野生與栽培條件下東北山櫻根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異

野生與栽培條件下東北山櫻根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異

土壤中存在大量微生物，其中細(xì)菌種類和數(shù)量最為豐富。細(xì)菌在土壤營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)、有機(jī)物質(zhì)的形成和分解、土壤肥力的保持和提高、生態(tài)環(huán)境的改善、植物的生長(zhǎng)發(fā)育等方面均起著極其重要的作用。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法在分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性上存在著很大的局限性。近幾十年來,變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用到微生物群落多樣性分析和種群監(jiān)視的動(dòng)態(tài)檢測(cè)中,成為微生物群落遺傳多樣性和動(dòng)態(tài)分析的強(qiáng)有力工具。東北山櫻又稱本溪山櫻(CerasussachalinensisKom.),是我國(guó)大連和秦皇島等冷涼櫻桃產(chǎn)區(qū)應(yīng)用的主要砧木之一,但生產(chǎn)中存在抗?jié)承?、抗根癌病能力較差等問題。因此,對(duì)其根際微生物的群落結(jié)構(gòu)的研究有助于分析其根域環(huán)境特性。目前,有關(guān)東北山櫻根際微生物群落結(jié)構(gòu)的研究剛起步,特別是對(duì)野生和人工栽培管理體系下其根際微生物群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的研究尚屬空白。本試驗(yàn)利用PCR-DGGE技術(shù)研究野生和栽培東北山櫻表層和根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的特征以及野生東北山櫻根際與其周圍優(yōu)勢(shì)植物根際之間細(xì)菌多態(tài)性的差異,為揭示東北山櫻根域環(huán)境特性和為其根系適應(yīng)性評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。1材料和方法1.1土壤條件及生長(zhǎng)結(jié)果性狀野生東北山櫻土壤樣品采集區(qū)位于遼寧省本溪市連山關(guān)鎮(zhèn)山區(qū)(N41°24′,E124°17′),海拔512～546m,坡度20～45°。氣候?qū)儆诒睖貛駶?rùn)氣候區(qū),全年降水量800～900mm,年平均溫度6.1～7.8℃,全年無霜期156～172d,土壤為棕壤土。野生東北山櫻生長(zhǎng)結(jié)果性狀良好,隨機(jī)分布。周圍優(yōu)勢(shì)植被為柞樹(Quercusmongolica)。栽培東北山櫻土壤樣品采集區(qū)位于遼寧省沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹試驗(yàn)基地(N41°48′,E123°25′),海拔50～60m,屬于受季風(fēng)影響的濕潤(rùn)和半濕潤(rùn)溫帶大陸性氣候,全年降水量530～680mm,年平均氣溫7.0～7.9℃,全年無霜期約153d,土壤為粘壤土。栽培東北山櫻為5年生幼樹,生長(zhǎng)良好,株距1m。1.2樣品采集和處理于2008年8月上旬進(jìn)行采樣。選取實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)生長(zhǎng)健壯的東北山櫻(野生6株,栽培3株),分別在距離主干0.5～1.0m處,除去地表覆蓋物并鏟除表層1cm土壤,然后向下取深度1～5cm范圍內(nèi)的土壤樣品為表層土,深度約30cm(根系集中分布區(qū))且貼近根系直徑5mm范圍內(nèi)的土壤樣品為根際土。按相同方法采集柞樹根際土壤,以同一山坡上無樹木生長(zhǎng)的土樣為對(duì)照土壤(ck)。編號(hào)裝入無菌的自封袋中,標(biāo)明采樣時(shí)間、地點(diǎn)及土樣號(hào)。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室,過2mm的土壤篩后,放在-70℃保存?zhèn)溆?。用于東北山櫻表層土和根際土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析的土壤樣品為野生和栽培東北山櫻表層土和根際土各自混勻后樣品,記作WT、WR、CT和CR;用于野生東北山櫻與周圍其他優(yōu)勢(shì)植被根際土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異研究的土壤樣品為距離最近的野生東北山櫻和柞樹(各1株)的根際土,記作Cs和Qm。土壤樣品及其基本理化性質(zhì)見表1。1.3sds-pcr法提取過程參照Z(yǔ)hou等的方法并略加改進(jìn)。稱取0.5g土壤樣品于2mL離心管中,加入1000μLDNA提取buffer(pH8.0100mmol/LTris-HCl,pH8.0100mmol/LEDTA,100mmol/LpH8.0sodiumphosphate,1.5mol/LNaCl,1%CTAB),于-65～65℃反復(fù)凍融3次,每次10min,1.2萬(wàn)r/min,室溫離心10min。以下步驟分2部分進(jìn)行:(1)上清液加入0.2倍體積KAC(8mol/L),冰浴20min,1.4萬(wàn)r/min,10℃離心20min。取上清,加入0.5倍體積PEG(20%)和0.1倍體積NaCl(5mol/L),混勻后室溫放置1h,1.4萬(wàn)r/min,室溫離心10min。棄去上清,加入500μL70%乙醇浸泡,置于4℃冰箱。