(shí)際上也是利用了擴(kuò)增后的序列差異,只是不需要對PCR的產(chǎn)物進(jìn)行測序,而只需要進(jìn)行一個或多個酶切反應(yīng),這就會使不同的序列酶切的多態(tài)性可能差別極大,有的序列甚至找不到酶切位點(diǎn),為藻的分子鑒定帶來困難。由于rRNA基因在生物界廣泛存在,因此可以利用保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增幾乎所有原核生物的基因組產(chǎn)生相應(yīng)的條帶,甚至能利用起源于細(xì)菌的植物葉綠體中擴(kuò)增測序的結(jié)果推斷植物之間的相互關(guān)系。而且由于前面做了相當(dāng)多的工作,因此在GENEBANK中也累積了相當(dāng)多的序列信息,使人們在對序列的處理上更得心應(yīng)手。PC等藍(lán)藻特有的基因只能在藍(lán)藻或藍(lán)藻中特有的種之間利用,一方面限制了鑒定的范圍但同時也提高了鑒定的準(zhǔn)確性和特異性。4.2rapd擴(kuò)增法通過RAPD技術(shù),鑒定出浮游植物Chattanella不同種的差別。該方法的好處是隨機(jī)的從全基因組中擴(kuò)增部分序列,不需要設(shè)計(jì)特異的引物,可直接購買公司的引物產(chǎn)品做實(shí)驗(yàn),有多個引物可供選擇;由于藍(lán)藻中存在長串聯(lián)重復(fù)單位(Longtandemlyrepeatedrepetitive,LTRR)和短的串聯(lián)重復(fù)單位(Shorttandemlyrepeatedrepetitive,STRR),也可利用這特點(diǎn)設(shè)計(jì)和它們結(jié)合的引物直接擴(kuò)增,建立不同藻的指紋圖譜,以達(dá)到分子鑒定的目的。這兩種方法產(chǎn)生的多態(tài)性程度較高;實(shí)驗(yàn)中的基因組DNA只需要少量的就可以了;檢測的速度快?？衫没旌系哪０鍞U(kuò)增,通過特征帶的顯示,理論上可知道用于模板的組成混合物的種或?qū)?這為從水體中直接取水樣檢測提供了方便。但隨著樣本量的增多,對條帶的處理也就越來越復(fù)雜。這種方法可以在前述的測序的基礎(chǔ)上進(jìn)行更加精細(xì)的辨別不同的株系,而不適合多個屬,多個種的分子鑒定。但RAPD的重復(fù)性不是很好,可增加樣本的量和細(xì)致的標(biāo)準(zhǔn)化操作來解決問題,也可以回收凝膠上種特異的帶,測定序列,沿著模板方向延長引物的長度來提高特異性。要通過電泳分離的片段大小鑒定不同的種或?qū)?需要大量的引物對才能確定,增加了工作量。如果直接測序,不如用rDNA和藻藍(lán)蛋白基因直接。同時以PCR的特異性為基礎(chǔ),有人研究開展了DGGE,QPCR,T-RFLP等鑒定方法,用于鑒定藻種,已經(jīng)取得了許多可喜的成績。5生物分子鑒定方法在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面的應(yīng)用CarlWoese利用rRNA序列對生物進(jìn)行分類,引起了生物系統(tǒng)學(xué)研究的一場革命,他把生物界分為:細(xì)菌、真核生物和古細(xì)菌(Archaea)。他認(rèn)為rRNA的核苷酸突變率很慢而且穩(wěn)定,足以保證這些基因作為分子鐘(Molecularclock)。從那時起,利用基因序列去確定、發(fā)現(xiàn)和理解進(jìn)化關(guān)系成為普遍現(xiàn)象。近年來隨著基因組計(jì)劃的發(fā)展,生物信息學(xué)的出現(xiàn)和蓬勃發(fā)展,有力地促進(jìn)了整個生物學(xué)的進(jìn)步。生物信息學(xué)是利用數(shù)學(xué)方法研究儲存于信息庫中的核苷酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的科學(xué)。簡單地講,就是利用計(jì)算機(jī)程序去分析核苷酸和蛋白質(zhì)序列,從而揭示它們的身份、異同、結(jié)構(gòu)及功能等。比如,一個未知序列可以被用于BLAST分析,以尋找相同的或最相配(Bestmatches)的序列。同時Blast也可用于遺傳成分的系統(tǒng)進(jìn)化以及生物來源的分析。尤其值得注意的是,隨著生物新技術(shù)的發(fā)展,原先被認(rèn)為是費(fèi)時費(fèi)力費(fèi)錢的測序工作在當(dāng)前變得費(fèi)用低廉和快速容易,為更多的物種基因測序提供了機(jī)會,進(jìn)而引起生物信息學(xué)資源的劇增,為進(jìn)一步生物學(xué)研究提供有力的幫助。就藻類的分子鑒定而言,隨著網(wǎng)上提供的生物信息學(xué)資源和建樹資源的增多,這項(xiàng)工作較以往變得更加容易和準(zhǔn)確。利用不同基因的序列進(jìn)化研究結(jié)果為藻類的分子鑒定提供了條件,為將來擴(kuò)增的片段進(jìn)行比對提供了基礎(chǔ)。利用序列測定就可以根據(jù)研究對象中一個基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對引物,擴(kuò)增出一個基因的片段后測序,根據(jù)已知的基因庫(GENEBANK)中的序列,可大致的劃分所研究種的歸屬。如最常用的16SrDNA序列,該序列在原核生物的核基因組和