實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用課件

實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用(RealtimeQuantitativePCR)實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用1講座提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用講座提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量2實時熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法實時熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)3實時熒光定量PCR原理實時原理常規(guī)PCR技術(shù)：

對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析實時熒光定量PCR原理4實時熒光定量PCR原理定量原理介紹三個概念：擴增曲線、熒光閾值、Ct值如何對起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析實時熒光定量PCR原理定量原理介紹5實時熒光定量PCR原理-----------擴增曲線擴增曲線圖：

橫坐標(biāo)：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強度每個循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號的收集熒光基團(tuán)熒光檢測元件實時熒光定量PCR原理-----------擴增曲線擴6實時熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號閾值（threshold）：

前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99真正的信號:熒光信號超過域值實時熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號閾7實時熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)C(t)value實時熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義8實時熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進(jìn)行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性實時熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸9實時熒光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反應(yīng)：

X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：

X=X0(1+Ex)nn：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴增效率實時熒光定量PCR原理---------定量原理理想10實時熒光定量PCR原理---------定量原理在擴增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時:XCt=X0

(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴增信號達(dá)到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得:logM=logX0

(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:

logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量實時熒光定量PCR原理---------定量原理在擴11實時熒光定量PCR原理---------標(biāo)準(zhǔn)曲線模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量實時熒光定量PCR原理---------標(biāo)準(zhǔn)曲線12確定未知樣品的C(t)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample實時熒光定量PCR原理絕對定量25確定未知樣品的C(t)值Sample實時熒光定量PCR原13講座提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用實時熒光定量PCR原理

實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用講座提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量14非特異性熒光標(biāo)記：1、SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：2、TaqMan3、MolecularBeacon4、Amplisensor實時熒光定量PCR原理---------DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記QQR非特異性熒光標(biāo)記：實時熒光定量PCR原理-------15實時熒光定量PCR方法1---------SYBRGreen法SYBRGreen實時熒光定量PCR方法1---------SYBRG16SYBRGreen法工作機理SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBRGreenSYBRGreen法17實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI工18實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析溫度熒光強度TmTm值：DNA解鏈一半時的溫度實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔19實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)-dIdTTm實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔20SYBRGreen法融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確非特異性產(chǎn)物SYBRGreen法21CyclenumberFlourescencCk102Ck104SampleCyclenumberLogofDNAconcentrationSYBRGreen法定量原理模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量CyclenumberFlourescencCk10222SYBRGreen法------------PCR反應(yīng)的建立反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準(zhǔn)MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)Buffer體系的優(yōu)化反應(yīng)溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同SYBRGreen法------------PC23天為時代公司利用SYBRGreen法定量檢測樣品DNA天為時代公司利用SYBRGreen法定量檢測樣品DNA24SYBRGreen法應(yīng)用范圍起始模板的測定基因型的分析融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。SYBRGreen法25SYBRGreen法優(yōu)缺點對DNA模板沒有選擇性----適用于任何DNA使用方便-----不必設(shè)計復(fù)雜探針非常靈敏便宜優(yōu)點容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對引物特異性要求較高缺點SYBRGreen法26與目標(biāo)序列互補實時熒光定量PCR方法2-------TaqMan法TaqMan---水解型雜交探針5′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針與目標(biāo)序列互補實時熒光定量PCR方法2-------Ta27TaqMan法工作原理每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光TaqMan法28TaqMan法PCR反應(yīng)的建立1、引物、探針的設(shè)計：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應(yīng)參數(shù)的確定：

