蛋白質(zhì)與酶工程5-6

第五章酶的固定化游離酶的缺點(diǎn)：

①穩(wěn)定性差(熱、酸堿、有機(jī)溶劑對(duì)其有影響)；

②不能回收反復(fù)使用；③產(chǎn)物中混雜酶蛋白，分離純化困難。酶的固定化(enzymeimmobilization)就是通過吸附、交聯(lián)、包埋、共價(jià)鍵結(jié)合等物理、化學(xué)手段將酶被束縛于水不溶的載體上或一定空間內(nèi)但仍具有酶活性。（上世紀(jì)60年代）

酶管、酶膜、酶板

第一節(jié)酶的固定化方法一、固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)1、優(yōu)點(diǎn)

①酶與底物、產(chǎn)物易分開，簡(jiǎn)化了提純工藝；②可反復(fù)使用，利于連續(xù)化、管道化；③反應(yīng)過程可控，利于自動(dòng)化；④提高了酶的穩(wěn)定性（絕大多數(shù)情況）；⑤酶的使用效率高、產(chǎn)率高、產(chǎn)品質(zhì)量高、成本低。2、缺點(diǎn)

①損失酶活力2）②不適應(yīng)非水溶性底物和大分子底物③不適于多酶反應(yīng)二、酶的固定化方法

吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法

1、吸附法吸附法分為物理吸附法和離子交換吸附法。

①物理吸附法通過氫鍵、疏水作用和、π電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上，從而制成固定化酶。常用的載體有：有機(jī)載體：纖維素(玻璃紙或膠棉膜)、淀粉等，吸附量大無機(jī)載體：氧化鉛、皂土、多孔玻璃等，吸附量小，易脫落②離子交換吸附法

將酶與含有離子交換基的水不溶載體相結(jié)合而達(dá)到固定化。陰離子交換劑：二乙基氨基乙基（DEAE）-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠

DEAE-SephadexA25固定氨基酰化酶：溶脹，然后用0.5mol/LNaOH和水洗滌，加酶混勻，于低溫下攪拌過夜，吸去上清液，再用蒸餾水和0.15mol／L醋酸鈉水溶液洗滌固定化酶，置4℃?zhèn)溆谩ｊ栯x子交換劑：羧甲基（CM）-纖維素

吸附法的優(yōu)點(diǎn)：a、操作簡(jiǎn)單；b、載體選擇范圍廣；c、吸附過程可以同時(shí)純化酶；d、固定化酶在使用過程失活后可重新活化；e、載體可以回收再利用。

吸附法的缺點(diǎn)：a、由于有些機(jī)理不十分明了，在給酶量、吸附程度與固定化酶活力回收的關(guān)系不可預(yù)見性大。b、由于吸附法制備的固定化酶酶易脫落，影響產(chǎn)物純度和酶的操作穩(wěn)定性。2、包理法

包埋法是將載體聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進(jìn)劑（包括交聯(lián)劑）的作用進(jìn)行單體聚合，酶被包埋在載體聚合物中以達(dá)到固定化。分為凝膠包理法和微囊包埋法

①凝膠包理法凝膠包埋法（基質(zhì)包埋法）是將酶分子包埋在凝膠網(wǎng)絡(luò)的格子中。

海藻酸鈣凝膠（海藻酸鈉）、聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠、卡拉膠②微囊包埋法微囊包埋法是將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內(nèi)。此法在醫(yī)療上極為有用

人造細(xì)胞、紅血球包埋法、脂質(zhì)體包埋法……

包埋法是目前應(yīng)用最多的一種較理想的方法。

優(yōu)點(diǎn)：①操作簡(jiǎn)單，條件溫和；②無反應(yīng)，不改變酶的空間結(jié)構(gòu)，固定化酶的活力高；③適用性廣。

缺點(diǎn)：①只適宜于小分子底物，對(duì)大分子底物不適宜；②凝膠網(wǎng)絡(luò)對(duì)物質(zhì)擴(kuò)散的阻力導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)行為的變化。

3、共價(jià)結(jié)合法（共價(jià)偶聯(lián)法）就是酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載體表面上的功能基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵而固定的方法。

優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，酶不易脫落。

缺點(diǎn)：但反應(yīng)條件較激烈，酶易失活，同時(shí)，制作手續(xù)亦較繁瑣。

①酶分子和載體連接的功能基團(tuán)

