微囊藻毒素對富營養(yǎng)化淡水水體中藻類生長效應的影響

微囊藻毒素對富營養(yǎng)化淡水水體中藻類生長效應的影響

湖泊富營養(yǎng)化引起的藍藻水華暴發(fā)是全世界的環(huán)境問題。多種水華藍藻可以產生有毒次生代謝物質,如肽(肝毒素),生物堿(神經毒素)和脂多糖(皮炎毒素)等。微囊藻毒素(Microcystin,簡稱MC)是其中毒性較大、危害最嚴重的一種。MC主要由淡水藻類微囊藻、魚腥藻、念珠藻、顫藻等產生,是一類具生物活性的單環(huán)七肽,分子量1000左右,整個結構可寫作環(huán)(D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-異-天冬氨酸-L-Z-Adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸)。MC的化學結構變異十分普遍,目前已檢測到的MC異構體已超過65種。近年來,MC對水生態(tài)系統的潛在威脅逐漸引起科學家的關注和重視,已有不少MC對魚類和浮游動物、水生植物的生物積累與毒理學研究。藻類作為水生態(tài)系統的初級生產者,其種類的多樣性和初級生產量直接影響水生態(tài)系統的結構和功能,因而成為監(jiān)測評價水環(huán)境質量的重要指示。關于MC對藻類生長效應的影響卻鮮見報道。近20a來,隨著有毒藍藻水華的頻繁發(fā)生,湖泊中藻類生物多樣性顯著下降,浮游植物種群結構發(fā)生變化,MC也可能在這個過程中起了重要作用。筆者以幾種常見的淡水藻類作為實驗生物,采用實驗室自行制備的微囊藻毒素RR(MC-RR)對藻類進行毒素暴露實驗,研究了不同質量濃度的MC對藻類生長和光合活性的影響,以進一步了解MC的生物學效應,探討MC在浮游植物種群調節(jié)與藍藻水華形成中的作用。1材料和方法1.1淡水藻種庫的制備實驗所用的藻株銅綠微囊藻Ds(MicrocystisaeruginosaDs,產毒株)、854(Microcystisaeruginosa854,非產毒株)分自昆明滇池,其它藻種水華束絲藻(Aphanizomenonflos-aquae)、細長聚球藻(Synechococcuselongatus)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)、水華魚腥藻(Anabaenaflos-aquae)均來自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫,并通過稀釋平板法進行純化,獲得無菌株。在無菌條件下轉接至BG11人工培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為溫度25±1℃,光照40μEm-2s-1左右,24h連續(xù)光照,靜止培養(yǎng),每天定時人工搖動2次,并調換其位置,使各個錐形瓶受到的光照均勻。1.2粗微囊藻毒素的提取微囊藻毒素的制備方法參照Harada的方法,稍加修改。取適量的滇池微囊藻水華干藻粉,用體積分數為5%的乙酸攪拌抽提3h,所得提取液8000r/min離心40min。上清液經真空纖維素柱過濾,過濾后的上清液再過自制反相快速色譜柱(Sep-parkC18柱),甲醇洗脫,將洗脫液蒸干,水溶解即為粗微囊藻毒素。粗毒素再由制備型HPLC進行純化。所得微囊藻毒素RR經HPLC檢測,純度大于95%,可用于常規(guī)的毒理學實驗。1.3初始a值的確定取對數生長期的實驗藻種用蒸餾水洗滌一遍,再用BG11洗滌一次后,接種于100mL三角瓶,培養(yǎng)量60mL,微囊藻毒素RR(MC-RR)用0.22μm細菌過濾器過濾,加入培養(yǎng)液中的質量濃度為10-2、10-1、1、10、100、1000μg·L-1,并設對照,每處理3個平行樣品。藻液初始A值控制在0.03~0.09之間。同時在顯微鏡下觀察藻體的形態(tài)狀況。