蒙古櫟促萌植株的誘導(dǎo)與再生

蒙古櫟促萌植株的誘導(dǎo)與再生

蒙古橡樹屬于浮葉樹，也被稱為橡樹。它主要分布在中國東北、華北和西北部，也被稱為中國中部和南部的一些地區(qū)。它是中國東北次落葉落葉林的主要樹種和主要材料。蒙古櫟木材堅(jiān)硬耐腐,紋理美觀,是優(yōu)質(zhì)的經(jīng)濟(jì)用材;枝條發(fā)熱量高,是很好的薪炭材;種子富含淀粉,樹皮、殼斗含鞣質(zhì),可以提煉多種工業(yè)原料;葉片可飼蠶和飼養(yǎng)動(dòng)物,屑材、鋸末、木段可培養(yǎng)食用菌。蒙古櫟根系發(fā)達(dá),適應(yīng)性強(qiáng),抗風(fēng),有很好的抗蝕、護(hù)坡、涵養(yǎng)水源和保持水土的作用。蒙古櫟主要靠種子繁殖,但通過種子進(jìn)行有性繁殖,后代變異性大,優(yōu)良性狀難以保持;其次,蒙古櫟種子極易受到象鼻蟲的侵害,導(dǎo)致其種子質(zhì)量低;另外,蒙古櫟結(jié)實(shí)量存在明顯的大小年現(xiàn)象,且其種子為頑拗性種子,貯藏困難。上述原因在很大程度上制約了蒙古櫟的開發(fā)利用。無性繁殖是林木繁殖的重要技術(shù)措施,但蒙古櫟莖枝扦插極為困難,有人對(duì)蒙古櫟的組織培養(yǎng)進(jìn)行了探討,認(rèn)為蒙古櫟可以通過微繁技術(shù)進(jìn)行繁殖。該試驗(yàn)以蒙古櫟促成培養(yǎng)得到的萌生莖段為外植體,研究不同種類的基本培養(yǎng)基、不同濃度的外源激素及其配比對(duì)蒙古櫟器官發(fā)生及植株再生的影響,以期為蒙古櫟組織培養(yǎng)技術(shù)體系的建立提供參考。1材料和方法1.1生蒙古櫟母樹葉片的制備供試蒙古櫟枝條取自遼寧省本溪市小市林場樺皮峪管護(hù)區(qū),采集于2012年3月,選取生長健壯無病蟲害的10a生蒙古櫟母樹,剪取直徑3~5cm、長度50cm左右的枝條,用保鮮膜覆蓋在枝條截面處,并用線繩綁好,防止水分蒸發(fā)。然后將枝條放置于培養(yǎng)基質(zhì)(沙與土的比例為1∶1)中,在溫室環(huán)境下培養(yǎng),經(jīng)過4周后,萌發(fā)枝長至10~15cm時(shí),去除葉片,剪取2~3cm帶芽莖段作為外植體。1.2測試方法1.2.1浸泡、沖洗將帶芽莖段的腋芽處用毛筆蘸吐溫20擦拭,然后將莖段置流水中沖洗2h,之后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)。在無菌環(huán)境下,用70%酒精浸泡30s,無菌水沖洗3次;接著用0.1%的升汞分別消毒1、3、5min,在此過程中用鑷子攪動(dòng)莖段,使之與升汞充分接觸,之后用無菌水沖洗4~5次,剪成2~3cm長的莖段備用。1.2.2ms/wpm法將消毒后的外植體在無菌條件下,用無菌濾紙吸干水分,切去兩端將其接種在初代培養(yǎng)基上。每處理30個(gè)莖段,3次重復(fù)。(1)以MS和WPM及1/2MS為基本培養(yǎng)基,附加0.2mg/L6-BA和0.5mg/L2,4-D。(2)以WPM為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度(0.1、0.5、1.0mg/L)的6-BA及不同濃度(0.1、0.5、1.0mg/L)的2,4-D。1.2.3增殖培養(yǎng)培養(yǎng)待誘導(dǎo)出的芽萌長至2cm長時(shí),將其切下并轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。以WPM為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度(0.1、0.5、1.0mg/L)的NAA及不同濃度(0.5、1.0、2.0mg/L)的6-BA。1.2.4不同濃度的naa和iga的生根率觀察將生長健壯的不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。以1/2MS為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度(0.1、0.5、1.0mg/L)的NAA和不同濃度的IBA(0.1、0.5mg/L)。28d后觀察生根率。以上培養(yǎng)基均加入蔗糖30g/L、瓊脂6.5g/L,為防止褐化,在所有培養(yǎng)基中加入0.5g/L的PVP,調(diào)整pH至5.8,培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,光照強(qiáng)度2000~3000lx,光照周期為16h/d。