菌種的保藏與復(fù)壯課件

第二章微生物菌種的選育第一節(jié)、微生物工業(yè)用菌種

第二節(jié)、菌種的來源第三節(jié)、高產(chǎn)菌種的選育第四節(jié)、菌種退化和保藏第五節(jié)、菌種的擴大培養(yǎng)第二章微生物菌種的選育第一節(jié)、微生物工業(yè)用菌種一、微生物工業(yè)對菌種的要求微生物資源豐富，廣布于土壤、水和空氣等自然界中，其中土壤中最多。

發(fā)展趨勢：從野生型突變型自然選育代謝控制育種誘變育種基因工程定向育種第一節(jié)、微生物工業(yè)用菌種微生物工業(yè)對大規(guī)模生產(chǎn)用菌的要求原則：（1）所需培養(yǎng)基易得，價格低廉；（2）培養(yǎng)和發(fā)酵條件溫和（糖濃度、溫度、pH、溶解氧、滲透壓等）（3）生長速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期短（4）單產(chǎn)高（選擇野生型、營養(yǎng)缺陷型或調(diào)節(jié)突變株）微生物工業(yè)對大規(guī)模生產(chǎn)用菌的要求原則：（1）所需培養(yǎng)基易得，（5）抗病毒能力強（6）菌種純粹，不易變異退化，穩(wěn)定性好（7）菌體不是病源菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保證安全（5）抗病毒能力強二、工業(yè)上常用的微生物微生物在工業(yè)上的用途很廣，包括化工、醫(yī)藥、食品、水產(chǎn)、國防、紡織、石油勘探及石油化工等方面。微生物的代謝產(chǎn)物多，已超過1300多種，而用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的不足100多種；微生物酶有近千種，而工業(yè)上用的不過40－50種。微生物具有巨大的潛力可挖掘。工業(yè)上常用菌種舉例：二、工業(yè)上常用的微生物微生物在工業(yè)上的用途很廣，包括化工、醫(yī)1、常用的細菌大腸桿菌應(yīng)用：生產(chǎn)天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸。

1、常用的細菌

乳酸桿菌應(yīng)用：乳酸、干酪、奶子酒、發(fā)面、泡菜、酸奶等的制作乳酸桿菌枯草芽孢桿菌應(yīng)用：生產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌2、酵母菌種類：酒精酵母、啤酒酵母、假絲酵母紅酵母、面包酵母。應(yīng)用：生產(chǎn)酒精、啤酒、石油發(fā)酵脫蠟和制取蛋白質(zhì)、生產(chǎn)脂肪。2、酵母菌種類：酒精酵母、啤酒酵母、假絲酵母紅酵母、面包菌種的保藏與復(fù)壯課件啤酒酵母紅酵母面包酵母啤酒酵母紅酵母面包酵母3、霉菌曲霉屬應(yīng)用：生產(chǎn)有機酸、生產(chǎn)淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶3、霉菌曲霉屬應(yīng)用：醬油、醬類（淀粉酶）應(yīng)用：醬油、醬類（淀粉酶）應(yīng)用：生產(chǎn)甲義丁二酸米曲霉應(yīng)用：產(chǎn)糖化酶和蛋白酶、主要用于釀酒制曲和醬油制曲應(yīng)用：生產(chǎn)甲義丁二酸米曲霉

毛霉應(yīng)用：可以產(chǎn)生蛋白酶，我國多用于豆腐乳、豆豉等的制作

根霉種類：米根霉、華根霉、少根根霉、爪哇根霉應(yīng)用：釀酒根霉青霉菌青霉菌4、放線菌種類：龜裂鏈霉菌、金霉素鏈霉菌、灰色鏈霉菌、紅霉素鏈霉菌應(yīng)用：各類抗生素。土霉素、四環(huán)素、鏈霉素、紅霉素4、放線菌種類：龜裂鏈霉菌、金霉素鏈霉菌、灰色鏈霉菌、紅霉素

其他生物：

A:擔(dān)子菌：所謂的擔(dān)子菌就是人們通常所說的菇類生物。擔(dān)子菌資源的利用正愈來愈引起人們的重視，如多糖、抗癌藥物的開發(fā)。近幾年來，日本、美國的一些科學(xué)家對香菇的抗癌作用進行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)香菇中的“1，2-β-葡萄糖苷酶”及兩種糖類物質(zhì)具有抗癌作用。

其他生物：菌種的保藏與復(fù)壯課件

B：病毒(virus)其特點如下：1.形體微小，體積比細菌小的多。2.沒有細胞結(jié)構(gòu)，主要由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。3.營寄生生活不能脫離寄主而自行生長繁殖，有專一性。

人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）獲得性免疫缺陷綜合癥（acquiredimmunodeficiencysyndromeAIDS）人類免疫缺陷病毒（humanimmunodefici

噬菌體（phage）是病毒的一種。噬菌體在寄主細胞中的生長繁殖過程可分為吸附、浸入、增殖、成熟和釋放。

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C：藻類（alga）：

培養(yǎng)螺旋藻，每公頃可收獲60噸，而種植大豆每公頃才可獲4噸；從蛋白質(zhì)產(chǎn)率來看，螺旋藻是大豆28倍。還可通過藻類將CO２轉(zhuǎn)變?yōu)槭停囵B(yǎng)單胞藻或其他藻類而獲得的石油，可占細胞干重得5%-50%，合成的油與重油相同，加工后可轉(zhuǎn)變汽油、煤油等產(chǎn)品。還可減輕因工業(yè)生產(chǎn)而大量排放CO２造成的溫室效應(yīng)。國外還有人從“藻類農(nóng)場”獲取氫能的報道，大量培養(yǎng)藻類，利用其光合放氫作用來取得氫能。C：藻類（alga）：藻類工廠藻類工廠第二節(jié)菌種的來源一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。第二節(jié)菌種的來源一、菌種的來源第二節(jié)菌種的來源二、微生物選擇性分離方法微生物樣品的采集微生物樣品的富集培養(yǎng)目的菌種的分離目的菌的篩選第二節(jié)菌種的來源二、微生物選擇性分離方法1、微生物樣品的采集微生物主要來自土壤。尋找已經(jīng)適應(yīng)苛刻環(huán)境壓力的微生物類群例如：從鹽場分離嗜鹽鏈霉菌，從污泥中分離甲烷菌，從酒糟中分離酵母菌等。1、微生物樣品的采集2、微生物樣品富集培養(yǎng)含有目的菌較多的土樣不需要富集培養(yǎng)如果原有樣品中目的菌含量低，可以人為地添加相應(yīng)的基質(zhì)，培養(yǎng)使之以較其它微生物更快的速度生長繁殖，從而提高它們在樣品中的比例，便于分離。富集培養(yǎng)的一般方法：采用有利于目的菌種而不利于無關(guān)微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)條件，以達到使目的菌種在群體中比例上升的目的。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。一些有特定物質(zhì)產(chǎn)生能力的菌種，不容易富集，只有通過大量艱苦的工作篩選取得。2、微生物樣品富集培養(yǎng)含有目的菌較多的土樣不需要富集培養(yǎng)某些細菌的富集條件