1.4測定藻類生物量每隔24h取樣,用UV3000分光光度計在665nm波長處測定各培養(yǎng)液的光密度值以示藻類的生長。1.5浮游植物效率分析光合活性用葉綠素a熒光表示.葉綠素a熒光用浮游植物效率分析儀(PHYTO-PAM,WalzGmbH,Germany)測定,測定在室溫下進行,暗適應時間不少于10min。1.6統計分析在平行樣之間的相對偏差小于10%時,實驗數據取自3個平行樣的均值,并用最小顯著性分析方法對數據進行統計分析。2結果與分析2.1mc對銅綠微囊藻ds生長的影響不同質量濃度的MC對銅綠微囊藻產毒株Ds生長的影響見圖1。由圖1可看出,在質量濃度低于100μg·L-1時,MC對Ds的生長沒有表現出明顯的促進或抑制效應(圖1A)。而高質量濃度的微囊藻毒素1000μg·L-1則對Ds的生長有明顯的抑制作用(圖1B)。不同質量濃度的MC對銅綠微囊藻無毒株854生長的影響如圖2所示。由圖2可知,10μg·L-1以下的MC對854的生長無明顯作用(圖2A)。與此相反,100μg·L-1、1000μg·L-1的MC則對854有顯著的溶藻效應(圖2A,2B)。從外觀看,毒素處理的藻液第2天變黃,第4d變白,表明藻已死亡。鏡檢發(fā)現,毒素處理的藻從第2天起,即大量溶解。到第4天,絕大多數藻細胞已溶解,只剩極少數的完整的藻細胞。4d后鏡檢已經觀察不到藻體,只有死亡殘片。2.2mc-rr法測定水華魚腥藻的生長不同質量濃度的MC對細長聚球藻生長的影響見圖3。低于10μg·L-1的MC-RR對細長聚球藻的生長沒有顯著影響(圖3A)。與此相反,高于100μg·L-1的MC-RR顯著地抑制聚球藻的生長。從生長曲線可明顯看出,受到較高質量濃度毒素處理的藻細胞有更長的生長延滯期:對照,0~2d;100μg·L-1,0~4d;1000μg·L-1,0~6d(圖3A,3B)。不同質量濃度的MC對水華魚腥藻的影響如圖4所示。由圖4可看出,0~100μg·L-1各處理的生長曲線均呈典型的S型,并且基本重疊在一起,表明各處理之間沒有明顯差異,100μg·L-1以下的毒素處理對魚腥藻的生長無顯著影響(圖4A)。相反,高質量濃度1000μg·L-1的MC-RR處理則顯著促進了魚腥藻的生長(圖4B)。不同質量濃度的MC對水華束絲藻的影響見圖5。與MC對銅綠微囊藻無毒株的劑量效應相類似,低質量濃度的微囊藻毒素(10-2~10μg·L-1)對水華束絲藻的生長無明顯影響(圖5A)。但在質量濃度大于100μg·L-1時,毒素處理會造成束絲藻迅速解體,死亡(圖5A,5B)。從外觀看,100、1000μg·L-1毒素處理的藻液從第2天起即變黃、渾濁。從第4天起,全部變白,表明毒素處理的藻發(fā)生了溶藻效應。雖然測得的實際光密度值較大,但藻已死亡,我們將其光密度值計為零,并由此繪制生長曲線。2.3毒素處理對綠藻生長的影響不同質量濃度的MC對蛋白核小球藻、斜生柵藻生長的影響如圖6,圖7所示。MC對兩種綠藻的生長效應與其對水華魚腥藻的效應相類似。100μg·L-1以下的毒素處理對兩種綠藻的生長無明顯影響(圖6A,7A)。相反,高質量濃度(1000μg·L-1)的毒素處理則顯著促進了兩種綠藻的生長。在生長初期,即藻體的適應期,1000μg·L-1對蛋白核小球藻、斜生柵藻的生長效應并不明顯,但隨著處理時間的延長,在對數生長期內,MC極大地刺激了這兩種綠藻的生長。在毒素處理的第12天,蛋白核小球藻和斜生柵藻的A665比對照分別上升了48.8%和56.1%(圖6B,7B)。2.4浮游植物熒光檢測光合活性的變化與藻類的生長抑制或促進是密切相關的。圖8,圖9為微囊藻毒素處理下細長聚球藻、水華束絲藻、小球藻、水華魚腥藻Fv/Fm的變化。Fv/Fm值反映著光系統Ⅱ活性的大小,并可直接衡量植物的光合作用能力。根據浮游植物熒光檢測的結果,100μg·L-1顯著降低了聚球藻的光合活性。在處理后的第4天,其Fv/Fm值比對照降低了37.8%。而微囊藻毒素對束絲藻光合活性的抑制作用更明顯,處理后的第2天,束絲藻細胞的Fv/Fm即降為0。與此相反,微囊藻毒素對小球藻和魚腥藻的光合效能沒有明顯影響。