流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)（FCM）簡述流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry）是70年代發(fā)展起來的一種利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞等生物粒子的理化及生物學(xué)特性（細(xì)胞大小、DNA/RNA含量、細(xì)胞表面抗原表達(dá)等）進(jìn)行定量、快速、客觀多參數(shù)相關(guān)檢測分析的新技術(shù)。它借鑒了熒光顯微鏡技術(shù)與血球計(jì)數(shù)原理，同時(shí)利用熒光染料，激光技術(shù)，單抗技術(shù)以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，大大提高了檢測速度與統(tǒng)計(jì)精確性，而且從同一個(gè)細(xì)胞中可以同時(shí)測得多種參數(shù)，為生物醫(yī)學(xué)與臨床檢驗(yàn)學(xué)發(fā)展提供了一個(gè)全新的視角和強(qiáng)有力的手段。FCM在生命科學(xué)中的應(yīng)用，標(biāo)志著細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等進(jìn)入了細(xì)胞和分子水平的研究。為從微觀認(rèn)識(shí)細(xì)胞及橫向比較特征提供了精密、準(zhǔn)確的方法和儀器。FCM的基本原理1、 流式細(xì)胞儀系統(tǒng)流程：標(biāo)本T激光系統(tǒng)一流動(dòng)系統(tǒng)T信號處理系統(tǒng)T放大系統(tǒng)T計(jì)算機(jī)系統(tǒng)T結(jié)果打印2、 基本原理：待測標(biāo)本制備成單細(xì)胞懸液通過熒光染色后進(jìn)入充滿鞘液的流動(dòng)室，鞘液壓力與樣品流壓力是不同的，當(dāng)二者的壓力差異達(dá)到一定程度時(shí)，鞘液裹挾著樣品流中細(xì)胞排成單列逐個(gè)經(jīng)過激光聚焦區(qū)。如果我們將細(xì)胞中感興趣的部分特異性的標(biāo)上熒光染料，那麼這些染料將在細(xì)胞通過激光檢測區(qū)時(shí)受激光發(fā)出特定波長的熒光,通過一定波長選擇通透性的濾色片，我們可將不同波長的散射光、熒光信號區(qū)分開來，并送到不同的光電倍增管中，經(jīng)過一系列的信號轉(zhuǎn)換、放大，數(shù)字化處理，我們就可以在計(jì)算機(jī)直觀的統(tǒng)計(jì)染上各種熒光染料的細(xì)胞各自的百分率。選擇不同的單克隆”＞克隆抗體及熒光染料，我們可以利用FC同時(shí)測定一個(gè)細(xì)胞上的多種不同特征；如果對具有某種特征的細(xì)胞有興趣，我們還可以利用流式的分選功能將其分選出來，以便進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。3、 意義：FCM與單克隆"＞克隆抗體結(jié)合，可對細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原、癌基因蛋白及膜受體進(jìn)行定量檢測，成為臨床檢驗(yàn)與研究的重要指標(biāo)。流式免疫熒光技術(shù)不僅能將表達(dá)位點(diǎn)的細(xì)胞群區(qū)分開來，而且還能進(jìn)一步區(qū)分各細(xì)胞亞群。對免疫功能障礙、造血系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤的研究、診斷、治療和預(yù)后評估都能起到重要作用應(yīng)用分類1、免疫表型分析1993年在波士頓召開的人類白細(xì)胞分化抗原會(huì)議（leukocytedifferentiationantigen,HLDA）將CD抗原（clusterofdifferentiation）分為T細(xì)胞、B細(xì)胞、髓細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、活化抗原、黏附因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體等九個(gè)組，確立了48種新抗原。1996年11月在神戶召開的第六屆HLDA會(huì)議上，又有30多種新抗原被確認(rèn)，CD編號已達(dá)166個(gè)，CD抗原有197種。2000年7月，第七屆人類白細(xì)胞分化抗原會(huì)議的召開，CD抗原已達(dá)247種。CD系列在免疫學(xué)中常被用于：（1）CD抗原的基因克隆”＞克隆，新CD抗原及新配體的發(fā)現(xiàn)；（2）CD抗原功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系；（3）細(xì)胞激活途徑和膜信號的傳遞；（4）細(xì)胞分化過程中的調(diào)控；（5）細(xì)胞亞群的功能。免疫表型分析的應(yīng)用檢測淋巴細(xì)胞亞群，監(jiān)測細(xì)胞免疫狀態(tài)（淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)功能最重要的大細(xì)胞群，在免疫應(yīng)答過程中，末梢血淋巴細(xì)胞發(fā)育分化成為功能不同的亞群。當(dāng)亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí)，就能導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂并產(chǎn)生病理變化。FCM可以同時(shí)檢測一種或幾種淋巴細(xì)胞表面抗原，將不同的淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開來，并計(jì)算出它們相互間的比例，通過對病人淋巴細(xì)胞各亞群數(shù)量的測定來監(jiān)控病人的免疫狀態(tài)，并指導(dǎo)治療）。