微囊藻毒素對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化淡水水體中藻類生長(zhǎng)效應(yīng)的影響

微囊藻毒素對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化淡水水體中藻類生長(zhǎng)效應(yīng)的影響

湖泊富營(yíng)養(yǎng)化引起的藍(lán)藻水華暴發(fā)是全世界的環(huán)境問題。多種水華藍(lán)藻可以產(chǎn)生有毒次生代謝物質(zhì),如肽(肝毒素),生物堿(神經(jīng)毒素)和脂多糖(皮炎毒素)等。微囊藻毒素(Microcystin,簡(jiǎn)稱MC)是其中毒性較大、危害最嚴(yán)重的一種。MC主要由淡水藻類微囊藻、魚腥藻、念珠藻、顫藻等產(chǎn)生,是一類具生物活性的單環(huán)七肽,分子量1000左右,整個(gè)結(jié)構(gòu)可寫作環(huán)(D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-異-天冬氨酸-L-Z-Adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸)。MC的化學(xué)結(jié)構(gòu)變異十分普遍,目前已檢測(cè)到的MC異構(gòu)體已超過65種。近年來,MC對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的潛在威脅逐漸引起科學(xué)家的關(guān)注和重視,已有不少M(fèi)C對(duì)魚類和浮游動(dòng)物、水生植物的生物積累與毒理學(xué)研究。藻類作為水生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者,其種類的多樣性和初級(jí)生產(chǎn)量直接影響水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能,因而成為監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)水環(huán)境質(zhì)量的重要指示。關(guān)于MC對(duì)藻類生長(zhǎng)效應(yīng)的影響卻鮮見報(bào)道。近20a來,隨著有毒藍(lán)藻水華的頻繁發(fā)生,湖泊中藻類生物多樣性顯著下降,浮游植物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,MC也可能在這個(gè)過程中起了重要作用。筆者以幾種常見的淡水藻類作為實(shí)驗(yàn)生物,采用實(shí)驗(yàn)室自行制備的微囊藻毒素RR(MC-RR)對(duì)藻類進(jìn)行毒素暴露實(shí)驗(yàn),研究了不同質(zhì)量濃度的MC對(duì)藻類生長(zhǎng)和光合活性的影響,以進(jìn)一步了解MC的生物學(xué)效應(yīng),探討MC在浮游植物種群調(diào)節(jié)與藍(lán)藻水華形成中的作用。1材料和方法1.1淡水藻種庫的制備實(shí)驗(yàn)所用的藻株銅綠微囊藻Ds(MicrocystisaeruginosaDs,產(chǎn)毒株)、854(Microcystisaeruginosa854,非產(chǎn)毒株)分自昆明滇池,其它藻種水華束絲藻(Aphanizomenonflos-aquae)、細(xì)長(zhǎng)聚球藻(Synechococcuselongatus)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)、水華魚腥藻(Anabaenaflos-aquae)均來自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫,并通過稀釋平板法進(jìn)行純化,獲得無菌株。在無菌條件下轉(zhuǎn)接至BG11人工培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為溫度25±1℃,光照40μEm-2s-1左右,24h連續(xù)光照,靜止培養(yǎng),每天定時(shí)人工搖動(dòng)2次,并調(diào)換其位置,使各個(gè)錐形瓶受到的光照均勻。1.2粗微囊藻毒素的提取微囊藻毒素的制備方法參照Harada的方法,稍加修改。取適量的滇池微囊藻水華干藻粉,用體積分?jǐn)?shù)為5%的乙酸攪拌抽提3h,所得提取液8000r/min離心40min。