富集對象 接種菌樣 添加營養(yǎng)物(g) 特殊培養(yǎng)條件好氧氨基酸氧化菌 土壤 –

好氧，pH7.0好氧性芽孢桿菌 土壤，巴氏消毒 – 好氧，pH7.0氨基酸發(fā)酵性梭菌 土壤，巴氏消毒 – 厭氧，pH7.0耐堿解尿素芽孢菌 土壤，巴氏消毒 尿素50 好氧，pH8.6厭氧八疊球菌 土壤 葡萄糖20 厭氧，pH2~3乳酸菌 植物體或牛奶 葡萄糖20 厭氧，pH6.5腸道細菌 土壤或污水 葡萄糖20，CaCO320 好氧或厭氧，pH7.0丙酸菌 干酪 乳酸鈉20 厭氧，pH7.0醋酸菌 果實或生啤酒 乙醇40 好氧，pH6.0注：培養(yǎng)基成分為酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O0.2g，加水1000ml。一般培養(yǎng)在30℃下。某些細菌的富集條件富集對象 接種菌樣 添加營養(yǎng)物(3、目的菌種的分離分離效率取決于培養(yǎng)基的養(yǎng)分、pH、加入的選擇性抑制劑。表2-3列舉了分離放線菌的各種培養(yǎng)基配方。廣泛應(yīng)用的三種培養(yǎng)基即幾丁質(zhì)瓊脂、淀粉-酪素培養(yǎng)基和M3培養(yǎng)基。3、目的菌種的分離因大多數(shù)放線菌都是嗜中性的，分離培養(yǎng)基的pH常在6.7-7.5之間。如要分離嗜酸放線菌，pH宜降低到4.5-5.0。在分離培養(yǎng)基中廣泛采用加入抗生素的方法，來增加放線菌的篩選。注意：要使用抗真菌抗生素，不要使用抗細菌抗生素。因大多數(shù)放線菌都是嗜中性的，分離培養(yǎng)基的pH常在6.7-7.4、目的菌的篩選涂布法：于分離平板上鋪上一層單一的試驗菌的辦法用來測定各個菌落的抗生素生產(chǎn)能力。復(fù)印平板法：即用絲絨等把瓊脂平板上的菌落轉(zhuǎn)移到別的瓊脂平板上的方法。例如在檢測營養(yǎng)缺陷性時，首先在完全培養(yǎng)基瓊脂平板上制備密度適當(dāng)?shù)木洌缓蟀哑桨迳系木滢D(zhuǎn)移到絲絨上，絲絨繃在一個圓柱的光滑頂面上（圓柱的直徑應(yīng)比培養(yǎng)皿稍?。?，再把它當(dāng)作印章，復(fù)印在不含營養(yǎng)物的合成培養(yǎng)基瓊脂平板上。因為需要某特定營養(yǎng)物的菌落在合成培養(yǎng)基瓊脂平板上不能生長，所以和原來平板上的菌落相比較，就可以很容易地檢測出營養(yǎng)缺陷型菌株。這種方法被廣泛應(yīng)用于分離突變菌株，常和誘變劑處理及青霉素處理法相結(jié)合使用。

4、目的菌的篩選這兩種方法都有缺點。涂布法會使所需要的菌落污染，并且只能在每個平板上鋪上一種試驗菌。菌落復(fù)印平板法適合長孢子的菌種，對不長孢子的鏈霉菌則不能使用，也不適用于游動細菌的篩選。這兩種方法都有缺點。涂布法會使所需要的菌落污染，并且只能在每三、重要工業(yè)微生物的分離方法施加選擇壓力的分離方法：

1、富集液體培養(yǎng)：指能增加混合菌群中所需菌株的數(shù)量的一種技術(shù)。要領(lǐng)：給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長或不利于其他菌群生長的條件。e.g.供給特殊的基質(zhì)或加入某些抑制劑。

三、重要工業(yè)微生物的分離方法注意：所需類型的菌株生長的結(jié)果，有時會改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，從而改變選擇壓力，使其他微生物生長。解決辦法：把富集培養(yǎng)物接種到新鮮的同一種培養(yǎng)基中可以重新建立選擇壓力，重復(fù)移植幾次后，將富集培養(yǎng)物再接到固體培養(yǎng)基上。注意：所需類型的菌株生長的結(jié)果，有時會改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，從而

２、固體培養(yǎng)基培養(yǎng)：常用于分離某些酶產(chǎn)生菌，其選擇培養(yǎng)基中常含有所需酶的基質(zhì)，以便促進酶產(chǎn)生菌的生長。e.g.堿性蛋白酶的分離用不同pH的土壤作為原始種子。土壤必須經(jīng)過巴氏滅菌消毒，以減少不產(chǎn)孢子的微生物，然后鋪在pH為9~10的瓊脂培養(yǎng)基（含有均勻的不溶性蛋白質(zhì)）表面。堿性蛋白酶的產(chǎn)生菌能消化平板的不溶性蛋白，產(chǎn)生一清晰圈。２、固體培養(yǎng)基培養(yǎng)：

