缺氧環(huán)境下shRNA下調(diào)MTDH基因?qū)θ巳橄侔㎝CF

缺氧環(huán)境下shRNA下調(diào)MTDH基因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞增殖及凋亡的影響徐龍;蘇冰;杜成;韓濤;劉兆喆;謝曉冬【摘要】目的探討缺氧環(huán)境下MTDH表達(dá)下調(diào)對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖及凋亡的影響?方法①利用二氯化鉆模擬缺氧環(huán)境，采用RT-PCR及Westernblot法檢測(cè)HIF-1a及MTDH基因在缺氧環(huán)境下表達(dá)水平的改變;②缺氧環(huán)境下將加入MTDH-shRNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞(缺氧MTDH-shRNA組)、control-shRNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞(缺氧Control-shRNA組)及僅予單純二氯化鉆缺氧處理的MCF-7細(xì)胞(單純?nèi)毖踅M)分別轉(zhuǎn)染,24h后觀察轉(zhuǎn)染率，再應(yīng)用RT-PCR及Westernblot法檢測(cè)MTDH基因在mRNA和蛋白水平上的變化;③MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)MTDH基因表達(dá)對(duì)單純?nèi)毖踅M、缺氧Control-shRNA組和缺氧MTDH-shRNA組MCF-7細(xì)胞增殖的影響,并采用Hoechst33258染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞的凋亡情況;④采用RT-PCR及Westernblot法觀察下調(diào)MTDH基因?qū)渭內(nèi)毖踅M、缺氧Control-shRNA組和缺氧MTDH-shRNA組HIF-1a表達(dá)的影響?結(jié)果①缺氧環(huán)境下MCF-7細(xì)胞HIF-1a基因表達(dá)無(wú)變化,HIF-1a蛋白表達(dá)在一定范圍內(nèi)隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而升高(Pv0.05),MTDH基因及蛋白表達(dá)隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)均逐漸升高(P<0.05);②MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染率約60%,與單純?nèi)毖踅M和缺氧Control-shRNA組相比，缺氧MTDH-shRNA組MTDH基因及蛋白表達(dá)均減低(P<0.05);③下調(diào)MTDH基因表達(dá)后,與單純?nèi)毖踅M及缺氧Control-shRNA組比較，缺氧MTDH-shRNA組MCF-7細(xì)胞增殖抑制率減弱(P<0.05),凋亡細(xì)胞數(shù)量增加(P<0.05);④下調(diào)MTDH基因表達(dá)后,與單純?nèi)毖踅M及缺氧Control-shRNA組比較，缺氧MTDH-shRNA組HIF-1a蛋白表達(dá)減低(P<0.05).結(jié)論缺氧環(huán)境下，下調(diào)MTDH基因可調(diào)控MCF-7細(xì)胞HIF-1a蛋白表達(dá)，同時(shí)降低MCF-7細(xì)胞增殖能力,并促進(jìn)其凋亡.期刊名稱(chēng)】《臨床誤診誤治》年(卷),期】2016(029)001【總頁(yè)數(shù)】7頁(yè)(P107-113)【關(guān)鍵詞】轉(zhuǎn)移黏附基因;乳腺腫瘤;缺氧誘導(dǎo)因子1,a亞基;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡【作者】徐龍;蘇冰;杜成;韓濤;劉兆喆;謝曉冬【作者單位】110840沈陽(yáng),沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院全軍腫瘤診治中心腫瘤科;110840沈陽(yáng),沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院全軍腫瘤診治中心腫瘤科;110840沈陽(yáng),沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院全軍腫瘤診治中心腫瘤科;110840沈陽(yáng),沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院全軍腫瘤診治中心腫瘤科;110840沈陽(yáng),沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院全軍腫瘤診治中心腫瘤科;110840沈陽(yáng),沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院全軍腫瘤診治中心腫瘤科【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類(lèi)】R737.9?基礎(chǔ)研究?作者單位：110840沈陽(yáng)，沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院全軍腫瘤診治中心腫瘤科［DOI］10.3969/j.issn.1002-3429.2016.01.038腫瘤的發(fā)展過(guò)程涉及許多復(fù)雜的遺傳學(xué)變化，越來(lái)越多的證據(jù)顯示相當(dāng)一部分基因組不穩(wěn)定性是由腫瘤周?chē)h(huán)境引起的［1］。