上清液經(jīng)真空纖維素柱過濾,過濾后的上清液再過自制反相快速色譜柱(Sep-parkC18柱),甲醇洗脫,將洗脫液蒸干,水溶解即為粗微囊藻毒素。粗毒素再由制備型HPLC進(jìn)行純化。所得微囊藻毒素RR經(jīng)HPLC檢測(cè),純度大于95%,可用于常規(guī)的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。1.3初始a值的確定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)藻種用蒸餾水洗滌一遍,再用BG11洗滌一次后,接種于100mL三角瓶,培養(yǎng)量60mL,微囊藻毒素RR(MC-RR)用0.22μm細(xì)菌過濾器過濾,加入培養(yǎng)液中的質(zhì)量濃度為10-2、10-1、1、10、100、1000μg·L-1,并設(shè)對(duì)照,每處理3個(gè)平行樣品。藻液初始A值控制在0.03~0.09之間。同時(shí)在顯微鏡下觀察藻體的形態(tài)狀況。1.4測(cè)定藻類生物量每隔24h取樣,用UV3000分光光度計(jì)在665nm波長(zhǎng)處測(cè)定各培養(yǎng)液的光密度值以示藻類的生長(zhǎng)。1.5浮游植物效率分析光合活性用葉綠素a熒光表示.葉綠素a熒光用浮游植物效率分析儀(PHYTO-PAM,WalzGmbH,Germany)測(cè)定,測(cè)定在室溫下進(jìn)行,暗適應(yīng)時(shí)間不少于10min。1.6統(tǒng)計(jì)分析在平行樣之間的相對(duì)偏差小于10%時(shí),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取自3個(gè)平行樣的均值,并用最小顯著性分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2.1mc對(duì)銅綠微囊藻ds生長(zhǎng)的影響不同質(zhì)量濃度的MC對(duì)銅綠微囊藻產(chǎn)毒株Ds生長(zhǎng)的影響見圖1。由圖1可看出,在質(zhì)量濃度低于100μg·L-1時(shí),MC對(duì)Ds的生長(zhǎng)沒有表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)或抑制效應(yīng)(圖1A)。而高質(zhì)量濃度的微囊藻毒素1000μg·L-1則對(duì)Ds的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用(圖1B)。不同質(zhì)量濃度的MC對(duì)銅綠微囊藻無毒株854生長(zhǎng)的影響如圖2所示。由圖2可知,10μg·L-1以下的MC對(duì)854的生長(zhǎng)無明顯作用(圖2A)。與此相反,100μg·L-1、1000μg·L-1的MC則對(duì)854有顯著的溶藻效應(yīng)(圖2A,2B)。從外觀看,毒素處理的藻液第2天變黃,第4d變白,表明藻已死亡。鏡檢發(fā)現(xiàn),毒素處理的藻從第2天起,即大量溶解。到第4天,絕大多數(shù)藻細(xì)胞已溶解,只剩極少數(shù)的完整的藻細(xì)胞。4d后鏡檢已經(jīng)觀察不到藻體,只有死亡殘片。2.2mc-rr法測(cè)定水華魚腥藻的生長(zhǎng)不同質(zhì)量濃度的MC對(duì)細(xì)長(zhǎng)聚球藻生長(zhǎng)的影響見圖3。低于10μg·L-1的MC-RR對(duì)細(xì)長(zhǎng)聚球藻的生長(zhǎng)沒有顯著影響(圖3A)。與此相反,高于100μg·L-1的MC-RR顯著地抑制聚球藻的生長(zhǎng)。從生長(zhǎng)曲線可明顯看出,受到較高質(zhì)量濃度毒素處理的藻細(xì)胞有更長(zhǎng)的生長(zhǎng)延滯期:對(duì)照,0~2d;100μg·L-1,0~4d;1000μg·L-1,0~6d(圖3A,3B)。不同質(zhì)量濃度的MC對(duì)水華魚腥藻的影響如圖4所示。由圖4可看出,0~100μg·L-1各處理的生長(zhǎng)曲線均呈典型的S型,并且基本重疊在一起,表明各處理之間沒有明顯差異,100μg·L-1以下的毒素處理對(duì)魚腥藻的生長(zhǎng)無顯著影響(圖4A)。相反,高質(zhì)量濃度1000μg·L-1的MC-RR處理則顯著促進(jìn)了魚腥藻的生長(zhǎng)(圖4B)。