循環(huán)腫瘤細胞與腫瘤精準醫(yī)學

第44卷第5期■專題綜述*張?zhí)烊虎佗冖?高正良①②?,鄧丹④??屬上海市養(yǎng)志康復醫(yī)院基礎研究中心，上海201619；③復旦大學基礎醫(yī)學院，上海市重大傳染病和生物安全循環(huán)腫瘤細胞(circulatingtumorcells,CTCs)發(fā)現(xiàn)，尤其是在近20多年來，伴隨CTCs生物學1CTCs基礎生物學腫瘤轉移和散播是癌癥相關死亡的主要原因。CTCs是從原發(fā)或轉移腫瘤中脫落并進入血對疾病進展至關重要[1]。腫瘤轉移和散播是一個到達遠端組織[2]。概括而言，CTCs的形成和轉腫瘤細胞經歷上皮–間質轉化，細胞微環(huán)境也隨之改變[3]。一旦CTCs離開循環(huán)后在遠端組織中成腫瘤轉移和散播[4-5](圖1)。顯然，CTCs是腫瘤轉移的中間階段和載體，但是具有腫瘤干細胞特征和起始能力的CTCs只是少數(shù)，最終形成克隆、造成轉移和散E-mail:dengdan1234567@12播新病灶的則更罕見。即便是在腫瘤高度擴散的情況下，單個患者的轉移病灶通常也不超過數(shù)百個，不是每個CTC都能夠起始新的病灶，導致腫瘤轉移和散播[6-7]。相反，在外周循環(huán)中，大多數(shù)CTCs由于受到物理壓力、氧化應激、免疫攻擊以及生長因子和細胞因子的饑餓或者刺激，而死于循環(huán)和轉移過程[8-9]；少部分CTCs成功進入遠端組織，在新的微環(huán)境中暫停號，部分休眠CTCs被喚醒激活，重新進入細胞腺癌和前列腺癌中，休眠的CTCs甚至可以導致早期診斷偏差及治療數(shù)年后的復發(fā)，并產生繼發(fā)性CTCs[11]。CTC簇是指具有穩(wěn)定細胞間連接、可以共同穿過血流的含有兩個及兩個以上細胞的CTC團，或三個及更多CTCs聚集而成的循環(huán)腫瘤微栓塞(circulatingtumormicroem腫瘤微環(huán)境是由浸潤的免疫細胞及與癌癥相關的成纖維細胞、間質細胞、周細胞和腫瘤基質等組成，對腫瘤細胞的起始、生長、進展和轉移具有重大影響[14-15]。CTC簇的形成可以是皮細胞、周細胞等的存在，可以增加細胞簇中CTCs的生存力，抵抗或逃避壓力和免疫攻擊，境”而獲得獨特的生存優(yōu)勢[18-19]。體外使用微流理，更好地解析微環(huán)境對CTCs轉移的影響并進行抗轉移藥物的篩選[20]。盡管CTC簇在外周循環(huán)中十分稀少，遠少于單個CTC的數(shù)量，但是CTC簇細胞中Oct4、Nanog和Sox2等多能性轉錄因子在基因組上的結具有明顯的干細胞特征，因而具有更強(20～100第44卷第5期■專題綜述成和較強轉移潛能的決定性因素[22]。當外科手術存在CTM時，CTCs轉移增加，外周血中CTCsCTC簇還可以迅速發(fā)生可逆性重塑，形成鏈狀結耐藥性和復發(fā)息息相關[25]。單細胞分析表明，ITH的程度，并對預后和耐藥的研究具有重要意義[1]。腫瘤細胞傳播的路徑(淋巴管或血管)、入環(huán)境互相作用或隨機進入循環(huán)系統(tǒng))、壓力(比如腫瘤治療)不同，都可能導致CTCs的異質性，甚至采血部位不同檢測到的異質性也會不同[26-27]。究表明EpCAM-和/或CK-的CTCs的存在[28-29]，使得分離純化代表性的CTCs亞群變得更加具有挑戰(zhàn)。而患有雌激素受體(ER)+/人類表皮生長因子CTCs能夠共存，并相互動態(tài)轉換[30]。腫瘤細胞的上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)程序的激活是腫瘤轉移、散播過程中的關鍵事件，也是CTCs異質性產生的一個重要環(huán)節(jié)。從原發(fā)性腫瘤中脫落的單個腫瘤細胞侵入血管并流向全身，部分細胞失去上皮特征，獲得間質細胞的特征；在離開血液進入遠端組織時，再經歷間質-上皮轉化EMT能夠導致脫落的腫瘤細胞(CTCs)上皮標志瘤侵襲和EMT的特征[32-33]。