1.3外植體數(shù)及生根率定期觀察蒙古櫟促萌莖段生長狀況并記錄拍照,計(jì)算以下主要統(tǒng)計(jì)指標(biāo):誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%,成活率(%)=成活外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%,污染率(%)=污染的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%,褐化率(%)=褐化的莖段數(shù)/外植體數(shù)×100%,不定芽增殖系數(shù)=不定芽數(shù)/外植體數(shù),生根率(%)=生根苗數(shù)/該生根處理總苗數(shù)×100%。各項(xiàng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析。2結(jié)果與分析2.1污染率對(duì)蒙古櫟死亡率的影響由表1可知,消毒1min與3、5min對(duì)于不定芽的污染率和成活率差異顯著,但消毒1min與3min對(duì)于不定芽的褐化率影響差異不顯著。0.1%升汞消毒1min,褐化死亡率最小,但由于消毒時(shí)間較短,外植體污染率較高;消毒5min,蒙古櫟萌發(fā)枝莖段污染率最低,但褐化死亡現(xiàn)象也相對(duì)最為嚴(yán)重,外植體成活率最低;消毒3min的外植體成活率最高,21d后多數(shù)腋芽生長健壯,可萌發(fā)至2.0~2.5cm,其污染率與褐化率都相對(duì)較低,因此0.1%升汞消毒3min為最佳消毒時(shí)間。2.2外植體生長規(guī)律由表2可知,3種基本培養(yǎng)基上叢生芽誘導(dǎo)率由大到小依次為WPM培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基。接種在WPM培養(yǎng)基上的莖段腋芽伸長生長明顯優(yōu)于MS及1/2MS培養(yǎng)基,產(chǎn)生的叢生芽也最多。外植體接種至WPM培養(yǎng)基7d后,腋芽開始萌動(dòng),然后陸續(xù)展葉生長伸長,21d后開始有不定芽萌發(fā),植株生長健壯。接種在MS及1/2MS培養(yǎng)基上的外植體在10d后也開始萌動(dòng),并有愈傷組織產(chǎn)生,但隨后生長緩慢,且葉片較小,生長勢頭較弱。因此,WPM培養(yǎng)基為蒙古櫟叢生芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。2.3叢生芽生長情況由表3可知,在9種不同激素濃度處理中,6-BA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L組合對(duì)于蒙古櫟叢生芽誘導(dǎo)效果最佳,誘導(dǎo)率可達(dá)76.7%,平均芽長可達(dá)到2.4cm(圖1)。6-BA及2,4-D的濃度過高或過低都會(huì)降低叢生芽的誘導(dǎo)率,并且不利于叢生芽的伸長。當(dāng)6-BA及2,4-D濃度過小時(shí),叢生芽生長緩慢,葉片細(xì)小,展葉狀況不佳,叢生芽纖細(xì),生長勢較弱,平均芽長僅為0.6cm;而當(dāng)6-BA及2,4-D的濃度過高時(shí),也會(huì)抑制叢生芽的生長,當(dāng)2,4-D濃度達(dá)到1.0mg/L時(shí),在莖段周圍會(huì)產(chǎn)生一定數(shù)量的愈傷組織,影響其正常展葉。2.4提高6-ba的濃度由表4可知,在WPM培養(yǎng)基中添加0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA為最佳激素組合,增殖系數(shù)可達(dá)到3.5,平均芽長為3.7cm(圖2)。隨著6-BA濃度的增加,芽的增殖呈現(xiàn)增長趨勢,以2.0mg/L時(shí)達(dá)到最大值,芽長也隨之增長。6-BA作為有效的細(xì)胞分裂素,具有良好的誘導(dǎo)芽形成的能力,因此在增殖培養(yǎng)過程中,提高其濃度,有利于形成較多數(shù)量的叢生芽。在對(duì)櫟屬植物組織培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn),過高的6-BA濃度對(duì)于莖芽的增殖具有抑制作用,該試驗(yàn)未觀察到此現(xiàn)象,這可能與櫟屬樹種間存在差異有關(guān)。NAA作為被廣泛應(yīng)用的生長素,可以促進(jìn)叢生芽的伸長生長。當(dāng)NAA濃度較低時(shí),叢生芽莖干細(xì)弱,葉片窄小黃化,隨著NAA濃度增加至0.5mg/L,芽長伸長明顯,叢生芽生長健壯,當(dāng)NAA濃度達(dá)到1.0mg/L時(shí),外植體仍能保持較高增殖系數(shù),但平均芽長較短,外植體較為弱小,6-BA與NAA的交互作用影響了叢生芽的增殖效果。2.5naa與ipa的濃度對(duì)蒙古櫟生根的影響由表5可知,添加了0.1mg/LIBA+0.5mg/LNAA的1/2MS培養(yǎng)基為蒙古櫟莖段的最佳生根培養(yǎng)基,生根率達(dá)到76.7%,每個(gè)單株的平均根數(shù)可以達(dá)到4.3條(圖3)。隨著NAA濃度增加,生根率先增加后減小,表明較高的NAA濃度會(huì)抑制生根。IBA濃度增加對(duì)于蒙古櫟的生根效果影響并不顯著。