我國(guó)生豬多系統(tǒng)衰竭綜合征診斷方法的研究進(jìn)展

我國(guó)生豬多系統(tǒng)衰竭綜合征診斷方法的研究進(jìn)展

豬斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征（pmw）是由豬圓形病毒2（pcv2）引起的新疾病。PCV是1974年在豬腎傳代細(xì)胞系PK-15中發(fā)現(xiàn)的一種污染病毒,該病毒不產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),無(wú)致病性,命名為PCV1;而后在PMWS中分離的豬圓環(huán)病毒,有致病性,命名為PCV2。PMWS主要感染1~5月齡的豬,發(fā)病率為4%~30%,致死率為70%~80%?；疾嗄特i和生長(zhǎng)豬臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦、呼吸困難、皮膚蒼白、黃疸、腹瀉和體表淋巴結(jié)腫大,多種組織發(fā)生廣泛的肉芽腫性炎癥,肉芽腫性淋巴結(jié)炎、間質(zhì)性肺炎、肝炎、間質(zhì)性腎炎和胰腺炎。病理組織學(xué)變化主要是淋巴細(xì)胞組織不同程度的衰竭萎縮,淋巴細(xì)胞減少。該病在世界許多養(yǎng)豬國(guó)家都有發(fā)生,我國(guó)也有本病流行。PMWS嚴(yán)重影響豬的生長(zhǎng)發(fā)育,其發(fā)病機(jī)理、傳染源等尚不清楚,本病沒(méi)有有效的治療方法,抗生素對(duì)PMWS患病豬無(wú)效。但抗生素的使用和良好的飼養(yǎng)管理有助于防止再次感染。目前還沒(méi)有疫苗可供應(yīng)用。根據(jù)臨床癥狀和病理變化只能作出初步診斷,確診PMWS必須依靠實(shí)驗(yàn)室檢查。目前已建立和應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室PMWS診斷技術(shù)有病毒分離與鑒定、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(IELISA)、免疫組織化學(xué)試驗(yàn)(IHC)等。病毒分離與鑒定多用于急性病例的確診和新疫區(qū)的確定;PCR方法用于檢測(cè)PCV病毒的核酸,應(yīng)用型特異性引物可對(duì)PCV1和PCV2定型;IFA、間接ELISA方法主要用于檢測(cè)PCV抗體;IHC方法主要用于檢測(cè)PCV抗原,并進(jìn)行病毒的組織學(xué)定位。筆者對(duì)我國(guó)生豬PMWS的診斷方法進(jìn)行了系統(tǒng)歸類,并建立了相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。以保證我國(guó)PMWS的診斷標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)外診斷標(biāo)準(zhǔn)的一致性。1ph值的變化最常見的、也是確診PMWS所必需的臨床癥狀是患病豬衰竭和生長(zhǎng)發(fā)育不良,進(jìn)行性消瘦,還有精神不振,食欲不佳,被毛粗亂,消化不良,肌肉衰弱無(wú)力,腹瀉,皮膚蒼白,黃疸以及咳嗽、噴嚏、呼吸困難等呼吸系統(tǒng)癥狀。體表淋巴結(jié),特別是腹股溝淋巴結(jié)腫大。其他不常見的癥狀有發(fā)熱,嗜睡,胃潰瘍,中樞神經(jīng)紊亂,猝死。上述臨床癥狀不一定同時(shí)在同一頭豬上出現(xiàn),發(fā)病豬場(chǎng)在一段時(shí)間內(nèi)多數(shù)豬會(huì)出現(xiàn)上述癥狀,一些臨床癥狀由于繼發(fā)感染或雙重感染而惡化。2細(xì)菌感染豬淋巴結(jié)及病料分析最顯著的病變是全身淋巴結(jié),特別是腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、氣管、支氣管淋巴結(jié)及下頜淋巴結(jié)腫大2~5倍,有的可達(dá)10倍;切面硬度增加,呈均勻的蒼白色,集合淋巴小結(jié)腫大。但在PMWS感染豬也可觀察到正?；蛭s的淋巴結(jié)。發(fā)生細(xì)菌感染豬的淋巴結(jié)可見炎性和化膿性病變,使病變復(fù)雜化。肺腫脹不崩陷,有散在、大而隆起的橡皮樣硬塊。嚴(yán)重的病例肺泡出血,部分病例肺尖葉和心葉萎縮或固質(zhì)化。脾中度腫脹,呈肉樣變。半數(shù)病例的肝無(wú)明顯異常,其他病豬則表現(xiàn)不同程度的虎斑狀外觀,并伴有輕度或中度萎縮,有的病例肝腫脹。腎水腫、蒼白,被膜下有白色壞死灶,盲腸和結(jié)腸黏膜充血或瘀血。許多PMWS感染豬有支氣管肺炎和胃潰瘍,支氣管肺炎與細(xì)菌感染有關(guān),胃潰瘍和PCV2感染無(wú)直接關(guān)系,胃潰瘍發(fā)生的原因是多方面的。胃內(nèi)病灶引起的內(nèi)出血是導(dǎo)致部分PMWS豬死亡的原因,也是導(dǎo)致病豬皮膚蒼白的原因。