EMT過程中E型鈣黏蛋白(E-cadherin)丟失，細胞間黏附破壞，β-聯(lián)蛋白(β-catenin)核定位增加，而在間質細胞、成纖維細胞、神經組織和癌細胞中高度表達的N型鈣黏蛋白(N-cadherin)升高[34]。遷移CTC簇保留了細胞間連接和間質特征，顯示出更高的轉移潛能[22,35]。血小板不僅可以黏附圍繞CTCs形成細胞纖維蛋白-血小板聚集體，以對抗剪切應力、氧化應激和免疫反應，保護CTCs；而且活化的血小板可以通過分泌生長因子和細胞因子(如TNF-α和β)促進EMT的發(fā)生，增加CTCs的侵襲性、活動性和轉移潛力[17,36]。脆弱細菌、糞腸球菌、大腸桿菌和核纖梭菌等微生物產生的代謝物和細胞因子也可以促進CTCs的增殖、遷移及EMT的發(fā)生，其產生的毒素也能夠從上皮細胞中清除E-cadherin，引發(fā)EMT，促進CTCs進入靜息或休眠狀態(tài)，逃避攻擊，得以存活[37-38]。然而，EMT對于轉移灶的建立并不是必需的，是否激活或部分激活EMT程序取決于細胞所處的環(huán)境[31]，因而使得部分CTCs在保留上皮致高度的可塑性和異質性。大多數(shù)CTC簇中含有瘤細胞[6,33]。2CTCs的分離純化和分子分析血液中CTCs的數(shù)量稀少，如何從大量的血細胞中高效分離純化CTCs是其生物學研究和臨床應用的關鍵前提。盡管CTCs早在1869年已經被發(fā)現(xiàn)報道，但是直到二十世紀五六十年代，過濾、沉淀分離純化CTCs的方法才出現(xiàn)[39-40]，珠方法，到1998年才問世[41-42]。從血液樣本中分離純化CTCs的方法有多種(圖3)：按照分離原理可分為基于物理特征(如大小和形狀、密度、可變形性、細胞表面電荷等)和基于生物特征(表面蛋白標記、胞內蛋白標記、細胞遷移能力等)的方法；按照分離策略可分為對CTCs的正向選擇量又可以分為單細胞分離或多細胞富集[7,28,43]。不同的分離純化方法的效果以及分離后CTCs存活和可培養(yǎng)狀態(tài)不同，后期能夠開展的研究和應用項目也會不同，給CTCs分離純化方法、方大增加了高效分離純化具有種群代表性的CTCs的難度。分離純化技術必須設計合理且足夠靈敏，才能夠有效獲取包括CTC簇在內的稀有異將CTC按照尺寸和形狀、可變形性、密度和細胞表面電荷等物理特征進行分離是較為簡便快捷的分離方法。在裂紅處理后，血液樣本大小約20~30μm，比白細胞(8~12μm)及其他有核血液細胞都大，形態(tài)也截然不同。因此通過選擇不同大小和形狀的孔，可以將二者分離，不過這種簡捷的過濾技術常伴隨部分較大白細胞的殘留[4,44]。ISET循環(huán)腫瘤細胞捕獲儀(Rarecells)是基于第44卷第5期■專題綜述腫瘤細胞大小的分離方法。非小細胞肺癌、前列腺癌的研究表明該方法的處理細胞量較大，可以得到較為準確的CTCs計數(shù)[45-46]。初步分離純化的CTCs可以用抗全細胞角蛋白(PanCK)、EpCAM、CD45/CD66b/CD34/CD11b/CD14、波形蛋白(Vim)和CD45等的商業(yè)免疫熒光試劑盒進一步鑒定分析[47]。血液樣本也可以與ScreenCellFC稀釋緩沖液混合裂紅，并固定白細胞和CTCs，通過ScreenCell微孔膜過濾器過濾截留收集CTCs；然后可將濾膜置于載玻片上，進行蘇木精-曙紅(H＆E)染色觀察。具有惡性特征的CTCs通常≥20μm，細胞核致密，核/胞質比≥0.75[5,48]。以CTChip?FR生物芯片為核心技術的ClearCell?FX平臺是世界上最早的自動化細胞檢索系統(tǒng)之一。它不依賴于細胞表面標記，而是基于迪恩流動分餾(Dean?owfractionation,DFF)渦旋原理，利用CTCs與正常血細胞受力的差異將CTCs溫和而快速地分離出來，因此，能夠在相對較短的時間內從血液中富集完整有活力的CTCs[49-50]。