天天礦野生鐵木種子的休眠及萌發(fā)特性

天天礦野生鐵木種子的休眠及萌發(fā)特性

0不同成熟時胚不同溫度對種子萌發(fā)的影響受棲息地喪失和人類活動的影響，瀕危物種在當(dāng)前狀態(tài)和長期維持能力方面的下降。繁殖困難是許多瀕危物種自我更新過程中最重要的問題之一。種子發(fā)芽是繁殖過程中的一個重要環(huán)境因素。種子發(fā)芽不僅需要水、氧氣、溫度等外部環(huán)境條件，還需要種子本身的良好發(fā)育。如果條件適宜，種子恢復(fù)也被認(rèn)為是阻礙種子萌發(fā)的一個因素。這種睡眠可以促進(jìn)種子在適當(dāng)?shù)募竟?jié)和環(huán)境條件下的發(fā)芽，這也是控制種子在不同季節(jié)和環(huán)境條件下接收的主要方式。這是植物的一個重要適應(yīng)特征。不同的植物需要根據(jù)不同的條件建立新的個體，這是適應(yīng)不同環(huán)境的方式。因此，存在著許多與氣候和棲息地多樣性相一致的失眠機(jī)制。從休眠機(jī)制來看,種子休眠一般可分為5種類型:內(nèi)源性的生理休眠(Physiologicaldormancy,PD)、形態(tài)休眠(Morphologicaldormancy,MD)和形態(tài)生理休眠(Morphophysiologicaldormancy,MPD),外源性的結(jié)構(gòu)休眠(Physicaldormancy,PY)和組合休眠(結(jié)構(gòu)休眠+生理休眠,PY+PD).PD是種子的胚生長潛力低不能突破機(jī)械阻力而導(dǎo)致的休眠,MD類型是種子成熟時胚小且發(fā)育不完全,需要生長到一定長度后才可突破種子發(fā)芽,MPD是形態(tài)和生理的聯(lián)合原因?qū)е?通?？苫谥形话l(fā)芽時間(Medianlengthofgerminationtime,MLG)判斷休眠類型,如果種子成熟時胚已經(jīng)生長完全則屬于PD或者不休眠(Non-dormant,ND)類型,MLG若大于30d一般為PD,若少于30d則一般為ND;如果種子成熟時胚沒有生長到足夠長,則屬于MD或者M(jìn)PD類型,在適宜條件下MLG不超過30d就是MD,超過30d即為MPD.外源性的PY是由于種皮或果皮上有一層或幾層?xùn)艡诩?xì)胞(palisadecells)導(dǎo)致水分不能透過種皮而無法發(fā)芽的休眠方式.PY+PD是結(jié)構(gòu)休眠和生理休眠的結(jié)合.鐵木屬(Ostrya)是樺木科(Betulaceae)一屬,包括7個物種,分布于亞洲東部、歐洲、北美洲和中美洲,我國有4種.其中天目鐵木(Ostryaredheriana)為我國浙江天目山特有的珍稀樹種,是該屬分布于我國東部的唯一種類,在系統(tǒng)發(fā)育和生物地理方面有獨(dú)特性.目前全世界僅殘存5株野生植株,生存狀況極度瀕危,加之其更新能力很弱,野外環(huán)境種子萌發(fā)率極低.雖然通過扦插等無性繁殖方法獲得了新個體,但成活率不高.有性生殖時幼苗對生長條件要求苛刻,不易存活.若不及時采取有效繁殖措施,將有滅絕的危險.本文對采自天目山野生植株的種子進(jìn)行休眠和萌發(fā)特征分析,探討以下問題:①天目鐵木種子是否休眠?屬于哪種休眠類型?②種子成熟后低溫儲存是否有利于種子萌發(fā);③種子萌發(fā)的適宜條件.以期為天目鐵木的有性繁殖提供理論價值,為其遷地保護(hù)提供科學(xué)依據(jù).1材料和方法1.1上海市立地條件現(xiàn)存野生天目鐵木分布于浙江臨安天目山國家級自然保護(hù)區(qū)(E191°24′11″-119°27′11″,N30°18′30″-30°21′37″),屬北亞熱帶氣候,四季分明,氣候溫和,雨量充沛,光照適宜.從山麓至山頂年均溫14.8～8.8℃,年降水量1390～1870mm,年日照時數(shù)1550～2000h,土壤隨海拔升高由亞熱帶紅壤向溫帶型棕黃壤過渡.分別于2008年和2009年11月份在天目山采集野生天目鐵木果實(shí),帶回華東師范大學(xué)以備室內(nèi)和室外萌發(fā)實(shí)驗(yàn).上海市屬于北亞熱帶季風(fēng)性氣候,雨熱同期,日照充分,雨量充沛,四季分明.