毒素處理組的Fv/Fm值在處理的第4天,與對照并無明顯差異。3mc調節(jié)浮游植物種群從以上結果可見,MC對藻類的生長具有明顯的劑量效應。低質量濃度的MC(0.01~10μg·L-1)對測試的藻種沒有明顯的影響。而100、1000μg.L-1MC-RR則對不同的藻種表現為不同的生長效應。雖然自然水體中的MC質量濃度通常較低,但MC在水體中分布的時空差異性決定了藻細胞實際上會受到高于環(huán)境相關質量濃度的毒素脅迫,從而影響其生長。本研究中,100μg·L-1的MC對產毒微囊藻Ds本身作用并不明顯,而同等質量濃度的MC對非產毒微囊藻854則表現強烈的溶藻效應,表明MC可改變產毒與非產毒藻的比例。這可能是微囊藻水華暴發(fā)初期毒性較低,后期毒性上升的一個重要原因。本實驗所采用的最高的毒素質量濃度對產毒銅綠微囊藻的生長有一定的抑制作用,表明MC可能做為一種自毒物質限制微囊藻種群的無限增長,這一結果進一步證明了MC在調節(jié)微囊藻種群中的作用。在七種測試藻中,水華束絲藻是另一種對MC毒性較敏感的藻,在高于100μg·L-1的毒素處理48h后,水華束絲藻藻絲斷裂,藻細胞溶解。束絲藻在許多水體中與微囊藻共存或者先于微囊藻發(fā)生水華,在一定程度上可以認為是微囊藻的競爭者,MC對競爭藻種的抑制有利于微囊藻在競爭中居于優(yōu)勢。本研究中,細長聚球藻對MC毒性的敏感程度要低于束絲藻,100和1000μg·L-1MC-RR對其表現為慢性毒性效應。值得注意的是,高質量濃度的MC對部分測試藻如蛋白核小球藻、斜生柵藻有促進作用。這種較高質量濃度往往在微囊藻水華處于衰退期,藍藻水華大量分解時才會達到。許多野外觀察表明,藍藻水華消退后,一些綠藻(如柵藻)會逐漸在浮游植物種群中居于優(yōu)勢,綠藻實際上可以說是微囊藻的接替者。MC對后續(xù)藻種的促進作用,從另一個角度證明了MC在浮游植物種群調節(jié)中扮演了較重要的角色。本研究中,兩種藍藻聚球藻和束絲藻在受到毒素脅迫后,其光合系統PSⅡ活性均被抑制,這一結果與Singh的報道類似,微囊藻毒素對藻類生長的抑制與其對光合活性的抑制有關,微囊藻毒素作用位點可能在光合系統PSⅡ上。令人感興趣的是,雖然高質量濃度的微囊藻毒素可以促進小球藻和魚腥藻的生長,但它對光合效能沒有明顯影響。因此微囊藻毒素對藻類生長促進的機理還有待進一步研究。盡管藍藻比其它大多數浮游藻類最大生長速率更低,但它們在特定的條件下,往往能超過其它種類,形成藍藻水華,其原因在于藍藻能通過一系列的生理生態(tài)對策去適應變化的外在生長條件從而幫助它們在浮游植物種群中居于優(yōu)勢,進而形成藍藻水華。固氮藍藻往往能在氮源不足時相比競爭者自動獲得選擇性優(yōu)勢。藍藻對氮、磷等營養(yǎng)元素的奢侈吸收使藍藻在營養(yǎng)限制條件下也能生存與繁殖。無機碳濃縮機制也在藍藻種群增殖中扮演重要角色。此外,藍藻還能通過調節(jié)氣泡數目與大小改變浮力大小從而迅速找到適合自身生長的最佳光照條件。它感效應則是一些藍藻種類在競爭中居于優(yōu)勢的另一個重要機制。最近,越來越多的作者認為有害藍藻水華分泌的次生代謝物質對其他浮游植物產生它感效應是有害藍藻水華發(fā)生的一個關鍵因子。某些種類的藍藻能產生MC,但MC的生物學功能仍不大清楚。少數作者提出MC能作為它感物質調節(jié)種群結構,從而在藍藻水華發(fā)生中起一定作用。但這一假說沒有什么實驗證據。本文的研究結果則為MC的它感作用提供了實質性的實驗證據從而支持這一假說。實驗結果說明MC參與浮游植物的種間相互作用與種群調節(jié),由此筆者推論,MC的產生可能是微囊藻水華暴發(fā)的一個重要生物學機制。4微囊藻毒素對mc活性的影響1)MC對淡水藻類的生長具有明顯的劑量效應。低質量濃度的MC(0.01~10μg·L-1)對測試的藻種沒有明顯的影響;而100、1000μg.L-1MC-RR則對不同的藻種表現為不同的生長效應。2)在7種測試藻中,銅綠微囊藻無毒株854和束絲藻對MC的毒性最明