在處理2中,接入培養(yǎng)基的無菌苗7d后開始誘導(dǎo)出根,根系粗壯,植株生長正常,葉片呈綠色,28d后形成較為完整的根系。而隨著生長素濃度增加,莖段基部形成較大的愈傷組織,但分化出的根系較少,且較為細(xì)弱,植株生長狀況較差,葉片發(fā)黃脫落,難以進(jìn)行練苗移栽。3討論和結(jié)論3.1發(fā)枝暴露的消毒要建立蒙古櫟的組織培養(yǎng)體系,植物材料的消毒至關(guān)重要。由于該試驗(yàn)采用的外植體為蒙古櫟枝條沙培后萌生的嫩枝,所以萌發(fā)枝暴露在空氣中的時(shí)間較短,外源雜菌較少,故該試驗(yàn)中設(shè)置的消毒時(shí)間較短,在保證將材料上附著的微生物殺死的同時(shí)避免損傷外植體,以確保無菌體系的建立。該試驗(yàn)研究表明,最適宜的外植體消毒方法為將帶芽莖段放在流水下沖洗2h,然后再無菌條件下用70%酒精浸泡30s,無菌水沖洗3次;接著用0.1%的升汞消毒3min,再用無菌水沖洗4~5次。3.2植物生長調(diào)節(jié)劑基本培養(yǎng)基為植物生長發(fā)育提供所需的各種營養(yǎng)元素,在組織培養(yǎng)中起著至關(guān)重要的作用。該試驗(yàn)對(duì)比了3種基本培養(yǎng)基對(duì)蒙古櫟不定芽誘導(dǎo)的效果,結(jié)果表明WPM的培養(yǎng)效果最好。在WPM培養(yǎng)基中,含有較低濃度的無機(jī)鹽,最利于不定芽的誘導(dǎo),也能有效促進(jìn)芽的增殖,這與何曉蘭等以及Tamta等的研究結(jié)果一致。而MS培養(yǎng)基的鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量都較高,過高的微量元素可能抑制了蒙古櫟叢生芽的分化,因此并不是最適宜的基本培養(yǎng)基。植物生長調(diào)節(jié)劑是組織培養(yǎng)必不可少的添加劑,尤其是細(xì)胞分裂素和生長素。該試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在蒙古櫟初代培養(yǎng)中,添加適量濃度的6-BA和2,4-D,可獲得較多數(shù)量的叢生芽,且芽生長健壯,展葉為綠色。當(dāng)6-BA濃度高達(dá)1.0mg/L時(shí),雖然能獲得較高數(shù)量的叢生芽,但其平均芽長較短,節(jié)間較短,葉面積較小。這與高濃度的6-BA可能抑制節(jié)間伸長有關(guān)。楊鋒利在對(duì)成齡栓皮櫟莖段培養(yǎng)的研究中也發(fā)現(xiàn),過高或過低濃度的6-BA會(huì)引起葉片畸形或玻璃化。高濃度的2,4-D可以促進(jìn)愈傷組織的形成,但并不利于不定芽的誘導(dǎo),該試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)2,4-D濃度過高時(shí),莖段基部會(huì)產(chǎn)生較多白色顆粒狀愈傷組織,包裹在莖段周圍,抑制了叢生芽的增殖和生長。適量濃度的2,4-D與6-BA配合使用,才可能促進(jìn)蒙古櫟不定芽的誘導(dǎo)。細(xì)胞分裂素與生長素的交互作用對(duì)于不定芽誘導(dǎo)影響顯著,因此二者的配比對(duì)于成功誘導(dǎo)不定芽起著至關(guān)重要的作用。3.3不同濃度的生長素對(duì)增殖培養(yǎng)的影響組織培養(yǎng)中用腋芽或不定芽增殖的途徑擴(kuò)大繁殖有利于保持遺傳穩(wěn)定性,而且在培養(yǎng)許多代后仍然保持著旺盛的增殖能力。該試驗(yàn)采用萌發(fā)枝誘導(dǎo)出的不定芽增殖,獲得了較高數(shù)量的叢生芽。植物生長物質(zhì)在增殖培養(yǎng)過程中也起著至關(guān)重要的作用?？紤]到由于2,4-D的適宜用量范圍較狹窄,過量后會(huì)抑制芽的形成,因此該試驗(yàn)在增殖階段采用了作用效果較弱的NAA作為生長素。該試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)6-BA濃度達(dá)到2.0mg/L并且NAA濃度達(dá)到0.5mg/L時(shí),增殖效果最好。因此,可以得出高濃度的細(xì)胞分裂素和低濃度的生長素配合使用,既能提高腋芽的增殖速度,也能保證腋芽的正常生長這一研究結(jié)論,這與曹昆等的研究結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)外植體采用垂直培養(yǎng)方式時(shí),經(jīng)過幾次繼代培養(yǎng)后,外植體的增殖能力明顯下降,而采用水平培養(yǎng)后,莖芽增殖速度可以顯著提高。3.4生根培養(yǎng)方法該試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)以1/2MS為培養(yǎng)基添加0.1mg/LIBA和0.5mg/LNAA,生根效果較為顯著,生根率較高,但是莖段基部均有較大愈傷組織,產(chǎn)生的根為愈傷根,不利于芽的生長,亦不利于