與微濾裝置不同，柔性微型彈簧陣列(?exiblemicrospringarray細胞大小和變形性，利用固定在兩個聚二甲基硅氧烷(PDMS)的密封O形圈之間的柔性微型彈簧陣列進行CTCs的選擇性富集。該方法利用壓樣品預處理，利用微陣列直接從全血中快速富集CTCs后用杜氏磷酸緩沖鹽溶液反向洗脫收集CTCs[4,44]。Parsortix系統(tǒng)利用CTCs的變形特置間形成的一定尺寸的間隙對CTCs進行攔截后逆流回收捕獲，可以兼容自動染色功能進行細能夠存活并應用于下游研究和分析[51]。流體芯片則利用并行流體通道網絡，形成56320個捕獲室，較小的血細胞(如紅細胞)和大多數(shù)白細胞會逸出，而較大的CTCs則被捕獲留存在腔室內[52]。改性埃洛石納米管(HNT)也可以用于分離純化CTCs：有黏附蛋白時，帶負電荷的十二烷酸鈉官能化可以增強HNT對CTCs的吸附和捕獲，降低白細胞的黏附；沒有黏附蛋白時，癸基三甲基溴化銨官能化導致HNT帶電降低，減少CTCs的黏附，增強白細胞的黏附達到正向選擇和負向耗竭的雙重效果[53]。OncoBio-One)的原理是密度梯度離心，被成功應用于乳腺癌CTCs的分離純化[25,54]。最常用的基于CTCs生物學特征的分離方法是免疫親和技術，大多使用特定表面標記物，如上皮細胞標志物和細胞骨架蛋白標志物(細胞角蛋白CKs和EpCAM)的免疫親和作用將CTCs與其他細胞區(qū)分開[55]。不過由于CTC簇混合了上皮-間質特征，這種基于上皮標記物的方法潛在地會低估CTC簇的數(shù)量，不能有效檢測出間質樣細胞[56]?；诿庖哂H和原理的CellSearchSystem是目前最為常用的CTCs臨床檢測系統(tǒng)，由CellPrep功能單元、CellSearch試劑盒和CellSpotter分析儀組成。作為較成熟的系統(tǒng)，其優(yōu)點是穩(wěn)定、可重復，缺點是靈敏度受到統(tǒng)計因素和血量等限制，且只能檢測上皮樣CTCs[4,57]。AdnaTestBreastCancerSelect系統(tǒng)和改進版AdnaTestCTCAR-V7mRNA則被用于乳腺癌和去勢抵抗性前列腺癌CTCs的檢測分析，利用磁珠偶聯(lián)的腫瘤特異性抗體和EpCAM抗體的免疫親和作用捕捉外周血中的CTCs，然后通過磁性顆粒濃縮器(MPC)進行富集[58-59]。此外還有IsoFlux系統(tǒng)、HB-Chip、EasySep、磁免疫脂質體(MIL)等技術體系，均是基于免疫親和原理，利用EpCAM、CD45和腫瘤細胞、白細胞、造血干細胞、血小板的特異性標志物抗體單獨或聯(lián)合與免疫磁珠偶聯(lián)，提高富集程度和敏感性[18,60-61]。霉親和素與相關細胞表面抗原抗體進行CTCs的插入靜脈，經過30min即可對EpCAM和/或細胞導線與EpCAM等抗體共價偶聯(lián)，直接從癌癥患者的手臂靜脈內分離CTCs[64-65]。Vita-Assay培養(yǎng)板則是基于侵入性CTCs與組織或腫瘤微環(huán)境模擬物(細胞黏附基質或CAM)的高強度黏附力來識別捕捉CTCs的，能將血液中的CTCs富集到100萬倍[66]?？傮w而言，分離純化是CTCs領域研究的重點和關鍵，其技術方法一直在快速進展和優(yōu)化迭代中。比如基于病毒轉染報告基因的CTCs分離純化方法：通過病毒轉染端粒酶特異、復制選擇性的GFP報告基因腺病毒比如TelomeScan(OBP-401;rAd-GFP)或者TelomeScanF35(OPB-1101;rAdF35-142T-GFP)在CTCs細胞中特異性地產生可以用來識別的GFP信號[67-68]。綜合應用物理和生物學特性的分離方法，發(fā)揮二者優(yōu)勢，規(guī)避各自的劣勢。