3散核巨細(xì)胞的檢測(cè)淋巴結(jié)的皮質(zhì)及副皮質(zhì)區(qū)顯著擴(kuò)張,有單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞、組織細(xì)胞浸潤(rùn),有時(shí)還散在大量的多核巨細(xì)胞。淋巴細(xì)胞減少,淋巴結(jié)基質(zhì)常增生或有嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)。淋巴濾泡有由組織細(xì)胞、類上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、多核巨細(xì)胞、嗜酸性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞集聚形成的肉芽腫。其他組織有廣泛的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、組織細(xì)胞浸潤(rùn)。4病毒的分離和鑒定4.1材料表面4.1.1d+氨基葡萄糖溶液1640營(yíng)養(yǎng)液,犢牛血清,青霉素(1×105μg/mL)與鏈霉素(1×105μg/mL)溶液,氯仿,300mmol/LD(+)氨基葡萄糖,Hank’s平衡鹽溶液。4.1.2細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)PCV污染的豬腎傳代細(xì)胞PK-15。4.1.3組織病理學(xué)檢查在發(fā)病早期,無(wú)菌采取病豬血清。對(duì)病死豬立即采取肺、扁桃體、淋巴結(jié)、脾、腎、肝等組織數(shù)小塊,置冰瓶?jī)?nèi)立即送檢或置于-25℃~-30℃冰箱中待檢,或加500mL/L甘油生理鹽水,4℃保存送檢。4.1.4重組菌rpmi140若樣品經(jīng)PCR檢測(cè)為PCV陽(yáng)性,血清可直接使用;肺、淋巴結(jié)、扁桃體、脾、腎、肝等組織混合剪碎后研磨成糊狀,加入含1×105μg/mL鏈霉素、1×105μg/mL青霉素、200μg/mL兩性霉素B的RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液,制成100g/L懸液,-20℃反復(fù)凍融3次或-70℃凍融1次,2000g離心30min。吸取上清液,轉(zhuǎn)移到新的離心管中,每1mL上清加入50μL氯仿,室溫下不斷搖混10min,1000g離心10min。懷疑有細(xì)菌污染的樣品,也可用0.2μm微孔濾膜過(guò)濾處理。取上清,注意避免吸出氯仿,分裝,-70℃保存。4.2方法4.2.1重組病毒細(xì)胞的培養(yǎng)取2mL上清液加到18mLPK-15細(xì)胞懸液中,細(xì)胞濃度為5×104/mL,培養(yǎng)液用含100mL/L犢牛血清和10g/L雙抗的RPMI1640。將12mL病毒細(xì)胞混合懸液分裝到2個(gè)25cm2(T25)通氣的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,每瓶6mL。其余6mL加入裝有直徑15mm蓋玻片的55mm圓形有蓋平皿中,于37℃50mL/LCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染d+氨基葡萄糖制備接種后18~24h長(zhǎng)成50%~60%的單層細(xì)胞,傾去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液,加入2~3mL預(yù)熱的300mmol/LD(+)氨基葡萄糖,以能覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn),于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)作用30min。去除氨基葡萄糖,以Hank’s液沖洗2~3次,加入含20mL/L血清的維持液,放回培養(yǎng)箱。4.2.3鉻染色繼續(xù)培養(yǎng)48h后,用間接免疫熒光法對(duì)平皿中的玻片培養(yǎng)物進(jìn)行染色,以監(jiān)控病毒生長(zhǎng)。4.2.4細(xì)胞懸液制備取1個(gè)T25瓶反復(fù)凍融3次。用胰酶消化另一個(gè)T25瓶?jī)?nèi)細(xì)胞,加21mL生長(zhǎng)液懸浮,再加入第1瓶中的細(xì)胞懸液6mL,取15mL接到1個(gè)75cm2(T75)瓶,6mL接到1個(gè)T25瓶,6mL接種到有蓋玻片的平皿中。4.2.5疫熒光染色培養(yǎng)72~96h后取平皿中玻片進(jìn)行免疫熒光染色,觀察病毒生長(zhǎng)情況。將T25瓶反復(fù)凍融3次,接種到T75瓶?jī)?nèi),繼續(xù)傳代。取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行PCR檢測(cè)。