3、隨機分離方法：

有些微生物的產(chǎn)物對產(chǎn)生菌的篩選沒有任何選擇性好處。因此常隨機地分離所需菌種，高產(chǎn)培養(yǎng)基成分的選擇準則如下：1、制備一系列含有各種類型營養(yǎng)成分（生長限制因素）培養(yǎng)基；2、避免使用容易同化的碳源或氮源，（引起分解代謝物阻遏）；3、加入緩沖液以減少pH的變化；4、確定含有所需的輔助因子Co2+,Mn2+,Mg2+,Fe2+等。3、隨機分離方法：eg:抗生素生產(chǎn)菌的篩選：把潛在的產(chǎn)生菌生長在含有試驗菌的平板上，可以鑒定產(chǎn)生菌的抗微生物作用。也可以將微生物分離株生長在液體培養(yǎng)基中，檢測其無細胞濾液的抗菌活性。

eg:抗生素生產(chǎn)菌的篩選：

eg:藥理活性化合物生產(chǎn)菌的篩選：一種化合物如果能在體外抑制某種關(guān)鍵的人體酶，它就可能在體內(nèi)具有藥理作用。若將體外篩選出的活性化合物，再用動物作試驗，可篩選出新的藥理活性化合物生產(chǎn)菌。eg:藥理活性化合物生產(chǎn)菌的篩選：eg:生長因子產(chǎn)生菌的篩選：

通過觀察分離菌能否促進營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）的生長，便可檢出生長因子產(chǎn)生菌。

eg:生長因子產(chǎn)生菌的篩選：eg:多糖生產(chǎn)菌的篩選：

從制糖工業(yè)的廢水中可獲得分離株，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長，可從菌落的粘液狀外觀識別這類產(chǎn)生菌。eg:多糖生產(chǎn)菌的篩選：

第三節(jié)高產(chǎn)菌種選育

菌種選育是一門應(yīng)用科學(xué)技術(shù)，其理論基礎(chǔ)是微生物遺傳學(xué)、生物化學(xué)等，而其研究目的是微生物產(chǎn)品的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和發(fā)展新品種為生產(chǎn)不斷地提供優(yōu)良菌種，從而促進生產(chǎn)發(fā)展。目前菌種選育常采用自然選育和誘變育種等方法，帶有一定的盲目性，尚屬于經(jīng)典育種的范疇。隨著微生物學(xué)、生化遺傳學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、代謝調(diào)控和基因工程等較為定向的育種方法。

第三節(jié)高產(chǎn)菌種選育

菌種選育是一門應(yīng)用科學(xué)技術(shù)，其理論1、自然選育

在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自然突變而進行菌種篩選的過程叫做自然選育。所謂自然突變就是指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變。一般認為引起自然突變有兩個原因：即多因素低劑量的誘變效應(yīng)和互變異構(gòu)效應(yīng)。菌種的自然突變往往有兩種可能性:菌種衰退,生產(chǎn)性能下降;代謝更加旺盛,生產(chǎn)性能提高。1、自然選育所謂多因素低劑量的誘變效應(yīng)，是指自然突變實質(zhì)上是由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長期綜合效應(yīng)。所謂多因素低劑量的誘變效應(yīng)，是指自然突變實質(zhì)上是由一些原因不2、誘變育種誘變育種的基本原理誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，所謂突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。突變主要包括染色體畸變和基因突變二大類。

（1）染色體畸變是指染色體或DNA片斷的缺失、易位、逆位、重復(fù)等。（2）基因突變是指DNA分子結(jié)構(gòu)中的某一部位發(fā)生變化（又稱點突變）。2、誘變育種根據(jù)突變發(fā)生的原因又可分為自然突變和誘發(fā)突變。

誘發(fā)突變是指用各種物理、化學(xué)因素人工誘發(fā)的基因突變。誘變因素的種類很多，有物理的、化學(xué)的和生物的三大類。經(jīng)誘變處理后，微生物的遺傳物質(zhì)、DNA和RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起微生物的遺傳變異。菌種的保藏與復(fù)壯課件誘變育種的一般步驟

（1）出發(fā)菌株的選擇自然界直接分離到的野生型菌株經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗的菌株已經(jīng)歷多次育種處理的菌株誘變育種的一般步驟

（1）出發(fā)菌株的選擇2、制備菌懸液待處理的菌懸液應(yīng)考慮微生物的生理狀態(tài)、懸液的均一性和環(huán)境條件；盡可能選擇孢子或單倍體細胞作為誘變對象，避免表型延遲。表型延遲就是指某一突變在DNA復(fù)制和細胞分裂后，才在細胞表型上顯示出來，造成不純的菌落。3、誘變處理根據(jù)誘變劑用量對菌體致死率的曲線選擇合適的處理劑量。一般突變率隨誘變劑量的增大而增高，但達到一定劑量后，突變率會下降。2、制備菌懸液4、突變菌株的篩選（1）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選生物合成途徑的某一步發(fā)生了酶缺陷，合成反應(yīng)不能完成，末端產(chǎn)物不能積累，因此末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用被解除。（2）抗反饋阻遏和抗反饋抑制突變菌株的篩選調(diào)節(jié)基因或操縱基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白不能再和終產(chǎn)物結(jié)合或結(jié)合后不能作用于已突變的操縱基因，因此不再起反饋阻遏作用；編碼酶的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，使變構(gòu)酶不再具有結(jié)合終產(chǎn)物的能力但仍具有催化活性，從而解除了反饋抑制?？狗答佂蛔冎暌话阃ㄟ^抗結(jié)構(gòu)類似物突變的方法篩選。營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株中也可獲得抗反饋突變株。4、突變菌株的篩選（3）組成型突變株的篩選分批限量加入誘導(dǎo)物法，解除菌株對誘導(dǎo)物的依賴交替培養(yǎng)法（4）抗性突變株的篩選抗生素抗性突變抗噬菌體菌株的選育條件抗性突變敏感突變（3）組成型突變株的篩選原種（出發(fā)菌株）

純化

斜面培養(yǎng)

完全培養(yǎng)基同步培養(yǎng)

離心洗滌

玻璃珠震蕩分散

過濾

單細胞或孢子懸浮液

活菌計數(shù)誘變處理

誘變處理預(yù)備實驗

處理液活菌計數(shù)平板分離

形態(tài)變異并計算其變異率斜面培養(yǎng)