全年平均氣溫16.9℃,年降水量約為1272mm,年日照時間約1810h.1.2種子采集和重量測定采集后先剝掉外部果苞,留下褐色小堅果.因其果皮小而堅硬,不易與種皮分離,為符合習(xí)慣,將小堅果稱為種子.種子放置于室溫干燥處低溫保存.隨機(jī)抽取種子50粒,用游標(biāo)卡尺測量長度、寬度和厚度.隨機(jī)取100粒為1組,共8組,用電子天平稱量每組重量.1.3種子平均吸水率的測定隨機(jī)選取150粒種子進(jìn)行吸水實(shí)驗(yàn),3組重復(fù)每組各50粒,先用電子天平秤取每組質(zhì)量,然后放置于培養(yǎng)皿中用蒸餾水濕潤的濾紙上,在25℃恒溫培養(yǎng)箱中分別浸泡1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、24、48、72、96、144h后將種子撈出,用定量濾紙吸干表面水份,室溫下快速稱重.計算種子平均吸水率,做吸水曲線.吸水率計算公式:吸水率=(Wt-W0)/W0×100%,Wt為種子吸水t時間后的質(zhì)量,W0為實(shí)驗(yàn)前的起始質(zhì)量.1.4打開睡眠和發(fā)芽實(shí)驗(yàn)1.4.1實(shí)驗(yàn)開始萌發(fā)把種子分成兩部分進(jìn)行不同時間的萌發(fā)實(shí)驗(yàn):一部分經(jīng)過約4周在冬季室溫下進(jìn)行低溫保存后(11月至12月份),于12月底開始萌發(fā),實(shí)驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行.另一部分在冬季室溫下低溫儲存約16周(11月至次年3月份),于次年3月中旬進(jìn)行培養(yǎng)箱內(nèi)(2008年和2009年種子)和室溫下(2009年種子)萌發(fā)實(shí)驗(yàn).儲存期間如有發(fā)霉的種子則清除.萌發(fā)前先將干燥種子用0.3%的K2MnO4溶液浸泡30min進(jìn)行消毒,再用蒸餾水浸泡48～72h,待種皮軟化后沖洗干凈,開始萌發(fā)實(shí)驗(yàn).1.4.2浸泡法l-1和400gl-1在培養(yǎng)箱中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)條件是,設(shè)置3種濃度赤霉酸(gibberellicacid,GA3)溶液:不施、200mg·L-1和400mg·L-1,在溶液中浸泡4h;每種濃度下設(shè)置3個變溫條件:15/25、10/20、5/15℃,與變溫匹配無光照12h與光照12h交替.另一種萌芽方式為室溫下萌發(fā),設(shè)置4種濃度施用赤霉酸溶液(0、200、400和600mg·L-1)進(jìn)行.每處理3個重復(fù),每皿放置40～50粒種子,每天加水控制在濾紙不干、培養(yǎng)皿內(nèi)不積水.1.4.3光照和光照選用200mg·L-1或400mg·L-1赤霉酸處理的種子,15/25℃或室溫下,分別在有光照和無光照兩種條件下萌發(fā).黑暗條件設(shè)置為用錫箔紙完全包住培養(yǎng)皿,光照條件為光照12h和黑暗12h交替,光照12h溫度為變溫的高溫,黑暗12h為低溫,每皿40～50粒種子,各3組重復(fù),培養(yǎng)條件與上面相同.1.4.4草炭土的萌發(fā)設(shè)置濾紙、草炭土和土壤3種萌發(fā)基質(zhì).選用200mg·L-1赤霉酸處理的種子,15/25℃在濾紙和草炭土兩種基質(zhì)上萌發(fā).另選取400mg·L-1赤霉酸處理的種子,室溫下分別置于濾紙和土壤中萌發(fā).濾紙條件同前,草炭土為市場上購到的培養(yǎng)土,土壤為校園內(nèi)大樹下取的濕潤細(xì)土,在培養(yǎng)皿上鋪一層草炭土或土壤,種子均勻擺放后用細(xì)土覆蓋,滴加蒸餾水使土濕潤.每皿40～50粒,3組重復(fù),培養(yǎng)條件與前面相同.1.5數(shù)據(jù)處理和分析種子大小和重量計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù),得出種子的千粒重.以種子胚根長度超過2mm作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn),從播種第1天開始每天記錄種子的萌發(fā)個數(shù),直到連續(xù)30d沒有新萌發(fā)的種子為止,萌發(fā)的種子移出至新容器中.