缺氧是惡性腫瘤微環(huán)境的一個(gè)重要特征，主要是因?qū)嶓w瘤快速增長(zhǎng)和脈管系統(tǒng)極度紊亂引起血液灌注不足所致［2］。缺氧環(huán)境下，部分腫瘤細(xì)胞因得不到充足養(yǎng)分而死亡，但也有部分腫瘤細(xì)胞基因組發(fā)生改變而呈現(xiàn)出更強(qiáng)的生存和侵襲能力［3］，這種腫瘤惡性生物學(xué)行為的變化主要是由缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxiainduciblefactor,HIF)調(diào)控，其中HIF-1a起主要作用。近年大量研究證明，高表達(dá)的轉(zhuǎn)移黏附基因MTDH在乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，尤其是在缺氧環(huán)境下MTDH基因與HIF-1a的相互關(guān)系引起許多學(xué)者的注意［4-5］。本研究應(yīng)用二氯化鈷化學(xué)模擬腫瘤缺氧微環(huán)境，以具有代表性的雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為研究對(duì)象，檢測(cè)缺氧對(duì)MTDH基因表達(dá)的影響，并通過(guò)shRNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)下調(diào)MTDH基因的表達(dá)，觀察在缺氧環(huán)境下MTDH基因?qū)CF-7細(xì)胞增殖及凋亡的影響以及HIF-1a表達(dá)水平的變化，以期初步了解缺氧環(huán)境下MTDH基因表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。1.1細(xì)胞及主要試劑MCF-7細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，F(xiàn)uGENEHD轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)羅氏公司，熒光標(biāo)記的MTDH-shRNA和control-shRNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒由上海吉瑪公司合成，細(xì)胞培養(yǎng)用二氯化鉆購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，總RNA提取試劑和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購(gòu)于北京TransGen有限公司，兔抗人anti-MTDH、anti-HIF-1a及p-actin購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，人抗兔IgG-HRP二抗購(gòu)于美國(guó)Cellsignal公司，MTT及AnnexinV/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京碧云天公司。實(shí)驗(yàn)方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中。取細(xì)胞培養(yǎng)液接種至6孔板中，每孔4x105個(gè),24h后待細(xì)胞貼壁融合達(dá)80%左右開(kāi)始轉(zhuǎn)染。將質(zhì)粒及FuGENEHD轉(zhuǎn)染試劑按照1:3配比，于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中孵育10min，每孔加入含0.1pg質(zhì)粒及0.3pl轉(zhuǎn)染試劑的混懸液，參照轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明書(shū)操作。未在缺氧環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞作為常氧組。根據(jù)Wilson等［6］采用的方法，向處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)液中加入二氯化鉆溶液模擬缺氧環(huán)境，使其終濃度為50pmol/L,后置于37工、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。根據(jù)缺氧時(shí)間設(shè)為缺氧24h組和缺氧48h組。RT-PCR法：用Trizol提取MCF-7細(xì)胞總RNA(按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作)，運(yùn)用TransGenRT-PCR試劑盒使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物如下：MTDH:5'-TGCCTCCTTCACAGACCAA-3'和5'-TCGGCTGCAGATGAGATAG-3‘,HIF-1a:5'-TCCAGCAGACTCAAATACAAGAAC-3‘和5‘-GTATGTGGGTAGGAGATGGAGATG3,p-actin:F:5‘-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'和R:5,-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3,oPCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min,94°C變性30s，退火30s(MTDH58°C,HIF-1a56°C,p-actin54°C),72°C延伸30s，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，再于72C終末延伸5min。