初篩、復(fù)篩

自然分離和再復(fù)篩

保藏及擴大試驗誘變育種原種（出發(fā)菌株）純化斜面培養(yǎng)完全培養(yǎng)基同步培養(yǎng)離心洗

出發(fā)菌株的選擇誘變劑的選擇誘變操作及培養(yǎng)突變株的篩選突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn)形態(tài)突變高產(chǎn)突變耐藥性突變營養(yǎng)缺陷型突變結(jié)構(gòu)類似物抗性突變出發(fā)菌株的選擇形態(tài)突變型：指發(fā)生細胞形態(tài)變化或菌落形態(tài)變化的突變型。

生化突變型：沒有形態(tài)效應(yīng)的突變型，如營養(yǎng)缺陷型。致死突變型：生活力下降的突變型。條件致死突變型：在某些條件下能成活，在另一些條件下是致死的突變型。營養(yǎng)缺陷型突變株：由于代謝障礙而成為必須添加某種物質(zhì)才能生長的突變株。溫度敏感性突變株：可在某一溫度下生長而在另一溫度下不能生長的突變型。形態(tài)突變型：指發(fā)生細胞形態(tài)變化或菌落形態(tài)變化的突變型。出發(fā)菌株選擇應(yīng)考慮的問題出發(fā)菌株的穩(wěn)定性選用具備優(yōu)良特性的菌株挑選對誘變劑敏感的菌株注意菌株的生理狀態(tài)及生長發(fā)育時間

出發(fā)菌株

野生菌株自發(fā)突變后獲得的高產(chǎn)菌株已經(jīng)誘變過的菌株出發(fā)菌株選擇應(yīng)考慮的問題出發(fā)菌株的穩(wěn)定性出發(fā)菌株考慮試驗菌株的遺傳背景：各種誘變劑有不同的作用機制，一種誘變劑的作用常主要集中在DNA的某些特異部位上，多次反復(fù)用一種誘變因子易出現(xiàn)“飽和”或恢復(fù)突變現(xiàn)象，因此誘變時常采用多種不同的誘變因子或復(fù)合誘變因子。誘變劑的選擇菌懸液的制備

單細胞懸浮液：106個/mL孢子懸浮液：108個/mL誘變：預(yù)實驗確定適宜的誘變條件篩選：選擇合適的篩選方法考慮試驗菌株的遺傳背景：各種誘變劑有不同的作用機制，一種誘變3、雜交育種

發(fā)酵工業(yè)的優(yōu)良菌種的選育主要采用誘變育種方法。但是，一個菌種長期使用誘變劑處理之后，其生活能力一般要逐漸下降，例如生長周期延長，孢子量減少，代謝減慢，產(chǎn)量增加緩慢，誘變因素對產(chǎn)量基因影響的有效性降低等。因此，有必要利用雜交育種方法。

雜交育種是指將兩個基因型不同的菌株經(jīng)吻合（或接合）使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。3、雜交育種

雜交育種的目的在于：1）通過雜交使不同菌株的遺傳物質(zhì)進行交換和重新組合，從而改變原有菌株的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，獲得雜種菌株（重組體）；2）可以通過雜交把不同菌株的優(yōu)良生產(chǎn)性能集中于重組體中，克服長期用誘變劑處理造成的菌株生活力下降等缺陷；3）通過雜交，可以擴大變異范圍，改變產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，甚至出現(xiàn)新的品種；

4）分析雜交結(jié)果，可以總結(jié)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律，促進遺傳學(xué)理論的發(fā)展。雜交育種的目的在于：微生物雜交育種所使用的配對菌株稱為直接親本。由于多數(shù)微生物尚未發(fā)現(xiàn)其有性世代，因此，直接親本菌株應(yīng)帶有適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記。常用的遺傳標(biāo)記有顏色、營養(yǎng)要求和抗藥性等。

營養(yǎng)標(biāo)記菌株（即營養(yǎng)缺陷型菌株）是最常用的遺傳標(biāo)記之一。所謂營養(yǎng)缺陷型菌株是微生物經(jīng)誘變劑處理后產(chǎn)生的一種生化突變體。由于基因突變，它失去了合成某種物質(zhì)（氨基酸、維生素或核苷酸堿基）的能力，在基本培養(yǎng)基上不能生長，大多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株需要補加一定種類的有機物質(zhì)后才能生長。遺傳標(biāo)記微生物雜交育種所使用的配對菌株稱為直接親本。由于4、原生質(zhì)體融合步驟：選擇親株：對兩親株要進行標(biāo)記，以提高篩選率。原生質(zhì)體的制備：用相應(yīng)的酶脫去菌體的細胞壁，制得完整的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的融合與再生：兩原生質(zhì)體在促融因子的存在下，發(fā)生融合，重建細胞壁，形成新的細胞。篩選優(yōu)良性狀融合重組子：在選擇培養(yǎng)基上，通過兩個親本的遺傳標(biāo)記互補而選擇融合。4、原生質(zhì)體融合菌種的保藏與復(fù)壯課件2、特點及應(yīng)用：原生質(zhì)體間的雜交頻率都明顯高于常規(guī)雜交法，霉菌與放線菌已達10-1