白血病/淋巴瘤免疫分型；HLA組織配型及HLA與某些疾病的關(guān)系；干祖細(xì)胞的定量及成分分析；粘附分子;TCR多態(tài)性檢測;腫瘤癌基因及抑癌基因蛋白產(chǎn)物的檢測;細(xì)胞內(nèi)酶；耐藥蛋白的分析等等；疾病診斷:為疾病診斷提供直接的或支持診斷的依據(jù)；免疫調(diào)節(jié)：細(xì)胞因子/受體的相互作用、共刺激分子受體/配體的相互作用；發(fā)病機(jī)理：腫瘤的發(fā)病與機(jī)體的免疫力低下、以及信號傳遞障礙有關(guān)；藥物/疫苗效果的評價(jià)：腫瘤生物治療的時(shí)機(jī)選擇、以及效果的監(jiān)測；免疫狀態(tài)評價(jià)：移植、放化療等。流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)與原理流式細(xì)胞儀是進(jìn)行流式細(xì)胞分析的儀器，集電子、計(jì)算機(jī)、激光、流體理論于一體，被譽(yù)為試驗(yàn)室的“CT”流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytoMeter,FCM)是一種在功能水平上對單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測手段，它可高速分析上萬個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測得多個(gè)參數(shù)，與傳統(tǒng)熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。工作原理將待測細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動(dòng)室，不含細(xì)胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時(shí)被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進(jìn)行檢測，這種信號基本上反映了細(xì)胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強(qiáng)度代表了所測細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，再通過A/D轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號。計(jì)算機(jī)把所測量到的各種信號進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理，將分析結(jié)果顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，液可以打印出來，還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲(chǔ)在硬盤上以備日后的查詢或進(jìn)一步分析。檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同由多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達(dá)，其X軸為測量強(qiáng)度，Y軸為細(xì)胞數(shù)目。一般來說，流式細(xì)胞儀坐標(biāo)軸的分辨率有512或1024通道數(shù)，這視其模數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù)，既可以單獨(dú)顯示每個(gè)參數(shù)的直方圖，也可以選擇二維的三點(diǎn)圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。細(xì)胞的分選是通過分離含有單細(xì)胞的液滴而實(shí)現(xiàn)的。在流動(dòng)室的噴口上配有一個(gè)超高頻電品體，充電后振動(dòng)，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測定細(xì)胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負(fù)不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。應(yīng)用范圍用于白血病的分型、腫瘤細(xì)胞染色體的異倍性測定，以及免疫學(xué)研究，并已開始用于細(xì)菌鑒定，病毒感染細(xì)胞的識(shí)別和愛滋病感染者T4、T8細(xì)胞的記數(shù)。70年代以來，隨著流式細(xì)胞技術(shù)水平的不斷提高，其應(yīng)用范圍也日益廣泛。流式細(xì)胞術(shù)已普遍應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。技術(shù)特點(diǎn)流式細(xì)胞儀作為一種先進(jìn)的細(xì)胞定量分析檢測儀器，設(shè)計(jì)上采用了許多獨(dú)特的技術(shù)，其中涉及到液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、信號測量和細(xì)胞分選等4個(gè)方面。展望流式細(xì)胞儀從細(xì)胞技術(shù)開始發(fā)展到今天，60至70年代是其飛速發(fā)展時(shí)期，激光技術(shù)、噴射技術(shù)以及計(jì)算機(jī)的應(yīng)用使流式細(xì)胞儀在原理和結(jié)構(gòu)上形成了固定的模式。80年代則是流式細(xì)胞儀的商品化時(shí)期，這期間不斷有新型號的儀器推出，在多參數(shù)檢測技術(shù)上不斷提高。進(jìn)入90年代，隨著微電子技術(shù)特別是計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀的功能也越來越強(qiáng)大。在數(shù)據(jù)管理、數(shù)據(jù)分析方面有了長足進(jìn)步。但是，在技術(shù)原理和設(shè)計(jì)方面并沒有突破性的進(jìn)展。人們的注意力開始轉(zhuǎn)向流式細(xì)胞儀的應(yīng)用，新的熒光探針