用下述公式計算每種條件下種子的發(fā)芽率:發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子粒數(shù)/參試種子總粒數(shù))×100%.采用t檢驗(yàn)和方差分析(ANOVA)比較不同條件下的發(fā)芽率差異,多重比較采用Duncan檢驗(yàn).數(shù)據(jù)處理采用R軟件進(jìn)行.2結(jié)果2.1度、厚度及重、分布經(jīng)測量,天目鐵木種子的平均長度、寬度、厚度分別為9.628mm、2.191mm、0.927mm,千粒重為9.9844g(見表1).2.2重量與浸水之初種子從浸水之初即開始吸水,至1h吸水率為8%但與開始浸水時重量無差異(p>0.05),從第4小時開始(吸水率為20%)重量與浸水之初有顯著差異(p<0.05),24h后吸水率達(dá)到34%,至144h則為66%(見圖1).2.3種子發(fā)芽特性2.3.1不同溫度對發(fā)芽率的影響不同濃度赤霉酸溶液和不同溫度梯度下的發(fā)芽情況如圖2所示,總體上,經(jīng)4周低溫儲存的種子萌發(fā)率高于16周低溫儲存的(p<0.05,t-test).經(jīng)過16周低溫儲存的種子(見圖2),不施用GA3時,15/25℃的發(fā)芽率顯著高于5/15℃和10/20℃(p<0.05,ANOVA).經(jīng)過4周低溫的種子(見圖2),GA3濃度為400mg·L-1時,15/25℃的發(fā)芽率顯著高于5/15℃和10/20℃(p<0.05,ANOOVA),達(dá)28.52%.溫度為15/25℃時,200mg·L-1和400mg·L-1濃度的GA,下發(fā)芽率高于不施GA3(p<0.05,ANOVA).3種溫度的發(fā)芽進(jìn)程如圖3所示.每個溫度下發(fā)芽率隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加,低溫(5/15℃)時培養(yǎng)64d開始萌發(fā)(200mg·L-1GA3),較高溫度(10/20℃和15/25℃)培養(yǎng)29d即開始萌發(fā)(400mg·L-1GA3),溫度越高累積萌發(fā)率增長越快.3個溫度下培養(yǎng)至99d,累積萌發(fā)率不再增加.從培養(yǎng)至萌發(fā)的時間長度中位數(shù)(MLG)為54d.最終15/25℃,400mg·L-1GA3經(jīng)過4周低溫儲存的種子萌發(fā)率最高,為28.52%(見圖3C).經(jīng)雙尾ANOVA檢驗(yàn)(見表2),低溫儲存時間長短、培養(yǎng)溫度和赤霉酸濃度對天目鐵木種子發(fā)芽率的影響均顯著(p<0.05,ANOVA),3種因素的作用重要性為低溫儲存時間長短>培養(yǎng)溫度>施用赤霉酸濃度.但3種因素的交互作用對發(fā)芽率都沒有顯著影響(p>0.05,ANOVA).2.3.2不同施肥用量的ga3種子萌發(fā)率經(jīng)過較長低溫(約16周)分別施用0、200、400和600mg·L-1的GA3于3月份進(jìn)行室溫下萌發(fā),結(jié)果為不施GA3種子發(fā)芽率最低為0.67%,而施用600mg·L-1GA3的種子萌發(fā)率最高,為10.67%(p<0.05,ANOVA).2.3.3不同培養(yǎng)基質(zhì)發(fā)芽率的變化在光暗交替或完全黑暗的條件下(見表3),濃度為400mg·L-1的GA,時,累積發(fā)芽率沒有顯著差異(p>0.05,t-test).只有經(jīng)過4周低溫儲存的種子,GA3濃度200mg·L-1溫度為15/25℃時,光暗交替下的發(fā)芽率大于黑暗的(p<0.05,t-test).不同培養(yǎng)基質(zhì)(見表3),4周低溫儲存的種子在濾紙培養(yǎng)下的發(fā)芽率大于草炭土(p<0.05,t-test),草炭土沒有發(fā)芽的種子.經(jīng)過16周低溫儲存的種子在兩種培養(yǎng)基質(zhì)下發(fā)芽率沒有顯著差異(p>0.05,t-test).3不同成熟時間的種子萌發(fā)種子休眠是一段特定的時間內(nèi)任何正常環(huán)境因子組合下,種子即使處于最適條件下也不萌發(fā)的階段,是物種本身的遺傳特征,也會受到大量環(huán)境因素的影響.