~10-2，細菌與酵母已達10-5~10-6。原生質(zhì)體融合受接合型或致育型的限制較小，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。已報道的絲狀真菌種間的原生質(zhì)體融合主要是曲霉屬和青霉屬；屬間原生質(zhì)體融合主要在酵母中實現(xiàn)：熱帶假絲酸母×飾針復(fù)膜孢酵母，釀酒酵母×彭貝裂殖酵母等。2、特點及應(yīng)用：重組體種類較多；遺傳物質(zhì)的傳遞更完整；采用溫度、藥物或紫外線照射燈處理鈍化一方的親株原生質(zhì)體，再融合，可以提高篩選頻率；可以把原生質(zhì)體融合與其他育種方法結(jié)合起來，提高篩選效率。重組體種類較多；3、影響原生質(zhì)體制備的因素菌體的前處理：提高細胞壁對酶的敏感性；菌體生理狀態(tài)：對數(shù)生長期；酶的濃度：如制備酵母原生質(zhì)時，加蝸牛酶1-2%；酶解溫度：20-40℃；酶解時間滲透壓：高滲條件：糖、氯化鈉等；培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方式、pH等3、影響原生質(zhì)體制備的因素菌體的前處理：提高細胞壁對酶的敏感4、DNA重組技術(shù)目標(biāo)DNA片斷的獲得載體與載體DNA分子的連接重組DNA分子引入宿主細胞從中選出所需重組DNA分子的宿主細胞鑒定外源基因的表達產(chǎn)物4、DNA重組技術(shù)基因重組基因重組質(zhì)粒的特點1、質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動必需。2、每個細胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異，同一質(zhì)粒在不同條件下，拷貝數(shù)也可能差異很大，有嚴緊型和松弛型兩種。3、質(zhì)粒DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見的一種是共價、閉環(huán)狀DNA；其次是由于一條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán)DNA；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性DNA。質(zhì)粒的特點1、質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動必需。作為載體的質(zhì)粒的要求：在宿主細胞能自主復(fù)制有明顯方便的篩選標(biāo)記存在限制性內(nèi)切酶位點帶有多克隆位點，便于插入失活的功能篩選重組子在宿主中以多拷貝存在帶有啟動子，便于外源基因表達能在宿主中穩(wěn)定的遺傳作為載體的質(zhì)粒的要求：在宿主細胞能自主復(fù)制質(zhì)粒DNA的提取方法細菌培養(yǎng)和質(zhì)粒擴增；細菌的收獲和裂解；質(zhì)粒DNA的提取。質(zhì)粒DNA的提取方法細菌培養(yǎng)和質(zhì)粒擴增；操作步驟：質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌1．從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入10ml肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。2．取0.5ml培養(yǎng)物接入50ml肉湯中，無菌添加0.4ml2.5mol／LMgCl2，于37℃振蕩培養(yǎng)。3．將o.1mol／LCaCl2溶液、試管及吸管在冰浴中冷卻。4．當(dāng)培養(yǎng)物OD600在0.5～0.8左右時，開始收獲細胞(大約需2～2.5h)．操作步驟：5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻10min。6．取10ml培養(yǎng)物置2個冷離心管中棄去上清液。7．加入1ml0.1mol／LCaCl2，再加0.9mlCaCl2，置冰浴中放置20min。8．3000r／min離心10min，棄去上清液。9．加入1ml0.1mol／LCaCl2，重新懸浮細胞，置冰浴中保存。10．加入1～20μl待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA溶液。5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻10min。11．在冰上放置20min，在37℃處理2min。再插入冰中．加入0.9m1肉湯37℃靜置培養(yǎng)90min。12．以不同的量涂布選擇培養(yǎng)基平板。13．于37℃培養(yǎng)過夜。鑒定轉(zhuǎn)化菌落。11．在冰上放置20min，在37℃處理2min。再插入冰中重組DNA中常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶等重組DNA中常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的剪切方式限制性內(nèi)切酶的剪切方式宿主細胞必須符合以下條件對載體的復(fù)制和擴增沒有嚴格的限制；不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA；在重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾；重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組；容易導(dǎo)入重組DNA分子；符合重組DNA操作的安全標(biāo)準。宿主細胞必須符合以下條件對載體的復(fù)制和擴增沒有嚴格的限制；目的基因的獲取1、通過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內(nèi)切酶。cDNA：用mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，再經(jīng)DNA聚合酶的作用產(chǎn)生雙鏈DNA?？扇コ婧松锘蛑胁槐磉_的內(nèi)含子。目的基因的獲取1、通過建立基因文庫分離靶基因2、化學(xué)合成法制備DNA片段從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。聚合酶鏈反應(yīng)法擴增基因片段對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（ＰＣＲ），以基因組DNA或cDNA模板擴增得到目的基因片段。2、化學(xué)合成法制備DNA片段重組DNA導(dǎo)入宿主菌

體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。重組DNA導(dǎo)入宿主菌體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)?、轉(zhuǎn)化指以細菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細胞的過程。轉(zhuǎn)化時，細菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細菌，它的優(yōu)點是操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。1、轉(zhuǎn)化指以細菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細胞的過程。2、轉(zhuǎn)染和感染

利用噬菌體DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。2、轉(zhuǎn)染和感染利用噬菌體DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導(dǎo)3、重組克隆的篩選與鑒定

基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過細菌培養(yǎng)以及重組子的擴增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達該基因的產(chǎn)物。3、重組克隆的篩選與鑒定基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細菌菌落第四節(jié)菌種退化和保藏工業(yè)微生物菌種保藏與其他目的的菌種保藏要求有所不同。工業(yè)微生物菌種保藏，是要使菌種生產(chǎn)能力和與生產(chǎn)工藝相適應(yīng)的優(yōu)良性狀保持穩(wěn)定，當(dāng)然做不到絕對不變，只是力求把這種衰退現(xiàn)象推遲減緩到最低限度。第四節(jié)菌種退化和保藏工業(yè)微生物菌種保藏與其他目的的菌種保藏要菌種保藏原理菌種保藏有許多的方法，其共同的目標(biāo)是把菌株的優(yōu)良性狀保存下來，防止退化、死亡或雜菌污染。保藏的一般程序是選取優(yōu)良的純菌種，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠體，在其休眠和停止生長的條件下保藏。微生物生長要求適宜的溫度、水分、空氣和營養(yǎng)物質(zhì)等，如將菌種處于低溫、干燥、無氧和缺乏營養(yǎng)的條件下，就可以使菌種暫時處于休眠狀態(tài)。菌種保藏原理菌種保藏有許多的方法，其共同的目標(biāo)是把菌株的優(yōu)良

低溫是保藏菌種的重要因素，也是常用的一種簡單易行的方法。在低溫保藏時，注意盡量不損傷細胞。在緩慢冷凍時，胞外基質(zhì)一般較快結(jié)冰而形成冰晶使基質(zhì)濃度增高，造成細胞水分外滲而大量脫水，可能使細胞死亡。如快速降溫，胞內(nèi)也很快形成冰晶，胞內(nèi)外滲透壓基本平衡，同時胞內(nèi)冰晶較小，對細胞及原生質(zhì)膜的損傷也較小，菌株不易死亡，影響也較小。低溫是保藏菌種的重要因素，也是常用的一種簡單易行低溫保藏法