(2)沉淀部分加入800μLDNA提取buffer,攪勻,加入50μL溶菌酶(100mg/mL),旋振混勻,于37℃振蕩溫浴1h,加入200μL20%SDS,手動(dòng)旋勻后65℃水浴處理30min,每隔10min上下振蕩一次;1.2萬(wàn)r/min,室溫離心10min。取上清,加入0.2倍體積KAC(8mol/L),冰浴20min,1.4萬(wàn)r/min,10℃離心20min。取上清,加入0.5倍體積PEG(20%)和0.1倍體積NaCl(5mol/L),混勻后室溫放置1h,1.4萬(wàn)r/min,室溫離心10min。棄去上清,加入500μL70%乙醇浸泡10min。(3)將按“(1)”和“(2)”方法處理的乙醇浸泡后產(chǎn)物分別吹洗,1.4萬(wàn)r/min,室溫離心10min,吸凈乙醇后自然干燥20min,分別加入450μLTE溶解,合并。加入等體積的V(飽和酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1,充分混勻,1.2萬(wàn)r/min,室溫離心10min,取水相,再加入等體積的V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1抽提一遍,1.2萬(wàn)r/min,室溫離心10min。取水相上清,加入0.1倍體積的NaAC(3mol/L)溶液和0.6倍體積的異丙醇,混勻后于室溫靜置沉淀1h,1.4萬(wàn)r/min,室溫離心10min。棄上清,沉淀用500μL70%乙醇洗滌,1.4萬(wàn)r/min,室溫離心10min,吸凈乙醇后自然干燥20min,50μLTE溶解DNA,-20℃下保存。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量,粗提DNA樣品用博大泰克(BioDev,Beijing)試劑盒進(jìn)行純化。1.4cccgcccccc-ccptcaatct-35-ccrtmact以細(xì)菌總DNA為模板,用細(xì)菌通用引物341fGC和907r進(jìn)行擴(kuò)增,上游引物5′端有40bpGC夾。其序列分別為(5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3′)和(5′-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′),由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)使用PTC-200PCR儀(Bio-Rad),反應(yīng)體系為50μL,反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min;95℃1min,60℃退火1min,每個(gè)循環(huán)下降1℃,循環(huán)10次;95℃1min,50℃1min,72℃2min,循環(huán)20次;72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)果用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。1.5dage分析采用DcodeTM(Bio-RadLaboratoriesInc,USA)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。采用6%聚丙烯酰胺凝膠,制備變性劑濃度為30%～60%。PCR產(chǎn)物每孔加樣40μL,在60℃恒溫,180V電壓,1×TAE中電泳6h。電泳結(jié)束后,使用GeneFinder(BIO-V)染料將凝膠染色30min。利用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。1.6細(xì)菌群落分析所得DGGE圖譜采用QuantityOne(Bio-RadLaboratoriesInc,USA)軟件進(jìn)行處理。利用DGGE圖譜的數(shù)字化結(jié)果計(jì)算土壤樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)。多樣性指數(shù)用H表示,H=-∑(PilnPi),其中Pi=ni/N,ni為某個(gè)帶的峰強(qiáng)度,N為該帶所在泳道的所有帶峰強(qiáng)度之和。均勻度指數(shù)用J表示,J=H/lnS,其中S為樣品的條帶數(shù)。2結(jié)果與分析2.1東北山橡草原區(qū)土壤細(xì)菌群落分布特征通過對(duì)野生與栽培條件下東北山櫻的表層和根際土壤細(xì)菌群落分子多樣性的分析,土壤細(xì)菌的DGGE指紋圖譜及其聚類分析如圖1和圖2所示。由圖1可知,4個(gè)泳道中條帶數(shù)量和亮度均存在一定的差異,野生與栽培2種生長(zhǎng)環(huán)境的根際土壤細(xì)菌條帶數(shù)均高于表層土,多樣性指數(shù)(H)和均勻度指數(shù)(J)也存在相同規(guī)律(表2),且細(xì)菌多樣性以栽培根際土壤最高(H=2.552),均勻度以野生根際土壤最高(J=0.996)。可見,無論栽培條件還是野生條件,東北山櫻根際土壤細(xì)菌群落多樣性都高于表層土,栽培土壤的細(xì)菌多樣性高于野生土壤,但均勻度低,說明野生的東北山櫻根際細(xì)菌群落平衡,不易受外界環(huán)境影響。另外,野生和栽培條件下的東北山櫻根際具有各自的特有細(xì)菌類型,條帶8為野生土壤特有,條帶7和11為栽培土壤特有,其余條帶為4個(gè)樣品共有。野生與栽培東北山櫻表層和根際土壤細(xì)菌DGGE指紋圖譜的聚類分析(UPGMA)表明(圖2),4個(gè)土壤樣品共分為兩大族群,WT和WR聚為一種族群,CT和CR聚為另一種族群,相似性分別為81%和82%,而野生與栽培兩種環(huán)境的相似性為77%。說明生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)影響較大,相同生長(zhǎng)環(huán)境下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性高,不同生境下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性相距較遠(yuǎn)。