一般情況下,外源性結(jié)構(gòu)休眠(PY)的種子由于種皮難以透水,在浸水24h后重量不會增加.但從本研究的吸水實(shí)驗(yàn)來看,天目鐵木種子浸水24h重量顯著增加(p<0.05,ANOVA),吸水率為自身重量的34%,表明種子萌發(fā)不受外源性休眠的制約.一般認(rèn)為,低溫能夠打破大多數(shù)植物種子的休眠,主要通過激發(fā)分解酶的活性以促進(jìn)種子儲藏蛋白(seedstorageprotein)的分解,從而為種子萌發(fā)和幼苗生長提供營養(yǎng)物質(zhì),生理休眠(PD)的種子往往多是這種類型.然而,本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過4周低溫的種子累積發(fā)芽率卻高于16周低溫的種子(p<0.05,t-test,圖1),表明經(jīng)歷越長的低溫反而不利于種子萌發(fā).張若蕙等對天目鐵木種子的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)也表明,11月份新采摘種子的萌發(fā)率為16.2%,經(jīng)過冬季低溫后于次年3月的發(fā)芽率僅為6.2%.Fehrenbach對同屬的美洲鐵木(O.virginiana)研究也得到類似結(jié)果,認(rèn)為幼嫩的種子在采摘后立即種下可以獲得更高的發(fā)芽率.這種成熟后可立即萌發(fā)的種子可能屬于不休眠(ND)類型.但是,如果天目鐵木種子成熟后沒有遇到適宜條件,隨后經(jīng)歷冬季的時間越長萌發(fā)率越低,表明低溫可能促使種子進(jìn)入休眠狀態(tài).雖然低溫是打破大多植物種子休眠的條件,但是有些植物的種子在低溫下會被誘導(dǎo)休眠,如忍冬科(Caprifoliaceae)的Diervillalonicera在自然狀況下冬天播種的種子在低溫下被誘導(dǎo)進(jìn)行PD.對同屬的美洲鐵木和歐洲鐵木(O.carpinifolia)的報道都表明,一旦剛剛成熟時沒有播種萌發(fā),種子則進(jìn)入頑固的休眠期,之后則需要打破內(nèi)源性休眠才可發(fā)芽,并且打破休眠需要3個月的熱層積和5個月的低溫層積,而后還需較長的培養(yǎng)時間才可獲得較高的發(fā)芽率.因此,天目鐵木采摘后經(jīng)歷低溫越長的種子(約16周)估計被誘導(dǎo)成較為深度的休眠狀態(tài),比經(jīng)歷低溫時間短的種子(約4周)發(fā)芽率低.種子萌發(fā)進(jìn)程表明(見圖2),從給予適宜的溫度開始至種子萌發(fā)最短需要29d(10/20℃和15/25℃,400mg·L-1GA3),最長則在第99天觀察到萌發(fā)的種子(10/20℃,200mg·L-1GA3),中位時間長度是54d,表明種子萌發(fā)需要經(jīng)歷高溫(>15℃)打破休眠,并且萌發(fā)過程需要較長時間(>30d).根據(jù)Baskin等對種子休眠方式的劃分,種子萌發(fā)時間超過30d的一般是PD或者M(jìn)PD,這兩種類型的區(qū)別主要取決于種子成熟時胚是否生長到接近發(fā)芽時胚的大小.據(jù)報道,天目鐵木種子剛剛成熟時即可發(fā)芽,推測胚已經(jīng)生長完全,因此隨后進(jìn)入的休眠可能是PD類型,但需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí).本實(shí)驗(yàn)表明天目鐵木種子在15/25℃萌發(fā)率最高,是較為適宜的溫度.25℃左右同樣是許多植物種子發(fā)芽的最適溫度,如20～30℃培養(yǎng)下,同為樺木科的赤楊(Alnusglutinosa)種子發(fā)芽率最高;藍(lán)靛果忍冬(Loniceracaeruleavar.emphyllocalyx)的種子在20℃或者15/25℃溫度是最優(yōu)的發(fā)芽條件.種子休眠的內(nèi)部機(jī)制是激素的調(diào)控,主要由維持休眠的脫落酸(abscisicacid,ABA)和促進(jìn)發(fā)芽的赤霉素(gibberellins,GA)兩種激