4.3評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)在第1代培養(yǎng)時(shí),若IFA檢測(cè)為陰性應(yīng)繼續(xù)盲傳,第3代培養(yǎng)IFA、PCR檢測(cè)為陽(yáng)性,則判定為PCV分離陽(yáng)性;否則判定為陰性。5聚合酶鏈反應(yīng)pcr5.1材料和方法5.1.1k、無(wú)水乙醇Tris飽和酚、氯仿、100g/LSDS、50μg/mL蛋白酶K、無(wú)水乙醇或異丙醇、3mol/LpH5.2醋酸鈉、750mL/L乙醇;TaqDNA聚合酶、2.5mmol/LdNTP、10倍緩沖液、滅菌去離子水、特異性引物、標(biāo)準(zhǔn)DNAMarker、上樣緩沖液。5.1.2dna的提取取病豬脾、淋巴結(jié)、肝、腎組織病料,剪碎加入適量生理鹽水研磨制成組織勻漿,反復(fù)凍融3次,3000g離心20min,吸取上清用于提取DNA。發(fā)病豬的全血和血清可直接用于提取DNA進(jìn)行檢測(cè)。5.1.3u3000添加不同溶劑取500μL組織凍融上清、全血或血清加入25μL100g/LSDS,5μL蛋白酶K,振蕩混合數(shù)次,置37~56℃水浴鍋中2~3h,其間振蕩混合幾次。酚抽提:每管中加入200μL酚,顛倒混合30s,12000r/min離心10min,吸取上層水相,轉(zhuǎn)移到新管。酚/氯仿抽提:每管分別加入100μL酚和100μL氯仿,顛倒混合30s,12000r/min離心10min。吸取上層水相,轉(zhuǎn)移到新管,并標(biāo)記。氯仿抽提:再分別加入200μL氯仿,顛倒混合30s,12000r/min離心10min。吸取上層水相,轉(zhuǎn)移到新管,并標(biāo)記。每管中加入2.5倍無(wú)水乙醇,1/10體積的3mol/LpH5.2NaAc,混合,-20℃沉淀2h或過(guò)夜?；蛎抗苤屑尤氲润w積的異丙醇,1/10體積的3mol/LpH5.2NaAc,混合數(shù)次,室溫下沉淀20~30min。13000r/min離心10~15min,倒掉管內(nèi)液體,在濾紙上吸干,不要求完全干燥。每管中加入100~200μL700mL/L的乙醇,12000r/min離心5min。倒掉管內(nèi)液體,在濾紙上吸干,放入37℃溫箱烘干。加20~40μL滅菌水溶解沉淀,反復(fù)吹打,促使其溶解。5.1.4引物、模板dnaPCR反應(yīng)液應(yīng)在冰上配制,采用50μL反應(yīng)體系:5U/μLTaqDNA聚合酶0.4~0.5μL,10×緩沖液5μL,4×dNTP(各2.5mmol/μL)4μL,引物1(10pmol/μL)2μL,引物2(10pmol/μL)2μL,加滅菌水至50μL,再加模板DNA5μL。PCV的特異性引物序列:能擴(kuò)增PCV1和PCV2,擴(kuò)增片段938bp。P1:5′-GTCTTCTTCTGCGGTAACGCCTCC-TTG-3′P2:5′-TAGGAGGCTTCTACAGCTGGGAC-AG-3′PCV2型特異性引物序列:擴(kuò)增片段為490bp。P3:5′-ATTGTAGTCCTGGTCGTATATAC-TGT-3′P4:5′-CTCCCGCACCTTCGGA-3′PCR反應(yīng)條件:95℃5min,94℃1min,52℃1min,72℃1min,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),然后72℃延伸10min。取5μLPCR產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。5.2pcv1陽(yáng)性檢測(cè)PCR產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,擴(kuò)增出938bp和490bp的2條帶可判為PCV2陽(yáng)性。只擴(kuò)增出1條938bp的條帶可判為PCV1陽(yáng)性。同時(shí)應(yīng)設(shè)正常PK-15細(xì)胞DNA和水陰性對(duì)照,對(duì)照不能擴(kuò)增出任何條帶。PCV1陽(yáng)性DNA的陽(yáng)性對(duì)照可擴(kuò)增出1條938bp的條帶,PCV2陽(yáng)性DNA的陽(yáng)性對(duì)照可擴(kuò)增出938bp和490bp的2條帶。6間接免疫燈試驗(yàn)ifa6.1材料表面6.1.1分離的血清兔抗豬異硫氰酸熒光黃(FITC)結(jié)合物、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清,均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所疫病診斷與流行病學(xué)中心提供。6.1.2保存液透明采集被檢豬血液,分離血清,血清必須新鮮、透明、不溶血、無(wú)污染,密裝于滅菌小瓶?jī)?nèi),4℃或-30℃冰箱保存或立即送檢。試驗(yàn)前將被檢血清統(tǒng)一編號(hào),并用PBS液做20倍稀釋。