慶大霉素抗體在疫苗研制中的殘留分析

慶大霉素抗體在疫苗研制中的殘留分析

在疫苗的開發(fā)過程中，需要添加過量的抗生素，如清霉素和卡拉霉，以抑制污染細(xì)菌的生長。如果帶入到成品疫苗中抗生素殘留量過高則會導(dǎo)致人的機(jī)體產(chǎn)生異常反應(yīng),如皮膚潮紅、發(fā)癢、心悸、皮疹、呼吸困難,嚴(yán)重者可出現(xiàn)休克或死亡,因此應(yīng)嚴(yán)格控制疫苗中抗生素的殘留。在研制過程中即使通過換洗、純化以及最終超濾等工藝,也很難將抗生素全部清除干凈。文章分別選擇了研制疫苗4個生產(chǎn)階段(原液階段、純化前階段、純化后階段以及成品階段)樣品作為樣本,通過抗生素殘留測定,考察疫苗研制的各階段抗生素的殘留和去除。1材料和方法1.1慶大霉素的殘留采用間接競爭ELISA方法,在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中殘留的慶大霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗慶大霉素抗體,加入酶標(biāo)二抗后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與殘留物慶大霉素的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出該樣本中慶大霉素的殘留量。1.2試驗(yàn)樣本研制的疫苗原液、160×濃縮液、半成品、成品,均由成都生物制品研究所提供。1.3聚苯乙烯離心管XXXXXX公司微孔板酶標(biāo)儀型號:XXXXXXXX;2ml聚苯乙烯離心管;微量移液器:單道20～200ml、200～1000ml、多道250ml。1.4標(biāo)準(zhǔn)液的制備1.4.196孔酶標(biāo)板×1塊(包被有偶聯(lián)抗原)1.4.2高濃度標(biāo)準(zhǔn)品(1ml/瓶)1mg/ml及標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶(1ml/瓶):0ng/ml,0.1ng/ml,0.3ng/ml,0.9ng/ml,2.7ng/ml,8.1ng/ml。1.4.3酶標(biāo)二抗12ml,抗體工作液7ml,底物液A液7ml,底物液B液7ml,終止液7ml,20×濃縮洗滌液40ml,2×樣本稀釋液50ml,去離子水。1.5測試方法1.5.1制備將2×樣本稀釋液按1:1稀釋即為1×樣本稀釋液,備用;然后將待測樣品用1×樣本稀釋液稀釋至10倍,即慶大霉素含量為0.1～8.1ng/ml范圍內(nèi),取50ml用于分析。1.5.2編號指示將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。1.5.3抗體反應(yīng)加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對應(yīng)的微孔中,再加入抗體工作液50μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。1.5.4吸水紙拍干液小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液(見配液1)250ml/孔,充分洗滌4～5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。1.5.5酶標(biāo)二醇添加加入酶標(biāo)二抗100μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min,取出重復(fù)洗板步驟4.4。1.5.6顯色加入底物液A液50μl/孔,再加底物液B液50μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中避光反應(yīng)15min。1.5.72結(jié)果2.1百分吸光度值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100,即:百分吸光度值(%)=B/B0×100。B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值2.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,r2≥0.98,見圖1、表1。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中慶大霉素實(shí)際殘留量(表2)。3討論3.1純化工藝對慶大霉素的殘留量的影響通過對疫苗樣本中的慶大霉素殘留量的檢測,不難發(fā)現(xiàn),在疫苗的生產(chǎn)初期的原液及160×濃縮液,慶大霉素的殘留量較高,分別達(dá)到20.4ng/ml及30.6ng/ml,經(jīng)過純化精制后,其殘留量明顯下降近兩個數(shù)量級,分別達(dá)到0.38ng/ml及0.61ng/ml,可見通過純化工藝,可以大幅度降低疫苗中慶大霉素的殘留量。3.2減少抗生素的使用抗生素類藥物在治療感染性疾病方面發(fā)揮了重大的作用,但抗生素濫用會造成嚴(yán)重的不良后果。美國、歐盟和中國等都制定了食品中抗生素的最大殘留限量指標(biāo),以限制食品中抗生素的殘留量。我國在2010版《中國藥典》中增加相關(guān)內(nèi)容,嚴(yán)格控制生物制品生產(chǎn)過程中抗生素的使用。生產(chǎn)過程中,應(yīng)盡可能避免使用抗生素,必須使用時,應(yīng)選擇安全性風(fēng)險相對較低的抗生素,使用抗生素的種類不得超過1種,且產(chǎn)品的后續(xù)工藝應(yīng)保證可有效去除制品中的抗生素,去除工藝應(yīng)經(jīng)驗(yàn)證。病毒性疫苗生產(chǎn)中應(yīng)僅限于在細(xì)胞制備過程中使用抗生素。生產(chǎn)過程中使用抗生素時,成品檢定中應(yīng)檢測抗生素殘留量,并規(guī)定殘留量限值。在新版藥典正文標(biāo)準(zhǔn)中除口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗糖丸外,所有病毒疫苗全部增訂抗生素殘留量檢測,限值規(guī)定為:每1次人用劑量不高于50ng。3.3疫苗純化技術(shù)應(yīng)根據(jù)疫苗的使用規(guī)定進(jìn)行鑒于此,在疫苗研發(fā)過程中,應(yīng)首先嚴(yán)格控制原輔材料中可能帶有抗生素含量,這類原輔材料主要是生物類原輔材料,如牛血清、水解乳蛋白、胰酶等,同時應(yīng)考慮和研究使用生物原材料替代物進(jìn)行疫苗生產(chǎn);同時調(diào)整疫苗的生產(chǎn)工藝,通過降低甚至取消生產(chǎn)過程中抗生素加入和改進(jìn)疫苗的純化工藝,如增加細(xì)胞生長液換洗次數(shù)、引進(jìn)純化技術(shù),盡可能降低抗生素的含量,最終使疫苗安全有效。疫苗中慶大霉素殘留量測定不易掌握,通過摸索學(xué)習(xí)總結(jié)了4點(diǎn)注意事項(xiàng):(1)室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫(20～25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。(2)在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重