低溫定期移植法

石蠟油低溫保藏法

干燥保藏

甘油管保藏法真空冷凍干燥法

液氮超低溫保存

現(xiàn)行的菌種保藏方法有下列諸種:低溫保藏法現(xiàn)行的菌種保藏方法有下列諸種:一、低溫保藏法

這是一種常用的簡便方法。一般的斜面孢子、液態(tài)孢子、斜面種子以及用麩皮、大米、小米或碎玉米制成的孢子，可以放在4℃冰箱內(nèi)保藏，這種溫度條件下不能使菌體進入休眠，而僅是抑制微生物的生命活動。因此，保藏時間不宜過長，一般不超過1～2個月為宜。本方法雖然簡便，但由于菌株處于較高的水平活性下，這對保藏株的生產(chǎn)性狀是不利的，因此，生產(chǎn)菌種一般不采用此法保藏。一、低溫保藏法這是一種常用的簡便方法。一般的斜面孢子、液態(tài)二、低溫定期移植法

把培養(yǎng)好的斜面菌種放在低溫干燥處保存，定期移植，一般3～6個月移植一次(視菌種特征而定)。也可以用穿刺培養(yǎng)，定期移植法保藏細菌，其效果也較好。穿刺培養(yǎng)是將含0.6％～0.8％的瓊脂培養(yǎng)基裝試管滅菌后直立冷凝后，用接種針尖挑取少量菌體，垂直刺入瓊脂培養(yǎng)基中心，放在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)，待菌長好后即可放低溫保存，此法較斜面保存有利，大腸桿菌可保藏2年以上不發(fā)生明顯變異。二、低溫定期移植法把培養(yǎng)好的斜面菌種放在低溫干燥處保存，定

斜面定期移植與穿刺移植法有其缺陷:即容易發(fā)生遺傳變異；連續(xù)傳代可使一些生產(chǎn)性狀丟失或減弱，也易于污染雜菌。因此，一些貴重菌株及生產(chǎn)優(yōu)良菌株不宜用此法保藏。斜面定期移植與穿刺移植法有其缺陷:即容易發(fā)生遺傳變異；連三、石蠟油低溫保藏法

本方法的原理是在長好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達到菌體與空氣隔絕，使菌處于生長和代謝停止?fàn)顟B(tài)，同時石蠟油還防止水分蒸發(fā)，在低溫下達到較長期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-4～4℃下。液體石蠟法適用于不產(chǎn)孢子的菌種。三、石蠟油低溫保藏法本方法的原理是在長好的斜面菌上覆蓋滅菌菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不宜過長；選擇純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油，置三角燒瓶中經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌1～2h，將其放烘箱中(160℃左右)干熱處理，去除滅菌時滲入的水分，待石蠟油變得清澈透明后冷卻即可加入斜面，斜面上不能出現(xiàn)氣泡，液蠟添加量以高出斜面頂部約1cm左右為宜。菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不宜過長；選擇純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油，置三角四、干燥保藏

干燥法是使菌處于干燥條件下停止生長及處于休眠狀態(tài)，達到較長期保藏的目的。此法用于細菌芽孢或產(chǎn)分生孢子的菌種，是現(xiàn)在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中較常用的菌種保藏方法。通常將菌種的分生孢子、芽孢，甚至菌絲體吸附于一些載體表面放至干燥容器里進行常壓干燥或真空干燥，所用載體有沙土、濾紙、硅膠及大(小)米等。四、干燥保藏干燥法是使菌處于干燥條件下停止生長及處于休眠狀1、沙土管法

取河(海)沙，過0.78mm(24目)篩，用10％鹽酸浸泡24h，倒去鹽酸用清水沖洗至pH呈中性，去水烘干或曬干。取菜園或果園土粉碎過篩，把烘干的沙土按3：2或1：1混合裝入指形管或高100mm，直徑為10mm的小試管中，高約1cm(約2g)，塞棉塞121℃滅菌1h，也可用170℃2h干熱滅菌(或蒸汽三次間歇滅菌)，蒸汽滅菌后需烘干。經(jīng)肉湯檢查確實證明無菌即可使用。將要保存的斜面菌種制成濃孢子懸液(≥106/ml)，用滅菌滴管或吸管吸取孢子懸液滴入無菌沙土上，每管約0.3～0.5ml，用接種環(huán)將其混合均勻。1、沙土管法取河(海)沙，過0.78mm(24目)篩也可將真菌分生孢子用接種環(huán)從斜面直接挑取放入沙土中。然后將沙土管抽真空干燥。這時管內(nèi)砂土松散，表明已干燥。將干燥的砂土管放置在干燥器或密閉容器內(nèi)、干燥器下部放置變色硅膠等干燥劑，于4℃下保存。從斜面取出的孢子放入沙土管中混勻后，可以不抽真空直接放干燥器內(nèi)保存。也可將真菌分生孢子用接種環(huán)從斜面直接挑取放入沙土中。然后將沙在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐漸減慢，存活下來的孢子在以后保存期間穩(wěn)定性較好。用沙土管保藏的某些抗生素產(chǎn)生菌保藏期可達18年(土霉素和鏈霉素產(chǎn)生菌)到22年(新霉素產(chǎn)生菌)，但對利福霉素、卡那霉素、四環(huán)素等容易產(chǎn)生變異的菌種，就不適合作長期的沙土管保存。

在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐漸減慢，存活下來的孢子在以菌種的保藏與復(fù)壯課件2、濾紙保藏法

本法是將要要保藏的微生物細胞或孢子吸附在滅菌濾紙上，干燥后冷藏。其方法是3#濾紙剪成5mm×50mm的小條，放入干燥的培養(yǎng)皿中滅菌。將培養(yǎng)好的菌種用滅菌脫脂乳或奶粉復(fù)原乳制成孢子懸液，用滅菌鑷子將準備好的濾紙條在滅菌操作下浸入菌懸液中，充分吸附菌細胞，取出后放入滅菌小試管或安瓿管中，在真空干燥機上抽干，真空條件下火焰熔封，冷藏。

2、濾紙保藏法本法是將要要保藏的微生物細胞或孢子吸附在滅菌3、大(小)米保藏法

是根據(jù)我國制曲原理加以改進的一種方法。此法是將曲霉等大量產(chǎn)生孢子的菌直接培養(yǎng)在大(小)米培養(yǎng)基上，待孢子充分成熟后干燥后保藏。