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物100mV電泳30min，電泳結(jié)束后取出凝膠于紫外凝膠成像儀中顯像，UVP系統(tǒng)拍照采集數(shù)據(jù)。利用ImageJ軟件分析各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Westernblot法：收集細(xì)胞后加入PMSF細(xì)胞裂解液，200W超聲粉碎細(xì)胞，離心并提取總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，以100g/LSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后分別加入相對(duì)應(yīng)一抗，兔抗人MTDH(1:1000)、內(nèi)參p-actin(1:200)、HIF-1a(1：200),4C雜交過(guò)夜，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG(1:500),37C孵育2h,TBST洗3次,10min/次，化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色。用掃描儀進(jìn)行灰度掃描，利用ImageJ軟件分析各蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量。MTT實(shí)驗(yàn)：調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)液濃度至1.5x104/ml,于96孑L板中每孔中加入100pl細(xì)胞懸液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置1個(gè)只加培養(yǎng)基的對(duì)照孔；細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，24h后觀察細(xì)胞貼壁達(dá)80%以上，分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，取“121”項(xiàng)下培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染孵育，轉(zhuǎn)染12h后加入二氯化鉆溶液，每48h換液1次。轉(zhuǎn)染完成后4、24、48、72h各取出一塊96孔板，每孔加MTT溶液20pl。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h,離心5min，棄上清，每孔中加入二甲基亞砜150pl,震蕩溶解10min。將酶聯(lián)免疫儀調(diào)定在570nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度值并計(jì)算5個(gè)復(fù)孔平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。Hoechst33258染色：蓋玻片消毒后置于六孔板內(nèi)，3x105/m2密度接種細(xì)胞，每孔總體積3ml,細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，24h后觀察細(xì)胞貼壁達(dá)80%以上開(kāi)始轉(zhuǎn)染。12h后加入二氯化鉆溶液培養(yǎng)48h后吸盡培養(yǎng)液，加0.5ml固定液固定10min以上，去固定液，用PBS置搖床清洗兩次，每次3min，吸盡液體加入0.5mlHoechst33258染色液進(jìn)行染色。1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后消化收集細(xì)胞懸液，加入195plAnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，室溫避光孵育10min,1000r/min離心5min;再次加入190plAnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入10pl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，隨即行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1.3觀察指標(biāo)及方法①觀察二氯化鉆模擬缺氧環(huán)境下常氧組、缺氧24h組和缺氧48h組MCF-7細(xì)胞形態(tài)變化；②缺氧環(huán)境下將加入熒光標(biāo)記的MTDH-shRNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞（缺氧MTDH-shRNA組）、control-shRNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞（缺氧Control-shRNA組）及單純二氯化鉆缺氧處理的MCF-7細(xì)胞（單純?nèi)毖踅M）分別轉(zhuǎn)染，24h后觀察轉(zhuǎn)染率，應(yīng)用RT-PCR及Westernblot法檢測(cè)MTDH基因和蛋白表達(dá)；③MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)MTDH基因表達(dá)對(duì)缺氧MTDH-shRNA組、缺氧Control-shRNA組及單純?nèi)毖踅MMCF-7細(xì)胞增殖的影響，并采用Hoechst33258染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞的凋亡情況；④采用RT-PCR及Westernblot法觀察下調(diào)MTDH基因?qū)?