比如：將Ficoll-PaquePLUS密度梯度分離技術與流式細胞檢測結合，用Ficoll-PaquePLUS密度梯度純化富集肝癌病人全血樣品中的CTCs細胞，然后利用肝特異性標志物抗體三聯(lián)免疫熒光染色后進行流式細胞分析和分選[69]；或者是將過濾分離純化與RNA原位雜交(RNA-ISH)分析方法結合，比如CanPatrol技術[70]；還有將微孔硅芯片、熒光成像和穿孔技術等結合，比如PunchVyCACTCs分離成功率可以達到80%~90%[71]。CTCs分離純化后，可以用H&E染色、免疫熒光染色、ELISA、PAGE、流式細胞分析等技術對CTCs進行計數(shù)、鑒定和分析，也可以使用免疫染色結合熒光原位雜交(FISH)、實時定量PCR(RT-qPCR)和各種組學等檢測基因組畸變，評估基因的轉錄水平和蛋白表達水平等。不過，回收CTCs和所含核酸的數(shù)量、質量受到體內外和分離純化過程的影響，給常規(guī)分析帶來一定的挑戰(zhàn)，而采用全基因組測序(WGS)或全外顯子測序(WES)對CTCs群體進行分析，可以解決諸如細胞丟失或遺傳物質受損等問題，獲得高質量的測序文庫[72]。CTCs基因組的擴增有三種常用的方法：簡并寡核苷酸引發(fā)的聚合酶鏈反應(DOP-PCR)、多重置換擴增(MDA)和多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(MALBAC)。DOP-PCR可以用于擴增單個細胞來源的DNA，但基因組覆蓋率低(約10％)，可以用于拷貝數(shù)的評估，但不足以實現(xiàn)良好的單核苷酸變異檢測(SNV)。與DOR-PCR剛好相反，MDA技術可以有效檢測突變，但是基因組覆蓋范圍不均衡，不適合拷貝數(shù)分析。MALBAC方法可以獲得較高且均勻的基因組覆蓋率(93％)，對于拷貝數(shù)變異檢測很有用，但假陽性率高，不適合檢測點突變[73-75]。CTC轉錄組的分析方法學進展也很快，包括能夠擴增全長轉錄本或3端區(qū)域的Smart-seq2、CEL-seq、STRT序列等方法[76-77]。隨著微流控和單將會越來越簡捷、可靠和強大。3CTCs與腫瘤精準、個體化醫(yī)學究方面具有巨大的潛力[78-79]。腫瘤“液體活檢”進展信息，包括早期腫瘤診斷、風險評估和分期、療效、預后、復發(fā)檢測和監(jiān)控等[80]。主要檢測對象包括細胞形式的CTCs(簇)、非細胞形式循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、microRNA和RNA以及cfDNA、CTCs和胞外囊泡等代表著腫瘤液體活檢的最前沿和重要進展，在腫瘤診斷、預后等cfDNA和胞外囊泡比CTCs的分離更加簡捷，但cfDNA和胞外囊泡等適用的分析比較有限，比如cfDNA主要用于基因組突變的分析[83]，CTCs第44卷第5期■專題綜述則可以開展諸多其他分析，包括細胞形態(tài)、免疫表型和重要表位分析，腫瘤細胞克隆異質性與進化分析，表觀遺傳組、轉錄組、蛋白質組和代謝組分析[16,84]。此外，目前臨床上常用的穿刺取樣給患者帶來巨大的疼痛和不便，并且可能無法獲得所需的腫瘤細胞，取樣過程的侵入性還有增加癌轉移的潛在風險。相比而言，基于CTCs的液體活檢在臨床檢測中具有很大的優(yōu)細、動態(tài)和個性化的信息，從而支持、指導精準、個體化醫(yī)療決策和實踐[65,85]。CTCs的不同特性與癌癥類型、分期和治療應答緊密關聯(lián)，如CTCs的物理屬性、計數(shù)、微CTCs計數(shù)和濃度變化則與腫瘤負荷有關，具有部分EMT表型的CTCs與腫瘤的進展、預后及早期復發(fā)相關[86-87]。因此CTCs在腫瘤精準、個體理策略，以及直接靶向CTCs作為消除轉移亞群重要指導價值[88-89]。事實上，隨著技術的進展，CTCs分析日益成為評估腫瘤轉移和復發(fā)的首選方法，每7.5mL血液含有5個以上CTCs成為判定腫瘤轉移和復發(fā)的領域共識[90]。