一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度72℃，45S，3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同TaqMan法29已肝病人血液中HBV的絕對定量目的：利用核酸檢測，縮短檢驗時間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù)方法：從血液中提取病毒DNA，擴增病毒基因，以TaqMan探針進(jìn)行檢測設(shè)置對照：濃度為106、105、104103的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個，設(shè)陰性和空白對照實驗步驟：提取HBVDNA設(shè)計特異引物設(shè)計TaqMan探針并標(biāo)記探針擴增程序結(jié)果：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù)利用TaqMan法檢測血液中的HBV已肝病人血液中HBV的絕對定量利用TaqMan法30數(shù)據(jù)分析分析結(jié)果：HBVDNA的精確copy數(shù)為3.7X105利用TaqMan法檢測血液中的HBV數(shù)據(jù)分析分析結(jié)果：HBVDNA的精確copy數(shù)為3.7X31TaqMan法應(yīng)用范圍起始模板的定量基因型分析目的基因定量產(chǎn)物鑒定SNP分析TaqMan法32TaqMan法優(yōu)缺點對目標(biāo)序列的高特異性------陰性結(jié)果確定設(shè)計相對簡單------與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補重復(fù)性比較好優(yōu)點只適合一個特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價格較高不易找到本底低的探針缺點TaqMan法33實時熒光定量PCR方法3-------Molecularbeacon法(分子信標(biāo))標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補莖由互補配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑發(fā)夾型雜交探針實時熒光定量PCR方法3-------Molecula34Molecularbeacon(分子信標(biāo))工作原理熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）探針與DNA雜交時產(chǎn)生熒光-----變性過程：產(chǎn)生非特異性熒光-----延伸過程：不產(chǎn)生熒光------退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光信號Molecularbeacon(分子信標(biāo))工35Molecularbeacon(分子信標(biāo))應(yīng)用范圍起始模板的定量基因型分析產(chǎn)物鑒定SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析Molecularbeacon(分子信標(biāo))36Molecularbeacon(分子信標(biāo))優(yōu)缺點高特異性：對目標(biāo)序列檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點只能用于一個特定目標(biāo)設(shè)計困難價格比較高缺點Molecularbeacon(分子信標(biāo))37講座提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹

實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用講座提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量38實時熒光定量PCR法標(biāo)準(zhǔn)樣品相對定量中的內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA實時熒光定量PCR法39實時熒光定量PCR法標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA拷貝數(shù)

用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品如何設(shè)定？含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質(zhì)粒含有和待測樣品相同擴增片段的cDNA紫外分光光度計或熒光酶標(biāo)測定濃度根據(jù)質(zhì)?；騝DNA分子量換算成拷貝數(shù)，做系列稀釋實時熒光定量PCR法標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA拷貝數(shù)用40實時熒光定量PCR法定量方法絕對定量檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常用到標(biāo)準(zhǔn)曲線相對定量確定經(jīng)過不同處理的樣本目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間基因的表達(dá)差異（不同時相）