組HIF-1a表達(dá)的影響。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差士s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。2.1缺氧對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響常氧環(huán)境下，MCF-7細(xì)胞呈多邊形，邊緣清晰，有突起，大小較均一，細(xì)胞間連接緊密，密度大。缺氧環(huán)境下，部分細(xì)胞皺縮，呈類(lèi)圓形，突起減少，大小不一，細(xì)胞密度減低，隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)上述改變更加明顯，見(jiàn)圖1。2.2缺氧環(huán)境對(duì)MCF-7細(xì)胞HIF-1a及MTDH基因/蛋白表達(dá)的影響應(yīng)用RT-PCR及Westernblot法分別從mRNA及蛋白水平檢測(cè)HIF-1a及MTDH基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，與常氧組相比，二氯化鉆作用24及48h后，HIF-1a基因表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05),HIF-1a蛋白表達(dá)逐漸升高(Pv0.05)，表明MCF-7細(xì)胞在二氯化鈷化學(xué)模擬缺氧環(huán)境下可表現(xiàn)出主要分子改變。與常氧組相比，二氯化鈷作用24及48h后，MTDH基因及蛋白表達(dá)均逐漸升高(Pv0.05)，提示MTDH基因高表達(dá)可能對(duì)MCF-7細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境有重要意義。見(jiàn)圖2。2.3MTDH-shRNA下調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞MTDH基因/蛋白的表達(dá)3組轉(zhuǎn)染率均約為60%(圖3A);與單純?nèi)毖踅M和缺氧Control-shRNA組相比，缺氧MTDH-shRNA組與單純?nèi)毖踅MMTDH基因及蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)，而缺氧Control-shRNA組與單純?nèi)毖踅MMTDH基因及蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變(P>0.05),見(jiàn)圖3B、3C。2.4下調(diào)MTDH基因可抑制缺氧環(huán)境下乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染24.48和72h后，缺氧MTDH-shRNA組與單純?nèi)毖踅M及缺氧Control-shRNA組MCF-7細(xì)胞增殖抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PvO.05)，而單純?nèi)毖踅M與缺氧Control-shRNA組MCF-7細(xì)胞增殖抑制率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。下調(diào)MTDH基因可促進(jìn)缺氧環(huán)境下MCF-7細(xì)胞凋亡Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)顯示，未凋亡細(xì)胞細(xì)胞核形狀為規(guī)則類(lèi)圓形，呈均勻藍(lán)色熒光，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白。缺氧MTDH-shRNA組細(xì)胞密度較單純?nèi)毖踅M及缺氧Control-shRNA組減低，凋亡細(xì)胞所占比例增高(圖5A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，缺氧MTDH-shRNA組總凋亡率及早期凋亡率均較單純?nèi)毖踅M及缺氧Control-shRNA組增高(Pv0.05)，而缺氧Control-shRNA組與單純?nèi)毖踅M比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)圖5B。2.6下調(diào)MTDH基因可抑制缺氧環(huán)境下乳腺癌MCF-7細(xì)胞HIF-1a蛋白表達(dá)RT-PCR及Western-blot結(jié)果顯示，與單純?nèi)毖踅M及缺氧Control-shRNA組比較，缺氧MTDH-shRNA組HIF-1a基因表達(dá)無(wú)變化(P>0.05)，蛋白表達(dá)減低(Pv0.05)，而單純?nèi)毖踅M與缺氧Control-shRNA組基因及蛋白表達(dá)均無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖6。目前，乳腺癌的診斷與治療已進(jìn)入分子領(lǐng)域，乳腺癌的分子分型對(duì)于判斷預(yù)后和指導(dǎo)治療有重要作用，而內(nèi)分泌治療以及分子靶向治療的應(yīng)用也使乳腺癌的治療更有針對(duì)性［7］。