無籽西瓜愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生研究

無籽西瓜愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生研究

無核生瓜比普通二倍體西瓜糖含量高，食用方便，耐貯藏，深受人們喜愛。但其制種復(fù)雜,成本高,所得的三倍體無籽西瓜種子中很多胚芽發(fā)育不良,子葉畸形,種皮厚,種子發(fā)芽率低,苗期生長緩慢,這些因素制約了無籽西瓜的生產(chǎn)。西瓜組織培養(yǎng)始于20世紀(jì)70年代,自1979年獲得初步成功以來,國內(nèi)外相繼報道了這方面的研究進(jìn)展,但利用無籽西瓜子葉作為外植體獲得再生植株的報道甚少。為此,我們以無籽西瓜子葉為外植體,研究了通過愈傷組織階段誘導(dǎo)芽及獲得再生植株的培養(yǎng)條件。1材料和方法1.1種子離體培養(yǎng)及植株再生試驗(yàn)選用無籽西瓜品種黑蜜5號為試材,于2002年起在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)園藝學(xué)院組培室進(jìn)行子葉離體培養(yǎng)及植株再生試驗(yàn)。利用鄭先波等報道的方法獲得無籽西瓜無菌苗。1.2一般培養(yǎng)基配方的選擇和實(shí)驗(yàn)方法1.2.1接種法培養(yǎng)暗傳統(tǒng)種以MS為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的6-BA和NAA,共12個處理,各培養(yǎng)基配方見表1。每處理接種10個外植體為1次重復(fù),設(shè)4次重復(fù)。將無籽西瓜無菌苗的子葉切成0.5cm×0.5cm的小塊,放入培養(yǎng)皿中,在溫度為(25±2)℃的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng),7天后移到光周期為16小時光照、8小時黑暗,光照強(qiáng)度為2000lx的培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)。28天后觀察并統(tǒng)計(jì)愈傷組織及芽的誘導(dǎo)情況。1.2.2光照對無籽西瓜模擬芽誘導(dǎo)的效果研究設(shè)光照28天、先黑暗7天再光照21天、先黑暗14天再光照14天、一直在黑暗下28天、先光照7天再黑暗21天5種不同的光周期處理,將芽接種到篩選出的最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,研究光周期對無籽西瓜子葉外植體芽的誘導(dǎo)情況。1.2.3生根培養(yǎng)基上將在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上達(dá)到一定高度的幼芽從基部切斷,然后接種到不同生根培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基,蔗糖15g/L,附加不同濃度的IAA和IBA,共7個組合,不同培養(yǎng)基配方見表2。放在培養(yǎng)條件相同的三角瓶中培養(yǎng),20天后觀察生根情況。2結(jié)果與分析2.1-ba和naa對無籽西瓜子葉芽誘導(dǎo)的效果由表1可看出,12種培養(yǎng)基都成功誘導(dǎo)出了愈傷組織,且6-BA2.0～5.0mg/L范圍內(nèi)愈傷組織的誘導(dǎo)率無明顯差異,而芽的誘導(dǎo)情況則有很大差異,芽誘導(dǎo)率隨6-BA濃度的增加呈上升趨勢,最大誘導(dǎo)率達(dá)20.0%。這說明較高濃度的6-BA對無籽西瓜子葉芽的誘導(dǎo)很有效,但并非6-BA的濃度越高對無籽西瓜子葉芽的誘導(dǎo)越有利,研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)6-BA濃度達(dá)5.0mg/L時,雖然愈傷組織及芽的誘導(dǎo)率與6-BA3.0mg/L差別不大,但誘導(dǎo)的芽出現(xiàn)明顯的畸形或玻璃化,這與任春梅等的研究結(jié)果相似。NAA對無籽西瓜愈傷組織及芽的誘導(dǎo)率則表現(xiàn)出與6-BA相反的趨勢,NAA在0.1～0.3mg/L范圍內(nèi)芽的誘導(dǎo)率隨其濃度的升高而下降。這說明低濃度NAA促進(jìn)芽的生長,高濃度則抑制其生長。