6.2方法6.2.1pbs法吸水紙液取IFA診斷反應(yīng)板,編號(hào),棄去板中的乙醇溶液,置超凈工作臺(tái)中風(fēng)干,每孔加100μLPBS洗滌1次,棄去PBS液并在吸水紙上輕輕拍干。6.2.2標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清和空白對(duì)照對(duì)血在編號(hào)對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)加入20倍稀釋的被檢血清:同一排相鄰的感染細(xì)胞孔2個(gè)及其后感染細(xì)胞孔1個(gè),每孔100μL,同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清及空白對(duì)照,空白對(duì)照用PBS液代替血清。置37℃恒溫箱中感作45min。6.2.3洗過(guò)棄去板中血清,用PBS液洗板3次,每孔100μL,每次5min,最后在吸水紙上輕輕拍干。6.2.4添加熒光抗體每孔加入工作濃度的兔抗豬FITC結(jié)合物50μL,在37℃恒溫箱中感作45min。6.3感染細(xì)胞孔的特異性熒光熒光顯微鏡采用藍(lán)紫光(激發(fā)濾板通常用BG12,吸收濾板用OG1或GG9),在5~10倍目鏡下檢查。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照中感染細(xì)胞孔(P·V+)應(yīng)出現(xiàn)典型的特異性熒光,而未感染細(xì)胞孔(P·V-)不應(yīng)出現(xiàn)特異性熒光;標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照、空白對(duì)照中感染細(xì)胞孔(N·V+)和未感染細(xì)胞孔(N·V-)均不應(yīng)出現(xiàn)特異性熒光;被檢血清對(duì)照中未感染細(xì)胞孔(C·V-)不應(yīng)出現(xiàn)特異性熒光。被檢血清樣品感染細(xì)胞孔(N·V+)出現(xiàn)特異性、胞漿亮綠色熒光者判為陽(yáng)性;否則,判為陰性。7間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)間接elisa7.1材料表面7.1.1工作濃度iggPCV抗原和正常細(xì)胞對(duì)照抗原:由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所疫病診斷與流行病學(xué)中心提供。使用前按說(shuō)明書規(guī)定用抗原稀釋液稀釋至工作濃度;兔抗豬IgG辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物(簡(jiǎn)稱酶標(biāo)抗體):由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所疫病診斷與流行病學(xué)中心提供。使用前按說(shuō)明書規(guī)定用血清稀釋液稀釋至工作濃度;PCV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清:由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所疫病診斷與流行病學(xué)中心提供。使用前按說(shuō)明書規(guī)定用血清稀釋液稀釋至工作濃度;抗原稀釋液、血清稀釋液、洗滌液、封閉液、底物溶液、終止液等為自行配制。7.1.2保存或作為檢驗(yàn)溶劑采集被檢豬血液分離血清,血清必須新鮮、透明、不溶血、無(wú)污染,裝于滅菌小瓶?jī)?nèi),4℃或-30℃冰箱保存或立即送檢。試驗(yàn)前將被檢血清統(tǒng)一編號(hào),并用血清稀釋液做20倍稀釋。7.2方法7.2.1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照孔和陰性血清對(duì)照孔取96孔平底微量反應(yīng)板,于奇數(shù)列加工作濃度的病毒抗原,偶數(shù)列加工作濃度的對(duì)照抗原,設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照孔和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照孔,每孔100μL,封板,置濕盒內(nèi)于37℃恒溫箱中感作60min,再移置4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。7.2.2洗板棄去板中包被液,加洗滌液洗板,每孔300μL,洗滌3次,每次2min,在吸水紙上輕輕拍干。7.2.3封閉每孔加入封閉液100μL,封板后置濕盒內(nèi)37℃恒濕箱感作2h。同前法洗滌。7.2.4標(biāo)準(zhǔn)陰性血清反應(yīng)板編號(hào)后,對(duì)號(hào)加入經(jīng)稀釋的被檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。