2-△C（t）雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法實時熒光定量PCR法41實時熒光定量PCR法TaqMan法舉例TaqMan法研究ERBB2在乳腺腫瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)差異實時熒光定量PCR法TaqMan法舉例42TaqMan法舉例標(biāo)記探針使用TaqMan探針進(jìn)行雙通道熒光定量Fam標(biāo)記目標(biāo)基因探針VIC標(biāo)記看家基因探針TaqMan法舉例43TaqMan法舉例材料準(zhǔn)備從正常乳腺組織中提取的總RNA從乳腺癌組織中提取的總RNA含ERBB2andGAPDH的質(zhì)粒用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線單雙通道同時進(jìn)行，獨立分析ControlsnoRNA：陰性對照RNA+noreversetranscriptase：基因組對照TaqMan法舉例44TaqMan法舉例反應(yīng)程序RT-qPCR反應(yīng)程序：50oC,30min95oC,15min94oC,15sec60oC,1minplateread10oC,foreverEnd35moretimesTaqMan法舉例45TaqMan法舉例癌癥標(biāo)記物表達(dá)Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2TaqMan法舉例46TaqMan法舉例實驗結(jié)果單雙通道相互驗證A.MultiplexReactionsHealthyRNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65±0.1526.80±0.32B.SingleplexreactionsHealthyRNACarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70±0.0326.82±0.24TaqMan法舉例實驗結(jié)果單雙通道相47TaqMan法舉例實驗結(jié)果定量Copiesng/μlTotalRNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB210951052213024922.16XGAPDH95500857301360001308001.45XTaqMan法舉例實驗結(jié)果48TaqMan法舉例實驗結(jié)果定量分析ERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.01150.0180.018/0.011GraphCopiesng/μlTotalRNATaqMan法舉例實驗結(jié)果49TaqMan法舉例實驗結(jié)果表達(dá)差異HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpressionERBB2的表達(dá)差異TaqMan法舉例實驗結(jié)果50TaqMan法舉例實驗結(jié)果討論通過RT-qPCR成功檢測了ERBB2基因在不同組織的表達(dá)差異；在乳腺癌組織中，ERBB2的表達(dá)量是正常水平的1.8倍TaqMan法舉例實驗結(jié)果51實時熒光定量PCR法SYBRGreenI法舉例利用SYBRGreen1進(jìn)行GMO定量(SGI)forGMOsoydetection實時熒光定量PCR法SYBRGreen52SYBRGreenI法GMO概念轉(zhuǎn)基因生物又稱遺傳修飾生物（GeneticallyModifiedOrganisms，GMO），是經(jīng)基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成的生物，包括轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因微生物和轉(zhuǎn)基因動物。SYBRGreenI法53SYBRGreenI法GMO概念1983年：首例轉(zhuǎn)基因植物－轉(zhuǎn)基因煙草1986年：轉(zhuǎn)基因植物首次進(jìn)入田間實驗1994年：首例轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品－FlavrSavr延熟保鮮轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)入市場1996年－至今：轉(zhuǎn)基因作物迅猛發(fā)展期SYBRGreenI法54SYBRGreenI法檢測方法轉(zhuǎn)基因生物包括了特異的核酸序列，調(diào)控序列、目標(biāo)基因、報告基因通過內(nèi)源基因來對每個樣品DNA進(jìn)行定量（Normalization)利用插入基因的定量來進(jìn)行GMO含量檢測SYBRGreenI法55SYBRGreenI法材料準(zhǔn)備RoundupReady大豆（RTC公司，IRMM-41050-56）普通非轉(zhuǎn)基因大豆從超級市場買來的下列食物用來作為測試樣品： 大豆餅,豆制甜點和兩個牌子的大豆粉SYBRGreenI法56SYBRGreenI法樣品制備標(biāo)準(zhǔn)品的制備:轉(zhuǎn)基因成分含量分別為0%,0.1%,0.5%,1%,2%和5%轉(zhuǎn)基因大豆實驗樣本–從含大豆成分的樣本中提取DNADNAfromStandard/SamplePCRmixGMOprimersTUBE1TUBE2PCRmixLectinprimersSYBRGreenI法57SYBRGreenI法引物設(shè)計Lectin擴增片段長度為318bp其引物為：正向：5’-GAC-GCT-ATT-GTG-ACC-TCC-TC-3’，反向：5’-GAA-AGT-GTC-AAG-CTT-AAC-AGC-GAC-G-3’EPSPS擴增片段長度為356bp其引物為：正向：5’-TGG-CGC-CCA-AAG-CTT-GCA-TGG-C-3’反向：5’-CCC-CAA-GTT-CCT-AAA-TCT-TCA-AGT-3’

SYBRGreenI法58SYBRGreenI法△C（t）定量

logA/B=logA-logB

A:EPSPSGMO

B:Lectinallbean

A/B:%GMO%GMO△C（t）

SYBRGreenI法59SYBRGreenI法測GMO數(shù)據(jù)收集與分析標(biāo)準(zhǔn)曲線log%GMO對應(yīng)△C（t）獲得熔解曲線分析，檢測擴增產(chǎn)物數(shù)據(jù)處理：

C（t）EPSPS-C（t）lectin=△C（t）處理條件：假定兩對引物有相同的擴增效率并且相互獨立擴增。

SYBRGreenI法測GMO數(shù)據(jù)收集與分析60SYBRGreenI法測GMO熔解曲線分析Tm=~92oC熔解曲線–Lectin擴增

Tm=~88.5oC熔解曲線–epsps

擴增SYBRGreenI法測GMO61SYBRGreenI法測GMO實驗結(jié)果1:標(biāo)準(zhǔn)曲線不同轉(zhuǎn)基因成分含量與Ctepsps做標(biāo)準(zhǔn)曲線Cp4-epspsSYBRGreenI法測GMO實驗結(jié)果1:標(biāo)62SYBRGreenI法測GMO實驗結(jié)果2:

樣品的擴增曲線LectinepspsFoodSample#2FoodSample#1SYBRGreenI法測GMO實驗結(jié)果2:樣品的63SYBRGreenI法測GMO實驗結(jié)果：

定量分析Standards/SampleC(t)epspsC(t)Lectin0ND22.60.1ND22.60.528.222.51.027.222.52.026.222.85.024.622.7SoyDessert24