不僅如此，具有高轉移潛能的CTC(簇)通常具有總體基因組DNA低甲基化和局部位點的超甲基化的特點，因此通過分析CTCs的CpG島的甲基化模式可以幫助確定腫瘤的來源[21,83,91]。同時，類似于DNA甲基化這提供了新的路徑和可能[92]。CTCs分析的價值在的推廣應用[93-94]。腫瘤類器官等培養(yǎng)技術的結合更加拓展了CTCs的臨床應用路徑和價值。已知的CTCs臨床前模型有單層細胞培養(yǎng)、三維細胞球培養(yǎng)、三維腫瘤類器官和CTCs衍生的外植體(CDX/PDX)模型等[95-96]。來源于CTCs的培養(yǎng)物可用于藥物篩物庫的建立等(圖4)。通過培養(yǎng)和后續(xù)分析，可以對具有轉移能力的CTCs進行功能解析，深入物敏感性篩選[97]。4結語自澳大利亞病理學家托馬斯·阿什沃思于1869年首次發(fā)現(xiàn)報道CTCs，歷經百余年，特別是近20年來，隨著CTCs分離純化技術的快速進展，CTCs生物學研究取得巨大進步，CTCs的生突破促進了基于CTCs的腫瘤液體活檢技術的快醫(yī)學對疾病診療動態(tài)監(jiān)控監(jiān)測的迫切、巨大需求；而CTCs與新興二代、三代組學、多組學及類器官等技術的結合將廣泛拓展CTCs在腫瘤精[1]CASTRO-GINERF,ACETON.Trackingcancerprogression:fromcirculatingtumorcellstometastasis[J].GenomeMed,2020,12(1):31.[2]OLMEDAD,CEREZO-WALLISD,RIVEIRO-FALKENBACHE,etal.Whole-bodyimagingoflymphovascularnichesidenti?espre-metastaticrolesofmidkine[J].Nature,2017,546(7660):676-680.[3]ZHONGX,ZHANGH,ZHUY,etal.Circulatingtumorcellsincancerpatients:developmentsandclinicalapplicationsforimmunotherapy[J].MolCancer,2020,19(1):15.[4]FABISIEWICZA,GRZYBOWSKAE.CTCclustersincancerprogressionandmetastasis[J].MedOncol,2017,34(1):12.[5]MASCALCHIM,MADDAUC,SALIL,etal.Circulatingtumorcellsandmicroembolicandifferentiatemalignantandbenignpulmonarylesions[J].JCancer,2017,8(12):2223-2230.[6]TAYOUNT,FAUGEROUXV,OULHENM,etal.CTC-derivedmodels:awindowintotheseedingcapacityofcirculatingtumorcells(CTCs)[J].Cells,2019,8(10):1145.[7]GARCIASA,WEITZJ,SCHOLCHS.Circulatingtumorcells[J].MethodsMolBiol,2018,1692:213-219.[8]GOMISRR,GAWRZAKS.Tumorcelldormancy[J].MolOncol,2017,11(1):62-78.[9]VERA-RAMIREZL,HUNTERKW.Tumorcelldormancyasanadaptivecellstressresponsemechanism[J].F1000Res,2017,6:2134.