每份血清各加2個(gè)病毒抗原孔和2個(gè)對(duì)照抗原孔,孔位相鄰。每孔加樣量均為100μL;封板,置濕盒內(nèi)于37℃恒溫箱中感作15min,同前法洗滌。7.2.5酶標(biāo)記抗體每孔加工作濃度的酶標(biāo)抗體100μL,封板,置濕盒內(nèi)于37℃恒溫箱中感作2h。同前法洗滌。7.2.6剩余產(chǎn)品每孔加入新配制的底物溶液100μL,封板,于37℃恒溫箱中感作30min。7.2.7加入最終溶液每孔添加終止液100μL終止反應(yīng)。7.3測(cè)定和計(jì)算光密度d490nm的值7.3.1被檢血清s與病毒抗原v反應(yīng)的均值nvd490nm按下式分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和被檢血清與2個(gè)平行抗原孔反應(yīng)的D490nm值的平均值。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(P)與病毒抗原(V)反應(yīng)的均值P·V(D490nm)按式(1)計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(P)與對(duì)照抗原(C)反應(yīng)的均值P·C(D490nm)按式(2)計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(N)與病毒抗原(V)反應(yīng)的均值N·V(D490nm)按式(3)計(jì)算。被檢血清(S)與病毒抗原(V)反應(yīng)的均值S·V(D490nm)按式(4)計(jì)算。被檢血清(S)與對(duì)照抗原(C)反應(yīng)的均值S·C(D490nm)按式(5)計(jì)算。P·V(D490nm)=[A1(D490nm)+B1(D490nm)]/21)P·C(D490nm)=[A2(D490nm)+B2(D490nm)]/22)N·V(D490nm)=[C1(D490nm)+D1(D490nm)]/23)S·V(D490nm)=[E1(D490nm)+F1(D490nm)]/2(以S1血清為例)4)S·C(D490nm)=[E1(D490nm)+F1(D490nm)]/2(以S1血清為例)5)S/P=[S·V(D490nm)-S·C(D490nm)]/[P·V(OD490nm)-P·C(D490nm)]6)7.3.2根據(jù)等式6，檢測(cè)血清d490nm值的s/p值的差值7.4試驗(yàn)結(jié)果判定P·V(D490nm)與N·V(D490nm)的比值大于或等于1.5時(shí),才可進(jìn)行結(jié)果判定。否則,本次試驗(yàn)無(wú)效。S/P比值小于0.4,判定為PCV抗體陰性,記作間接ELISA(-);S/P比值大于或等于0.4,小于1.5,判定為可疑,記作間接ELISA(±);S/P比值大于或等于1.5,判定為PCV抗體陽(yáng)性,記作間接ELISA(+)。8免疫組織化學(xué)試驗(yàn)ihs8.1材料表面8.1.1抗體、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清PCV抗原和正常細(xì)胞對(duì)照抗原:由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所疫病診斷與流行病學(xué)中心提供。使用前按說(shuō)明書規(guī)定用抗原稀釋液稀釋至工作濃度;兔抗豬IgG辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物(簡(jiǎn)稱酶標(biāo)抗體):由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究疫病診斷與流行病學(xué)中心提供。使用前按說(shuō)明書規(guī)定用血清稀釋液稀釋至工作濃度;PCV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清:由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所疫病診斷與流行病學(xué)中心提供,使用前按說(shuō)明書規(guī)定用血清稀釋液稀釋至工作濃度;PBS緩沖液(pH7.2~7.4)、0.5mol/LEDTA緩沖液(pH8.0)、1mol/LTBS緩沖液(pH8.0)、4g/L胃蛋白酶液、30mL/L甲醇-H2O2溶液、抗原修復(fù)液(1mmol/L的EDTA緩沖液,pH8.0)均為本實(shí)驗(yàn)室制備。8.1.2樣品無(wú)菌采集被檢豬組織病料(組織應(yīng)新鮮、無(wú)污染),立即放入100mL/L甲醛溶液中,或立即保存于-20℃。8.2方法8.2.1切準(zhǔn)備組織病料按常規(guī)方法制成石蠟切片。8.2.2脫蠟石蠟切片經(jīng)二甲苯瞬間脫蠟,先后浸入9