3、大(小)米保藏法是根據(jù)我國制曲原理加以改進的一種方五、甘油管保藏法本法也是利用微生物在甘油中生長和代謝受到抑制的原理達到保藏目的。其方法是，將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養(yǎng)好的斜面菌種用無菌水制成高濃度的菌懸液(108～1010/ml)。取1ml滅菌甘油放入與甘油充分混勻，使甘油濃度約為40%，于-20℃下凍存。

五、甘油管保藏法本法也是利用微生物在甘油中生長和代謝受到抑制六、真空冷凍干燥法

真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對病毒、細菌、放線菌、酵母及絲狀菌孢子等各類微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。冷凍干燥保存的菌種存活時間長、效果好，一般菌種可保存5年以上，有的可保藏15年以上不發(fā)生變異。還具有體積小、不易污染、便于運輸?shù)葍?yōu)點，是一種用得最為廣泛的菌種保藏方法。

六、真空冷凍干燥法真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、除冷凍干燥法是在低溫下快速將細胞凍結(jié)，然后在真空條件下干燥，使微生物的生長和酶活動停止。為了防止在冷凍和水分升華過程中對細胞的損害，要采用保護劑來制備細胞懸液，使菌在凍結(jié)和脫水過程中起到保護作用的溶質(zhì)，通過氫鍵和離子鍵對水和細胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細胞成分的構(gòu)型。冷凍干燥法是在低溫下快速將細胞凍結(jié)，然后在真空條件下干燥，使1、冷凍干燥的基本原理

即是使樣品中的水分在冰凍狀態(tài)下，抽真空減壓，使凍結(jié)的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達到干燥。干燥后的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達到長期保藏的目的。2、設(shè)備

冷凍干燥備有不同型號和類型，但都由四個部分組成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷凍系統(tǒng)。干燥箱可控制溫度范圍為-40～40℃。

1、冷凍干燥的基本原理3、操作方法

(1)安瓿管準備選取規(guī)格約直徑為8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%鹽酸浸泡8～10h，再經(jīng)自來水沖洗多次，用蒸餾水涮洗2～3次，烘干；在每管內(nèi)放入打好菌號及日期的標(biāo)簽，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，滅菌備用。3、操作方法(2)保護劑的選擇及制備一些對熱敏感的保護劑如血清等用過濾除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制滅菌溫度。一般情況下，多數(shù)菌種可以用脫脂乳糖等要控制滅菌溫度。一般情況下，多數(shù)菌種可以用脫乳為保護劑。(2)保護劑的選擇及制備菌種的保藏與復(fù)壯課件(3)菌種準備及分裝菌種要求為生長良好的純種，菌齡以處于穩(wěn)定期為好，孢子是新鮮的。每支長好的斜面加2～3ml保護劑，用接種環(huán)將菌苔輕輕刮起(注意勿刮起培養(yǎng)基)，制成菌懸液。如用液體培養(yǎng)的菌種，則需經(jīng)離心收集和用滅菌生理鹽水洗滌細胞，收集的菌體用保護劑懸浮制成菌懸液。懸液制備完成盡快分裝和凍結(jié)。分裝安瓿時可用滅菌的長滴入安瓿管底部，裝量可依據(jù)冷凍干燥機效能而定。

(3)菌種準備及分裝(4)預(yù)凍分裝好的安瓿管需要進行預(yù)凍，即放在-30～40℃下凍結(jié)20～60min，也可以用干冰和無水乙醇凍5～10min。(4)預(yù)凍(5)冷凍干燥經(jīng)預(yù)凍的安瓿放入干燥箱中抽真空干燥。此時干燥箱溫度控制在-30℃以下，并盡快使真度達到66Pa以下，可升溫以加速水分升華，升溫不宜過快，以免引起樣品融化。干燥時間以樣品最終水分含量達到1%～3%為準。具體操作時是根據(jù)凍干樣品呈酥塊工松散片狀。干燥完畢將安瓿管在真空下用火焰燒熔密封，并檢測真空度。

(5)冷凍干燥(6)保藏及凍干管的啟用密封好的凍干管在4℃或-18℃下保藏。當(dāng)需用凍干菌種時，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂輪在無菌條件下打開，或?qū)碴稠敳吭诰凭珶艋鹧嫔献茻?，迅速滴上冷的無菌水，使管破裂，然后用鑷子等輕輕敲碎管口，加入0.3～0.5ml液體培養(yǎng)基溶解凍干菌塊成為懸液，用無菌滴管或接種環(huán)移至斜面或液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。(6)保藏及凍干管的啟用（1)菌的質(zhì)量保藏的菌種應(yīng)培養(yǎng)地營養(yǎng)豐富的最適條件下，使之進入穩(wěn)定期，稍老一些的菌體對環(huán)境抵抗力強。另處，作為冷凍干燥的菌懸液細胞濃度要高不同的菌對冷凍干燥的耐受程度不同，如果保存的菌液細胞濃度不高，就會使以后傳種造成困難，保存期也會受到影響。注意事項：（1)菌的質(zhì)量注意事項：(2)保護劑不同種類的保護劑對不同微生物的作用是不同的，如個別菌種在脫脂乳作保護劑的情況下死亡率高達99.99%，而采用葡聚糖等混和保護劑時死亡率大大減少。一般情況下，那些容易保存的菌種對保護劑的要求不很嚴格，而不易保存的菌種對保護劑的要求卻很苛刻。因此，選擇好的保護劑是冷凍干燥保存菌種的關(guān)鍵因素。

(2)保護劑（3）干燥速度實驗表明，慢速干燥比快速干燥存活率高，如青霉菌6h干燥存活率為67.3%，而3h為59%。（4）空氣的影響

冷凍干燥后空氣對細菌細胞影響較大，可導(dǎo)致細胞損傷進而死亡，故在凍干后應(yīng)立即在真空下融封，才有利于長期保存。

（3）干燥速度（5）溫度的影響在干燥和真空狀況下溫度的影響遠沒有上述幾項因素重要，因此可以在室溫下保存，但許多微生物在4℃保存的存活率要比在室溫下高1倍。（6）含水量的影響