酶分子：-NH3、-COOH、苯環(huán)基、-OH、-SH、咪唑基、吲哚基載體：芳香氨基，羧基，羧甲基等

②載體的選擇載體直接關(guān)系到固定化酶的性質(zhì)和形成。對(duì)載體的一般要求是：a、一般親水載體都優(yōu)于疏水載體（結(jié)合量、活力、穩(wěn)定性）；b、載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機(jī)械強(qiáng)度；c、載體必須帶有在溫和條件與酶共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)；d、載體沒有或很少有非專一性吸附；e、載體來源容易，便宜，并能反復(fù)使用。

如:天然高分子衍生物:纖維素葡聚糖凝膠親和性好，機(jī)械性能差瓊脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯性能好，但有疏水結(jié)構(gòu)尼龍③偶聯(lián)反應(yīng)

有13類反應(yīng)，但必須考慮偶聯(lián)效率，固定化酶總活力，操作簡(jiǎn)便以及成本等因素。

常用的偶聯(lián)反應(yīng)：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、芳香烴化法等。a、重氮法是將帶芳香族氨基的載體，先用NaNO2和稀鹽酸酸處理成重氮鹽衍生物，再在偏堿(pH8-9)條件下與酶蛋白的氨基、酚基、咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到固定化酶。多糖類的芳香族氨基衍生物載體（對(duì)-β-硫酸脂乙砜基胺多糖）氨基酸共聚體如L-Leu和對(duì)氨基-DL-苯丙氨酸共聚物聚丙烯酰胺衍生物苯乙酰樹脂多孔玻璃的氨基硅烷衍生物Y-氨基丙基三氧乙烷硅第一步：第二步：對(duì)硝基苯酚氯

b、疊氮法將帶有羧基或羥基、羧甲基等的載體在酸性條件下用甲醇處理使之酯化，再用水合肼處理形成酰肼，最后在HNO3作用下轉(zhuǎn)變成疊氮衍生物。在低溫下可與酶蛋白的氨基、羥基、酚基、巰基等反應(yīng)羧甲基纖維素、CM—Sephadex

c、溴化氰法

含有羥基的載體（如纖維素、葡聚糖、瓊脂等）在堿性條件下，載體的羥基與CNBr反應(yīng)，生成活潑的亞胺碳酸鹽，在弱堿條件下，可與酶分子的氨基偶聯(lián)，產(chǎn)生固定化酶。d、芳香烴化法具有羥基的載體可以通過烷基化、芳香基化引入活潑的鹵素基后，在堿性條件下，與酶分子上的氨基、酚基、巰基等反應(yīng)。纖維素載體均三氯三嗪3-F-4，6-二硝基苯4、交聯(lián)法利用雙功能或多功能試劑在酶分子間或酶與惰性蛋白間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)制備固定化酶。最常用的交聯(lián)試劑是戊二醛，其他如苯基二異硫氰、雙重氮聯(lián)苯胺-2，2’-二磺酸、1，5-二氟-2，4-二硝苯、己二酰二胺二甲脂等。

戊二醛有兩個(gè)醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)，使酶蛋白交聯(lián)。缺點(diǎn)：①反應(yīng)條件激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失大。

②制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來不便。各種固定化方法的比較交聯(lián)法常與吸附法、包埋法結(jié)合使用。第二節(jié)固定化酶的性質(zhì)

由于固定的方法不同，固定化酶的活力和性質(zhì)也有所不同。

一、固定化酶的活力下降

原因：①酶的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象發(fā)生變化(特別是酶活性中心)；②酶與底物間的相互作用受到空間位阻(屏蔽效應(yīng))；③微環(huán)境影響；④底物、產(chǎn)物的分配不均效應(yīng)；⑤底物、產(chǎn)物的擴(kuò)散限制效應(yīng)

活力測(cè)定、偶聯(lián)效率、活力回收、相對(duì)活力

二、固定化酶的穩(wěn)定性提高

原因：①固定化增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度，可防止酶分子伸展變形；②抑制蛋白酶降解；③固定化部分阻擋了外界不利因素對(duì)酶的侵襲。

但如果固定化觸及到酶穩(wěn)定性區(qū)域，也可能導(dǎo)致酶穩(wěn)定性下降。

1、熱穩(wěn)定性提高氨基酰化酶：溶液酶在75℃保溫15min，活力為0；DEAE-Sephadex固定化酶在同樣條件下仍有80％；DEAE-纖維素固定化酶在同樣條件下還有60％活力。

