一種常染色體隱性遺傳多發(fā)性趾家系的連鎖分析

一種常染色體隱性遺傳多發(fā)性趾家系的連鎖分析

異常的先天性四肢是人類最常見的遺傳缺陷，其中大部分是更常見的先天手足畸形。對多指(趾)畸形的深入研究不僅具有較大的臨床價值,而且通過了解人體四肢發(fā)育的分子基礎,可以更好地確認在發(fā)育過程中與軸模式形成相關(guān)的基因。從目前的研究結(jié)果來看,多個基因的突變均可引起多指(趾)畸形這一表型?，F(xiàn)已確定,位于7p13的GLI3基因的突變可導致Greig綜合征,其表型之一就是多指(趾)并指(趾)畸形,這一基因的突變還可以導致單純性的A型軸后多指(趾)表型;位于2q31的HOXD13基因的突變可以導致并指(趾)多指(趾)。另外,還有一些家系的多指(趾)畸形相關(guān)基因定位于7q36區(qū)。因此,我們選取了2號染色體及7號染色體有關(guān)區(qū)域的8對引物,對我們所采集到一個多指(趾)家系進行了連鎖分析研究。1受者整體急性毒性檢測家系及群體樣本一個連續(xù)代發(fā)生的軸后多指(趾)家系。采集到該家系中13個正常個體、13個受累者及1個攜帶者的血樣。所有受累者均表現(xiàn)為軸后多指(趾),呈常染色體顯性遺傳特征。部分受累者表型見表1。圖1為受累者的手、足外觀照片及足部X光片。群體樣本為我們收集的無關(guān)隨機個體。1.2d7s650、d7s295、eln位于7q11-7q36區(qū)的7個微衛(wèi)星標記及2q31區(qū)的1個微衛(wèi)星標記共8個多態(tài)性位點,其中D7S495(AFM168xc3)、D7S559(Mfd265)、ELN(Swss2691)由荷蘭Erasmus大Oostra教授提供,D7S550(AFM224xh4)、D7S798(AFM205va3)根據(jù)文獻合成,D7S1804(GATA43C11)、D7S1826(GATA45E12)、D2S1384(GATA52A04)購自GeneticsResearchInc.。1.3pcr擴增和電泳檢測1.3.1鹽析法提取DNA取5ml靜脈血,用本實驗室常規(guī)方法提取DNA。1.3.2PCR擴增PCR擴增按常規(guī)方法在PE熱循環(huán)儀上進行。1.3.3PCR產(chǎn)物的電泳檢測PCR產(chǎn)物用含7mol/L尿素的6%丙烯酰胺凝膠進行電泳分離。電泳結(jié)束后用銀染法顯帶,直接從膠上讀取各成員各微衛(wèi)星DNA的基因型(圖2)。1.4mlif分析軟件采用Linkage(Version5.22)軟件包中的Mlink分析軟件進行兩點連鎖分析。設定軸后多指(趾)基因頻率為0.001,外顯率設為0.90。2結(jié)果2.1s1984位點分析分析了7號染色體上7個多態(tài)性位點,每個位點分析35人以上;未對D2S1384位點進行群體分析。這些位點在中國人中都具有多態(tài)性,多數(shù)位點的等位基因數(shù)目在5個以上,最多的達12個,多態(tài)信息量較高(表2),χ2檢驗,符合Hardy-Weinberg平衡,群體具有代表性。2.2在家系統(tǒng)的多態(tài)性分析家系成員的多態(tài)性位點的等位基因根據(jù)群體資料判定,每個成員都獲得明確的基因型,各成員之間無親子不符現(xiàn)象(圖2)。2.3d7s659與d7s659的連接7個位點的Lod值均小于1,5個位點的Lod值為0(θ=0.5),D7S550的最大Lod值為0.12(θ=0.20),D7S559的最大Lod值為0.71(θ=0),由此可否定該家系的致病基因與7號染色體上的幾個已知基因座連鎖。D2S1384位點的基因型與疾病表型之間沒有連鎖關(guān)系(圖2),在該家系可計數(shù)的22次減數(shù)分裂中,觀察到至少8次重組。所以D2S1384位點與致病基因明顯不連鎖,該家系的致病基因是HOXD13的可能可以排除。3多元道德組織及相關(guān)基因按照受累指(趾)發(fā)生的位置,可將獨立的、非綜合征型的多指(趾)分為軸前(橈側(cè))和軸后(尺側(cè))兩大類。其中軸后多指(趾)的發(fā)生率高于軸前多指(趾),某些人群中其發(fā)生率高達20‰。家族性軸后多指(趾)多以常染色體顯性性狀遺傳。此外,許多綜合征中也有各種多指(趾)畸形發(fā)生。如13三體中,約75%的患者發(fā)生軸后多指(趾),13q31-34的部分三體或缺失也可導致這一表型。目前已確定的可引起綜合征型多指(趾)畸形的基因,是位于7p13的GLI3基因,該基因編碼一鋅指蛋白,它的突變引起Greig綜合征,而足軸前多趾、手軸后多指和手足并指(趾)就是這一綜合征的一部分癥狀?，F(xiàn)已證實的獨立的、非綜合征型的多指(趾)畸形基因,有定位于2q31的HOXD13和7p13的GLI3基因,前者的突變可以導致并指多指畸形(SPD);而后者的突變可以導致A型軸后多指(趾)(PAP-A)。其他這類相關(guān)基因的研究,目前仍處于連鎖分析階段。有數(shù)個研究小組都將多指(趾)并指(趾)基因定位于7q36區(qū)。Tsukurov等研究的是一個患有復雜雙側(cè)多指(趾)并指(趾)癥的家系。他們通過連鎖分析,已將其相應基因定位于7q36,且已排除了另外一個定位于此的基因EN2(Engrailed2)為致病基因的可能。后來他們又在這個區(qū)域克隆了兩個與發(fā)育相關(guān)的基因:IHH(Indianhedgehog)和SHH(Sonichedgehog),也均被排除與該癥連鎖。Heutink等在對兩個患有3指節(jié)拇指畸形(TPT)家系的連鎖分析中發(fā)現(xiàn),這種TPT基因也定位于7q36區(qū),但尚不能排除EN2等為可能的候選基因。Hing等在對一個軸前多指Ⅱ型家系進行連鎖分析以后,相關(guān)基因也定位于7q36區(qū)域。Radhakrishna等研究的另一個印度家系患有3指節(jié)拇指和多指(趾)并指(趾)癥,同樣也被確定相關(guān)基因位于7q36。這些家系中,疾病表型的遺傳方式都是常染色體顯性遺傳。他們在進行連鎖分析時基本上都采用了D7S550和D7S559等位點,Z值均大于3(θ基于上述原因,我們考察了2q31的D2S1384位點,并重點分析了7號染色體長臂711.23-736的若干多態(tài)性位點,旨在確定本家系與已知位點是否連鎖,確定是否存在新的基因座。這些位點中D2S1384與HOXD13連鎖;ELN與GLI3連鎖,D7S1804、D7S495位于7q34-7q35,D7S1826位于7q35-7q36,D7S798、D7S550、D7S559位于7q36。7號染色體的這些位點之間的遺傳距離約為10～20cM,已包括了目前已知的定位于7號染色體的多指(趾)相關(guān)基因的所有區(qū)域,并且對7號染色體長臂的其他區(qū)域也基本覆蓋。在優(yōu)勢對數(shù)法中,Z≥3時,強烈提示分析的兩位點連鎖,Z>1則支持連鎖,Z≤-2則強烈提示兩位點不連鎖。而我們所研究的家系與上述位點間的Z值均小于1,不支持致病基因