但按目前的治療標(biāo)準(zhǔn)，即使是分子分型相同的患者仍可能在預(yù)后和療效方面存有較大差異，所以不斷深入研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)于提高乳腺癌臨床診療效果有巨大的現(xiàn)實(shí)意義。體外研究表明，缺氧可引起腫瘤細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)或功能的改變，進(jìn)而改變其生物學(xué)行為［8］。缺氧可對(duì)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生重要影響?？寡苌伤幬锸且活?lèi)針對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體的分子靶向治療藥物，是目前包括乳腺癌在內(nèi)實(shí)體瘤治療中最重要的藥物之一?？寡苌伤幬锿ㄟ^(guò)抑制腫瘤新生血管生成，造成部分腫瘤組織缺少氧供和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而起抗腫瘤作用。但隨著更多深入的研究，這種治療方式也引起了較多的爭(zhēng)議［9］。如代表性藥物貝伐單抗只可延長(zhǎng)晚期乳腺癌患者無(wú)進(jìn)展生存期，卻并未延長(zhǎng)其總生存期［10-14］。有觀點(diǎn)認(rèn)為這主要與腫瘤耐藥有關(guān)，因殘存腫瘤細(xì)胞基因組發(fā)生改變適應(yīng)了缺氧環(huán)境所致［15］。有研究發(fā)現(xiàn)，抗血管生成藥物作用于腫瘤細(xì)胞后，其侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，并且腫瘤干細(xì)胞數(shù)量增多［16］。所以，了解缺氧環(huán)境下乳腺癌細(xì)胞的改變對(duì)改進(jìn)乳腺癌的治療方法有積極的作用。MTDH是近年來(lái)腫瘤基因研究的焦點(diǎn)，MTDH在人正常乳腺組織、乳腺增生組織中不表達(dá)或呈低表達(dá)，然而在乳腺癌組織中高表達(dá)［17］。已有大量研究證實(shí)，MTDH過(guò)表達(dá)患者的無(wú)疾病生存期、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期以及總生存期顯著降低，提示MTDH過(guò)表達(dá)是乳腺癌不良預(yù)后因子之一［18］。近年來(lái)在腦膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，MTDH與HIF-1a可能有相互調(diào)節(jié)的關(guān)系，提示MTDH可能對(duì)腫瘤耐受缺氧環(huán)境有一定作用［4-5］。如果能夠證實(shí)MTDH基因在乳腺癌細(xì)胞缺氧后有促進(jìn)其惡性生物學(xué)行為的作用，那么MTDH基因/蛋白就有可能成為新的乳腺癌診斷和治療靶點(diǎn)，有可能改變?nèi)橄侔┛寡苌芍委熀笏庥龅睦Ь?。因此，本研究致力于初步了解缺氧環(huán)境下MTDH基因所發(fā)揮的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺氧環(huán)境下部分乳腺癌細(xì)胞死亡，部分仍然存活，在一定范圍內(nèi)，存活的乳腺癌細(xì)胞MTDH基因表達(dá)水平隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，提示缺氧環(huán)境可能引起了MTDH基因表達(dá)的變化。當(dāng)下調(diào)MTDH基因表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞的增殖能力減弱，凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，表明MTDH基因在缺氧環(huán)境下對(duì)于維持乳腺癌細(xì)胞的生存有一定意義。當(dāng)MTDH基因表達(dá)下調(diào)后，HIF-1a蛋白表達(dá)降低，但基因表達(dá)未見(jiàn)明顯改變，提示MTDH基因可能在翻譯水平上對(duì)HIF-1a表達(dá)有影響，而對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯影響，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。Emdad等［4］發(fā)現(xiàn)在MTDH過(guò)表達(dá)的鼠胚胎細(xì)胞中HIF-1a蛋白表達(dá)增加，Noch等［5］在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)下調(diào)HIF-1a表達(dá)可以降低MTDH的表達(dá)水平，與本研究結(jié)果相似。本研究初步探討了缺氧環(huán)境下MTDH基因與乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系，以及MTDH基因?qū)IF-1a表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究缺氧環(huán)境下乳腺癌細(xì)胞的分子改變起到了一定的揭示作用，也對(duì)更好地理解臨床乳腺癌抗血管生成治療后的具體現(xiàn)象提供了一定的幫助。