2、對(duì)蛋白酶的抵抗力提高氨基?；福涸谝鹊鞍酌缸饔孟禄盍H存20％，而將其固定于DEAE－纖維素上在同樣條件下仍有80％的活力。3、對(duì)變性劑、抑制劑的抵抗能力提高氨基?；福喝芤好冈?mol、2mol弧、1％SDS和4mmol丙酮溶液中相對(duì)活力分別為9％、49％、1％和55％，而后者在相應(yīng)溶液中相對(duì)活力則分別為146%、117%、35%和138%。

4、操作穩(wěn)定性提高固定化酶在操作中可以長期使用，半衰期較長。

青霉素?；福?7℃催化77天，活力仍為100%5、貯藏穩(wěn)定性提高

木瓜蛋白酶：在4℃下，120天溶液酶活力只保留有70%，而固定化酶（瓊脂）活力無變化。三、固定化酶的催化特性改變1、最適溫度固定化酶反應(yīng)的溫度一般較溶液酶的高，如用CM-纖維素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度比溶液酶高5~15℃。（但也有例外）

2、最適pH

最適pH的變動(dòng)依據(jù)載體的電荷性質(zhì)而定。帶負(fù)電荷載體：最適pH向堿性偏移。帶正電荷載體：最適pH向酸性偏移。DEAE-纖維素或DEAE-葡聚糖固定化氨基?；概c其游離酶比較，低0.5個(gè)pH而偏向酸性方向。CM-纖維素固定化的胰蛋白酶、糜蛋白酶的最適pH與游離酶比較，向堿性方向偏移0.5~1個(gè)pH單位。

3、Km（反應(yīng)動(dòng)力學(xué)）多數(shù)固定化酶的Km有一定變化，與活性中心的構(gòu)象改變及載體的電荷性質(zhì)有關(guān)。載體與底物電荷相反，固定化酶的Km值降低。載體與底物電荷相同，固定化酶的Km值顯著增加。4、專一性

大多數(shù)固定化酶的專一性與溶液酶相同，但也有例外。第六章酶(蛋白質(zhì))分子的化學(xué)修飾（蛋白質(zhì)水平的分子改造）

酶分子的化學(xué)修飾就是在體外通過人工的方法將酶分子與一些化學(xué)基團(tuán)或化學(xué)物質(zhì)(修飾試劑)進(jìn)行共價(jià)連接從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。

基礎(chǔ)研究：①探測(cè)酶活性必需氨基酸的性質(zhì)和數(shù)目；②探測(cè)酶蛋白的結(jié)構(gòu)變化與功能的關(guān)系；③測(cè)定酶蛋白部分區(qū)域的構(gòu)象狀態(tài)；④探索酶的作用機(jī)理和催化反應(yīng)歷程；⑤研究酶的固定化技術(shù)。

應(yīng)用研究：①提高酶的穩(wěn)定性；②改善酶的催化特性；③提高蛋白藥物在體內(nèi)不穩(wěn)性、消除免疫原性及靶向性（病灶細(xì)胞）。第一節(jié)酶化學(xué)修飾的基本條件必須對(duì)被修飾酶的性質(zhì)、修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件等方面有足夠的了解一、被修飾酶的性質(zhì)

1、基本性質(zhì)熱、酸堿穩(wěn)定性，最適溫度、pH，pI，抑制劑，蛋白酶水解部位等。2、酶活性中心氨基酸殘基數(shù)目、性質(zhì)及其地位、有無輔助因子及種類。

3、被修飾氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)及反應(yīng)性常被修飾的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基、氨基、羧基、咪唑基、羥基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫鍵等①巰基的修飾試劑烷基化試劑：碘乙酸、碘乙酸胺、巰基乙醇、谷胱甘肽

汞試劑：HgCl2、對(duì)氯汞苯甲酸、2-氯汞硝基苯酚Ellman試劑：5，5’-二硫-二-2-硝基苯甲酸

②氨基的修飾試劑

乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、苯異硫氰酸酯、碘乙酸

③羧基的修飾試劑甲醇、硼氟化三甲鋅鹽（-COOCH3）

④咪唑基的修飾試劑碘乙酸、碘乙酸胺

⑤吲哚基的修飾試劑光敏試劑（打開吲哚環(huán)）、4-硝基苯硫氯⑥甲硫氨酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾試劑碘代乙酰胺、H2O2或光敏試劑(E-S-CH3的硫氧化)

⑦二硫鍵的修飾試劑

二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇

⑧酚基的修飾試劑N-乙酰咪唑、二異丙基氟磷酸

⑨胍基的修飾試劑

丁二酮、苯乙二醛（結(jié)合在胍基的兩個(gè)氨基上）二、修飾反應(yīng)的條件酶穩(wěn)定、