水分含量過高對菌存活不利，完全脫水也不利于保存，一般把干燥后的細胞含水量控制在3%以下(1%～3%)。

（5）溫度的影響(7)復(fù)蘇培養(yǎng)打開安瓿管后加入無菌水使凍干菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。菌種能否適宜凍干保存，需經(jīng)過實驗來證明。凍干保藏的效果因微生物種類而異，一般是細菌＞放線菌＞真菌＞藻類，而菌絲體不宜用此法保存。

(7)復(fù)蘇培養(yǎng)七、液氮超低溫保存

本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法。大多數(shù)微生物如病毒、噬菌體，立克氏體，各種細菌、放細菌、支原體，各種絲狀菌、酵母、藻類和原蟲，特別是一些無法用凍干保存的微生物，都可用此法長期保存。工業(yè)微生物高產(chǎn)菌種也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在-130℃以下溫度時，它的新陳代謝作用停止，化學(xué)反應(yīng)也消失，而液氮溫度可達-196℃，在這種情況下可以長期保存。

七、液氮超低溫保存本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法。1、保護劑與冷凍干燥保存一樣，液氮保存菌種也需要有保護物質(zhì)，可以用10%的甘油，使用方便、效果好，但有些菌對甘油敏感，效果不佳，可選用其他保護劑，常用的有5%～10%(V/V)二甲基亞砜；20%二甲亞砜加1%蛋白陳；汪溫80及0.4mmol聚乙烯氮戊環(huán)等，糖類也可作為一種保護劑，但濃度適當(dāng)加以控制。1、保護劑國內(nèi)外菌種保藏機構(gòu)菌種是一個國家的重要資源，世界各國對菌種的保藏都極為重視。世界上有700多家菌菌種保藏機構(gòu)，其中國際知識產(chǎn)權(quán)組織承認的法定的保藏機構(gòu)僅有28家。國內(nèi)外菌種保藏機構(gòu)菌種是一個國家的重要資源，世界各國對菌種的普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）中科院微生物所，北京，中科院武漢病毒研究所農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，北京（ISF）工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）中國食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究院，北京，（IFFI）醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC）中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，南京衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所抗生素菌種保藏管理中心（CACC）中國醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院抗生素研究所，北京四川抗生素工業(yè)研究所，成都華北制藥廠抗生素研究所，石家莊獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品檢察所，北京普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）美國標(biāo)準菌種收藏所（ATCC）美國冷泉港研究所（CSH）日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所（IAM）日本東京科研化學(xué)有限公司（KCC）日本大阪發(fā)酵研究所（IFO）英國國立標(biāo)準菌種收藏所（NCTC）美國國立衛(wèi)生研究所（NIH）美國農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部（NRRL）美國標(biāo)準菌種收藏所（ATCC）菌種的衰退與復(fù)壯1、菌種衰退

菌種經(jīng)過長期人工培養(yǎng)或保藏，由于自發(fā)突變的作用而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象。菌種的衰退與復(fù)壯1、菌種衰退菌種退化的原因

基因突變；變異菌株性狀分離；誘變的單菌落是由—個以上孢子或細胞形成菌落由—個孢子或單個細胞形成，但它是多核細胞單核孢子發(fā)生突變時，雙鏈DNA上僅—條鏈上某個位點發(fā)生變化菌種退化的原因連續(xù)傳代其它因素菌種保藏不當(dāng)生長條件不滿足（培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件）連續(xù)傳代防止菌種退化的措施控制傳代次數(shù)選擇合適的培養(yǎng)條件選擇合適的保藏方法菌種穩(wěn)定性檢查分離復(fù)壯防止菌種退化的措施2、菌種復(fù)壯使衰退的菌種重新恢復(fù)原來的優(yōu)良特性。復(fù)壯措施：對已衰退菌種配合一定培養(yǎng)條件進行單細胞分離純化淘汰衰退的個體選擇合適的培養(yǎng)基2、菌種復(fù)壯第五節(jié)生產(chǎn)菌種的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。第五節(jié)生產(chǎn)菌種的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管作為種子的準則菌種細胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短；生理性狀穩(wěn)定；菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；無雜菌污染；保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。種子擴培的目的接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平作為種子的準則一、種子的制備過程種子制備的過程大致可分為：實驗室種子制備階段生產(chǎn)車間種子制備階段一、種子的制備過程種子制備的過程大致可分為：（一）實驗室種子的制備實驗室種子的制備一般采用兩種方式對于產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基或斜面（靜置培養(yǎng)）培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法(通過搖瓶培養(yǎng)提供比較好的溶氧）。（一）實驗室種子的制備實驗室種子的制備一般采用兩種方式孢子的制備1、細菌孢子的制備細菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37?C。細菌菌體培養(yǎng)時間一般為1~2天，產(chǎn)芽孢的細菌培養(yǎng)則需要5~10天。孢子的制備1、細菌孢子的制備2、霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度一般為25~28?C。培養(yǎng)時間一般為4~14天。2、霉菌孢子的制備3、放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28?C。培養(yǎng)時間為5~14天。3、放線菌孢子的制備液體種子制備1、好氧培養(yǎng)：對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S.griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S.Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體（短菌絲），作為種子。試管→三角瓶→搖床→種子罐液體種子制備1、好氧培養(yǎng)：2、厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）試管→三角瓶→卡式罐→種子罐2、厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）（二）生產(chǎn)車間種子制備實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。（二）生產(chǎn)車間種子制備實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子1、種子罐的作用主要是使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。1、種子罐的作用2、種子罐級數(shù)的確定種子罐級數(shù)：是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)。種子罐級數(shù)取決于：菌種生長特性（如菌種傳代后的穩(wěn)定性）、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；所采用發(fā)酵罐的容積另外還與發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最低接種量（種子液體積/培養(yǎng)液體積）以及種子罐與發(fā)酵罐的容積比等有關(guān)。2、種子罐級數(shù)的確定細菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵孢子懸浮液→一級種子罐（27?C,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→二級種子罐（27?C,10~24小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子（二級發(fā)酵）。細菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。確定種子罐級數(shù)需注意的問題種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機會雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。

確定種子罐級數(shù)需注意的問題二、種子