2.2條帶及均勻度指數(shù)對(duì)原始生境中東北山櫻與對(duì)照和其他相鄰優(yōu)勢(shì)植物的根際土壤細(xì)菌群落特征分別進(jìn)行分析,土壤細(xì)菌的DGGE指紋圖譜及其聚類分析如圖3～4所示。由圖3可知,3個(gè)泳道中條帶數(shù)量和亮度均存在一定的差異,對(duì)照土壤細(xì)菌條帶數(shù)最多,其次為柞樹根際土,東北山櫻根際土細(xì)菌條帶數(shù)最少。其中條帶1、2、3、6、7、8、10、11為3個(gè)樣品共有,條帶5、9、14、15為對(duì)照和柞樹共有,而條帶4和12為東北山櫻特有,條帶13為對(duì)照特有。從表3也可看出,各土壤樣品的多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)也存在相似規(guī)律(表3),其中對(duì)照的多樣性指數(shù)比東北山櫻高10.45%。可見,東北山櫻在野生條件下根際細(xì)菌群落多樣性低于沒有樹木生長(zhǎng)的對(duì)照土壤和周圍相鄰優(yōu)勢(shì)植物柞樹的根際土壤,而是形成了特有的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。野生東北山櫻與對(duì)照土和其他相鄰植物根際土壤細(xì)菌DGGE指紋圖譜的聚類分析(UPGMA,圖4)表明,3個(gè)土壤樣品共分為兩大族群,ck和Qm聚為一種族群,相似性達(dá)90%,而Cs屬另一種族群,與對(duì)照和柞樹根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性相距甚遠(yuǎn),說明不同植物根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成不同,東北山櫻根系在生長(zhǎng)發(fā)育過程中形成了獨(dú)特的根域環(huán)境,細(xì)菌群落組成與周圍其他優(yōu)勢(shì)植物差異明顯。3細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及根系生長(zhǎng)特性DGGE是一種快速和可靠的檢測(cè)微生物群落結(jié)構(gòu)的分子生物學(xué)方法。本研究利用該技術(shù)對(duì)本溪山區(qū)野生東北山櫻的根區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了首次研究,比較了兩種環(huán)境條件下其表層土和根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異,以及野生東北山櫻與對(duì)照土和其他相鄰植物根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異,初步揭示了東北山櫻根區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成特點(diǎn)。總體而言,生長(zhǎng)環(huán)境、土壤深度和營(yíng)養(yǎng)狀況以及植物類型均對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定影響,其中生長(zhǎng)環(huán)境和植物類型的影響較大,土壤深度的影響較小。Gelsomino等對(duì)兩種粉沙壤土和15種其他土壤的研究表明,相同類型的土壤具有同樣的微生物種群。本研究也證實(shí),相同生長(zhǎng)環(huán)境的東北山櫻根區(qū)土壤細(xì)菌群落相似性較高。其次,大多數(shù)研究表明,不同土壤深度的微生物群落結(jié)構(gòu)不同,夏北成等發(fā)現(xiàn)在不同層次的土壤環(huán)境中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化,Griffiths等對(duì)0～20cm深度土層的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)0～5cm土層微生物的多樣性最高,隨著土層深度的增加微生物多樣性下降。王軼等對(duì)原始闊葉紅松林的研究也表明,根際微生物數(shù)量>非根際微生物數(shù)量,根際效應(yīng)明顯。本試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn),在東北山櫻根系集中分布的深層根際土壤中,細(xì)菌群落的數(shù)量和種類均高于表層土壤。另外,同一生長(zhǎng)環(huán)境下不同植物根區(qū)的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也不同,張歷等通過對(duì)黃瓜(CucumissativusL.)、番茄(LycopersiconesculentumMiller)、金花菜(MedicagohispidaGaertn.)等7個(gè)蔬菜品種根際微生物的研究發(fā)現(xiàn),不同植物有其獨(dú)特的根際微生物群落,無論在數(shù)量上還是種類上都各有其特點(diǎn)。這可能是由于特定植物各自的根系分泌物引起的,根系分泌物的種類決定了根際微生物的種類。所以,即使生長(zhǎng)環(huán)境相同,不同的植物類型也具有不同的根際微生物群落結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果也表明,野生東北山櫻根際細(xì)菌群落多樣性低于沒有樹木生長(zhǎng)的對(duì)照土和周圍相鄰的優(yōu)勢(shì)植物柞樹,且形成了特有的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。固有的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)會(huì)影響植株根系行為及根系分泌物種類,進(jìn)而對(duì)植株的生理代謝過程產(chǎn)生一定的作用。栽培條件下往往因根域環(huán)