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于將腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞的分子改變生物學(xué)行為改變聯(lián)系起來(lái)，注重微環(huán)境對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及分子表達(dá)的影響，通過(guò)模擬腫瘤微環(huán)境使體外研究更接近于體內(nèi)的實(shí)際情況。但由于本研究條件的限制，不能應(yīng)用缺氧培養(yǎng)箱作為模擬缺氧的工具，僅使用了化學(xué)模擬的方法，可能會(huì)因?yàn)榛瘜W(xué)物品對(duì)于細(xì)胞的多種影響導(dǎo)致研究結(jié)果有一定偏差；還因客觀條件限制，對(duì)于RNA檢測(cè)僅應(yīng)用了半定量的RT-PCR法，結(jié)論準(zhǔn)確性受到一定影響，如能進(jìn)一步應(yīng)用定量更加準(zhǔn)確的方法將得出更加可靠的結(jié)論，這將是本研究繼續(xù)努力的方向?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】HuangLE,BindraRS,GlazerPM，etal.Hypoxia-inducedgeneticinstability-acalculatedmechanismunderlyingtumorprogressionJ].JMolMed(Berl),2007,85(2):139-148.WeiW,ShiQ，RemacleF,etal.Hypoxiainducesaphasetransitionwithinakinasesignalingnetworkincancercells[J].ProcNatlAcadSciUSA,2013,110(15):E1352-E1360.ChaturvediP,GilkesDM，WongCC,etal.Hypoxia-induciblefactor-dependentbreastcancer-mesenchymalstemcellbidirectionalsignalingpromotesmetastasis[J].JClinInvest,2013,123(1):189-205.EmdadL,LeeSG，SuZZ,etal.Astrocyteelevatedgene-1(AEG-1)functionsasanoncogeneandregulatesangiogenesis[J].ProcNatlAcadSciUSA,2009,106(50):21300-21305.NochE,BooklandM，KhaliliK.Astrocyte-elevatedgene-1(AEG-1)inductionbyhypoxiaandglucosedeprivationinglioblastoma[J].CancerBiolTher,2011,11(1):32-39.WilsonJL,BurchellJ，GrimshawMJ.EndothelinsinduceCCR7expressionbybreasttumorcellsviaendothelinreceptorAandhypoxia-induciblefactor-1[J].CancerRes,2006,66(24):11802-11807.KnoopAS,LankholmAV,JensenMB,etal.Estrogenreceptor,Progesteronereceptor,HER2statusandKi67indexandresponsivenesstoadjuvanttamoxifeninpostmenopausalhigh-riskbreastcancerpatientsenrolledintheDBCG77Ctrial[J].EurJCancer,2014,50(8):1412-1421.GuanY,ReddyKR,ZhuQ,etal.G-richoligonucleotidesinhibitHIF-1alphaandHIF-2alphaandblocktumorgrowth[J].MolTher,2010,18(1):188-197.HayesDF.Bevacizumabtreatmentforsolidtumors:boonorbust?[J].JAMA,2011,305(5):506-508.MillerKD,ChapLI,HolmesFA,etal.RandomizedphaseIIItrialofcapecitabinecomparedwithbevacizumabpluscapecitabineinpatientswithpreviouslytreatedmetastaticbreastcancer[J].JClinOncol,2005,23(4):792-799.MillerK,WangM,GralowJ,etal.Paclitaxelplusbevacizumabversuspaclitaxelaloneformetastaticbreastcancer[J].NEnglJMed,2007,357(26):2666-2676.MilesDW,ChanA,DirixLY,etal.Phase皿studyofbevacizumabplusdocetaxelcomparedwithplaceboplusdocetaxelforthefirst-linetreatmentofhumanepidermalgrowthfactorreceptor2-negativemetastaticbreastcancer[J].JClinOncol,2010,28(20):3239-3247.RobertNJ,DierasV,GlaspyJ,etal.RIBBON-1:randomized,double-blind,placebo-controlled,phase皿trialofchemotherapywithorwithoutbevacizumabforfirst-linetreatmentofhumanepidermalgrowthfactorreceptor