[10]KANGY,PANTELK.Tumorcelldissemination:emergingbiologicalinsightsfromanimalmodelsandcancerpatients[J].CancerCell,2013,23(5):573-581.[11]ZHANGZ,SHIRATSUCHIH,LINJ,etal.ExpansionofCTCsfromearlystagelungcancerpatientsusingamicro?uidicco-culturemodel[J].Oncotarget,2014,5(23):12383-12397.[12]OKABET,TOGOS,FUJIMOTOY,etal.Mesenchymalcharacteristicsandpredictivebiomarkersoncirculatingtumorcellsfortherapeuticstrategy[J].Cancers,2020,12(12):3588.[13]ZEIDMANI,BUSSJM.Transpulmonarypassageoftumorcellemboli[J].CancerRes,1952,12(10):731-733.[14]GRETENFR,GRIVENNIKOVSI.Inflammationandcancer:triggers,mechanisms,andconsequences[J].Immunity,2019,51(1):27-41.[15]LUC,RONGD,ZHANGB,etal.Currentperspectivesontheimmunosuppressivetumormicroenvironmentinhepatocellularcarcinoma:challengesandopportunities[J].MolCancer,2019,18(1):130.[16]HWANGWL,HWANGKL,MIYAMOTODT.Thepromiseofcirculatingtumorcellsforprecisioncancertherapy[J].BiomarkMed,2016,10(12):1269-1285.[17]GARRIDO-NAVASC,DEMIGUEL-PEREZD,EXPOSITO-HERNANDEZJ,etal.Cooperativeandescapingmechanismsbetweencirculatingtumorcellsandbloodconstituents[J].Cells,2019,8(11):1382.[18]AlVAA,FRIEDLANDERT,CLARKM,etal.Circulatingtumorcellsaspotentialbiomarkersinbladdercancer[J].JUrol,2015,194(3):790-798.[19]HONGY,FANGF,ZHANGQ.Circulatingtumorcellclusters:Whatweknowandwhatweexpect(review)[J].IntJOncol,2016,49(6):2206-2216.[20]LINZ,LUOG,DUW,etal.Recentadvancesinmicrofluidicplatformsappliedincancermetastasis:circulatingtumorcells'(CTCs)isolationandtumor-on-a-chip[J].Small,2020,16(9):e1903899.[21]GKOUNTELAS,CASTRO-GINERF,SZCZERBABM,etal.Circulatingtumorcellclusteringshapesdnamethylationtoenablemetastasisseeding[J].Cell,2019,176(1/2):98-112e14.[22]CHEUN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