不同質(zhì)量濃度的MC對(duì)水華束絲藻的影響見圖5。與MC對(duì)銅綠微囊藻無毒株的劑量效應(yīng)相類似,低質(zhì)量濃度的微囊藻毒素(10-2~10μg·L-1)對(duì)水華束絲藻的生長(zhǎng)無明顯影響(圖5A)。但在質(zhì)量濃度大于100μg·L-1時(shí),毒素處理會(huì)造成束絲藻迅速解體,死亡(圖5A,5B)。從外觀看,100、1000μg·L-1毒素處理的藻液從第2天起即變黃、渾濁。從第4天起,全部變白,表明毒素處理的藻發(fā)生了溶藻效應(yīng)。雖然測(cè)得的實(shí)際光密度值較大,但藻已死亡,我們將其光密度值計(jì)為零,并由此繪制生長(zhǎng)曲線。2.3毒素處理對(duì)綠藻生長(zhǎng)的影響不同質(zhì)量濃度的MC對(duì)蛋白核小球藻、斜生柵藻生長(zhǎng)的影響如圖6,圖7所示。MC對(duì)兩種綠藻的生長(zhǎng)效應(yīng)與其對(duì)水華魚腥藻的效應(yīng)相類似。100μg·L-1以下的毒素處理對(duì)兩種綠藻的生長(zhǎng)無明顯影響(圖6A,7A)。相反,高質(zhì)量濃度(1000μg·L-1)的毒素處理則顯著促進(jìn)了兩種綠藻的生長(zhǎng)。在生長(zhǎng)初期,即藻體的適應(yīng)期,1000μg·L-1對(duì)蛋白核小球藻、斜生柵藻的生長(zhǎng)效應(yīng)并不明顯,但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi),MC極大地刺激了這兩種綠藻的生長(zhǎng)。在毒素處理的第12天,蛋白核小球藻和斜生柵藻的A665比對(duì)照分別上升了48.8%和56.1%(圖6B,7B)。2.4浮游植物熒光檢測(cè)光合活性的變化與藻類的生長(zhǎng)抑制或促進(jìn)是密切相關(guān)的。圖8,圖9為微囊藻毒素處理下細(xì)長(zhǎng)聚球藻、水華束絲藻、小球藻、水華魚腥藻Fv/Fm的變化。Fv/Fm值反映著光系統(tǒng)Ⅱ活性的大小,并可直接衡量植物的光合作用能力。根據(jù)浮游植物熒光檢測(cè)的結(jié)果,100μg·L-1顯著降低了聚球藻的光合活性。在處理后的第4天,其Fv/Fm值比對(duì)照降低了37.8%。而微囊藻毒素對(duì)束絲藻光合活性的抑制作用更明顯,處理后的第2天,束絲藻細(xì)胞的Fv/Fm即降為0。與此相反,微囊藻毒素對(duì)小球藻和魚腥藻的光合效能沒有明顯影響。毒素處理組的Fv/Fm值在處理的第4天,與對(duì)照并無明顯差異。3mc調(diào)節(jié)浮游植物種群從以上結(jié)果可見,MC對(duì)藻類的生長(zhǎng)具有明顯的劑量效應(yīng)。低質(zhì)量濃度的MC(0.01~10μg·L-1)對(duì)測(cè)試的藻種沒有明顯的影響。而100、1000μg.L-1MC-RR則對(duì)不同的藻種表現(xiàn)為不同的生長(zhǎng)效應(yīng)。雖然自然水體中的MC質(zhì)量濃度通常較低,但MC在水體中分布的時(shí)空差異性決定了藻細(xì)胞實(shí)際上會(huì)受到高于環(huán)境相關(guān)質(zhì)量濃度的毒素脅迫,從而影響其生長(zhǎng)。本研究中,100μg·L-1的MC對(duì)產(chǎn)毒微囊藻Ds本身作用并不明顯,而同等質(zhì)量濃度的MC對(duì)非產(chǎn)毒微囊藻854則表現(xiàn)強(qiáng)烈的溶藻效應(yīng),表明MC可改變產(chǎn)毒與非產(chǎn)毒藻的比例。這可能是微囊藻水華暴發(fā)初期毒性較低,后期毒性上升的一個(gè)重要原因。本實(shí)驗(yàn)所采用的最高的毒素質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)毒銅綠微囊藻的生長(zhǎng)有一定的抑制作用,表明MC可能做為一種自毒物質(zhì)限制微囊藻種群的無限增長(zhǎng),這一結(jié)果進(jìn)一步證明了MC在調(diào)節(jié)微囊藻種群中的作用。在七種測(cè)試藻中,水華束絲藻是另一種對(duì)MC毒性較敏感的藻,在高于100μg·L-1的毒素處理48h后,水華束絲藻藻絲斷裂,藻細(xì)胞溶解。束絲藻在許多水體中與微囊藻共存或者先于微囊藻發(fā)生水華,在一定程度上可以認(rèn)為是微囊藻的競(jìng)爭(zhēng)者,MC對(duì)競(jìng)爭(zhēng)藻種的抑制有利于微囊藻在競(jìng)爭(zhēng)中居于優(yōu)勢(shì)。