在與6-BA的組合中NAA都表現(xiàn)在較低濃度(0.1mg/L)誘導(dǎo)效果較好,其中以MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L效果最佳,因此,選擇此培養(yǎng)基作為無籽西瓜子葉芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。2.2誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)接種后將培養(yǎng)皿一直在光照下培養(yǎng)28天和先光照7天后轉(zhuǎn)移到黑暗下21天都不能誘導(dǎo)出芽,說明光照抑制了無籽西瓜子葉芽的產(chǎn)生。接種后一直在黑暗中培養(yǎng)28天,愈傷組織誘導(dǎo)率為10.0%,只能形成白色雪花狀的愈傷組織不能形成芽。接種后先置于黑暗中7天或14天再轉(zhuǎn)移至光照下均能誘導(dǎo)出愈傷組織,從而在愈傷組織上誘導(dǎo)出芽,愈傷組織誘導(dǎo)率分別為30.0%、27.5%,芽誘導(dǎo)率分別為12.5%、10.0%。此結(jié)果說明無籽西瓜芽的誘導(dǎo)和愈傷組織的誘導(dǎo)一樣都需要在黑暗條件下啟動,進(jìn)一步的生長分化則需要在光照下進(jìn)行。2.3不同濃度對植物葉片生根性能的影響由表2可看出,無籽西瓜子葉誘導(dǎo)的幼芽生根相對較容易,健壯的芽可以在不含任何生根調(diào)節(jié)物質(zhì)的1/2MS中生根,生根率達(dá)37.5%,在加入不同濃度IAA和IBA后,生根效果明顯提高。IBA和IAA的濃度在0.1～0.6mg/L范圍內(nèi),生根率隨著生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度的升高而增加,最高生根率在90%以上,平均根數(shù)也隨之增加,且形成的根生長旺盛,無愈傷組織產(chǎn)生,須根多。因此,可選用1/2MS+IAA0.4mg/L和1/2MS+IBA0.3mg/L為理想的生根培養(yǎng)基。3-ba和naa對5號愈傷組織誘導(dǎo)芽的影響(1)以往的研究表明,6-BA是子葉外植體芽誘導(dǎo)效果最好的生長調(diào)節(jié)物質(zhì),其有效濃度因品種而有所差異,低濃度6-BA(1.0～3.0mg/L)對芽的誘導(dǎo)有良好的促進(jìn)作用,較高濃度(高于3.0mg/L)則對芽的分化有抑制作用,且再生芽多畸形,難以發(fā)育成正常植株。我們研究發(fā)現(xiàn),6-BA在無籽西瓜芽的誘導(dǎo)過程中,起著非常重要的作用,但在較低濃度下(低于2.5mg/L)不能誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生,只有在其濃度達(dá)到2.5mg/L時才有芽的出現(xiàn),最適濃度為3.0mg/L,當(dāng)濃度達(dá)5.0mg/L時芽出現(xiàn)畸形及玻璃化。6-BA與其他生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的組合使用的效果因品種不同而有很大差異。牛愛國等用6-BA與IBA組合以無籽西瓜頂芽為外植體誘導(dǎo)了再生植株。我們則用6-BA與NAA組合從子葉外植體上成功地進(jìn)行了芽的誘導(dǎo),并研究發(fā)現(xiàn),以無籽西瓜黑蜜5號子葉為外植體,通過愈傷組織誘導(dǎo)芽的最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L。(2)研究發(fā)現(xiàn),無籽西瓜接種后直接進(jìn)行光處理,抑制愈傷組織及芽的形成,接種后一直進(jìn)行黑暗處理也不利于芽的產(chǎn)生,只能生成雪花狀的愈傷組織,接種后先在黑暗條件下處理再在光照條件下處理才能誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生。此結(jié)果表明,無籽西瓜芽的產(chǎn)生首先需要黑暗條件的啟動,其進(jìn)一步的生長分化則須在光照下進(jìn)行。此結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了鄭先波等在黑蜜5號愈傷組織誘導(dǎo)上的研究結(jié)果。(3)研究發(fā)現(xiàn),無籽西瓜的幼芽生根相對比較容易,IBA和IAA都能很好