本研究中,細(xì)長(zhǎng)聚球藻對(duì)MC毒性的敏感程度要低于束絲藻,100和1000μg·L-1MC-RR對(duì)其表現(xiàn)為慢性毒性效應(yīng)。值得注意的是,高質(zhì)量濃度的MC對(duì)部分測(cè)試藻如蛋白核小球藻、斜生柵藻有促進(jìn)作用。這種較高質(zhì)量濃度往往在微囊藻水華處于衰退期,藍(lán)藻水華大量分解時(shí)才會(huì)達(dá)到。許多野外觀察表明,藍(lán)藻水華消退后,一些綠藻(如柵藻)會(huì)逐漸在浮游植物種群中居于優(yōu)勢(shì),綠藻實(shí)際上可以說是微囊藻的接替者。MC對(duì)后續(xù)藻種的促進(jìn)作用,從另一個(gè)角度證明了MC在浮游植物種群調(diào)節(jié)中扮演了較重要的角色。本研究中,兩種藍(lán)藻聚球藻和束絲藻在受到毒素脅迫后,其光合系統(tǒng)PSⅡ活性均被抑制,這一結(jié)果與Singh的報(bào)道類似,微囊藻毒素對(duì)藻類生長(zhǎng)的抑制與其對(duì)光合活性的抑制有關(guān),微囊藻毒素作用位點(diǎn)可能在光合系統(tǒng)PSⅡ上。令人感興趣的是,雖然高質(zhì)量濃度的微囊藻毒素可以促進(jìn)小球藻和魚腥藻的生長(zhǎng),但它對(duì)光合效能沒有明顯影響。因此微囊藻毒素對(duì)藻類生長(zhǎng)促進(jìn)的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。盡管藍(lán)藻比其它大多數(shù)浮游藻類最大生長(zhǎng)速率更低,但它們?cè)谔囟ǖ臈l件下,往往能超過其它種類,形成藍(lán)藻水華,其原因在于藍(lán)藻能通過一系列的生理生態(tài)對(duì)策去適應(yīng)變化的外在生長(zhǎng)條件從而幫助它們?cè)诟∮沃参锓N群中居于優(yōu)勢(shì),進(jìn)而形成藍(lán)藻水華。固氮藍(lán)藻往往能在氮源不足時(shí)相比競(jìng)爭(zhēng)者自動(dòng)獲得選擇性優(yōu)勢(shì)。藍(lán)藻對(duì)氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素的奢侈吸收使藍(lán)藻在營(yíng)養(yǎng)限制條件下也能生存與繁殖。無機(jī)碳濃縮機(jī)制也在藍(lán)藻種群增殖中扮演重要角色。此外,藍(lán)藻還能通過調(diào)節(jié)氣泡數(shù)目與大小改變浮力大小從而迅速找到適合自身生長(zhǎng)的最佳光照條件。它感效應(yīng)則是一些藍(lán)藻種類在競(jìng)爭(zhēng)中居于優(yōu)勢(shì)的另一個(gè)重要機(jī)制。最近,越來越多的作者認(rèn)為有害藍(lán)藻水華分泌的次生代謝物質(zhì)對(duì)其他浮游植物產(chǎn)生它感效應(yīng)是有害藍(lán)藻水華發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因子。某些種類的藍(lán)藻能產(chǎn)生MC,但MC的生物學(xué)功能仍不大清楚。少數(shù)作者提出MC能作為它感物質(zhì)調(diào)節(jié)種群結(jié)構(gòu),從而在藍(lán)藻水華發(fā)生中起一定作用。但這一假說沒有什么實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本文的研究結(jié)果則為MC的它感作用提供了實(shí)質(zhì)性的實(shí)驗(yàn)證據(jù)從而支持這一假說。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明MC參與浮游植物的種間相互作用與種群調(diào)節(jié),由此筆者推論,MC的產(chǎn)生可能是微囊藻水華暴發(fā)的一個(gè)重要生物學(xué)機(jī)制。4微囊藻毒素對(duì)mc活性的影響1)MC對(duì)淡水藻類的生長(zhǎng)具有明顯的劑量效應(yīng)。低質(zhì)量濃度的MC(0.01~10μg·L-1)對(duì)測(cè)試的藻種沒有明顯的影響;而100、1000μg.L-1MC-RR則對(duì)不同的藻種表現(xiàn)為不同的生長(zhǎng)效應(yīng)。2)在7種測(cè)試藻中,銅綠微囊藻無毒株854和束絲藻對(duì)MC的毒性最明