纖維素分解細(xì)菌的分離和鑒定

纖維素分解細(xì)菌的分離和鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?研究低溫環(huán)境下纖維素降解細(xì)菌的分離與鑒定.采用低溫培養(yǎng)的方法從秸稈堆肥中篩選出3株分解纖維素的細(xì)茵。通過PCR克隆這3株茵的16srDNA并與相似菌株做比對(duì).進(jìn)一步構(gòu)建分子進(jìn)化樹.來研究其分類情況。綜合其個(gè)體形態(tài)、茵落形態(tài)、生理生化特征、16SrDNA發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果等分類依據(jù)。實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)菌進(jìn)行化能異養(yǎng)、短桿狀、無出芽分裂、好氧、革蘭氏染色陰性.無芽抱、無絲狀菌體、有細(xì)胞壁且能獨(dú)立生存。應(yīng)為其第二部分滑動(dòng)細(xì)菌或第七部分的假單胞菌類。由于滑動(dòng)細(xì)菌能在“固體表面和汽一水交界面緩慢滑動(dòng)”，故其固體菌落邊緣應(yīng)不整齊，且其一般形成亮色肉眼可見的子實(shí)體。將滅菌的濾紙蘸取無菌生理鹽水后貼在已凝固的平板上，用接種環(huán)蘸取土樣，點(diǎn)樣在平板濾紙上，15°C下培養(yǎng)10d。用接種環(huán)從有濾紙水解透明圈的單菌落處刮取細(xì)菌，在貼有濾紙的初篩平板上劃線，計(jì)數(shù)并且觀察。三、實(shí)驗(yàn)儀器：1、 材料試驗(yàn)材料為背陰處長時(shí)間堆放的秸稈堆肥表層；2、培養(yǎng)基：初篩培養(yǎng)基。濃縮10倍的赫奇遜固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基”。：啦嘞1.00g，MgS04-7H200.30g，NaCl0.10g，F(xiàn)'eCl3O.0lg，NaN032.50g，CaCi20.10g，瓊脂18.00g，蒸餾水l000lnl，pH值7.0?7.2.121C滅菌20min。無淀粉濾紙（浙江富陽紙廠）用濃度l%的醋酸浸泡一夜后用濃度2%的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干備用。把上述處理過的濾紙剪成直徑約為8ca的圓形濾紙片.放在干凈的平皿中，用報(bào)紙包好.采用濕熱的方法滅菌；3、 復(fù)篩培養(yǎng)基。濃縮10倍的赫奇遜固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基：啦P041.009，m.廬04‘7H200.309。NaO0.109.FeCl30.01g，NaN032.50g.CaCl20.10g，羧甲基纖維素鈉lO.00g，瓊脂18.00g，蒸餾水10130ml，pH值7.0—7.2，121C滅菌20min。4、 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基；5、 生理生化特征鑒定培養(yǎng)基。四、實(shí)驗(yàn)步驟:1、 菌種分離菌種初篩。將滅菌的濾紙蘸取無菌生理鹽水后貼在已凝固的平板上，用接種環(huán)蘸取土樣，點(diǎn)樣在平板濾紙上，15C下培養(yǎng)10d。用接種環(huán)從有濾紙水解透明圈的單菌落處刮取細(xì)菌，在貼有濾紙的初篩平板上劃線，15C下培養(yǎng)10d。重復(fù)此操作至菌種初步純化。2、 菌種復(fù)篩。用接種環(huán)從已初步純化的初篩平板上濾紙水解透明圈的菌落處，刮取菌種在復(fù)篩平板上劃線，15C下培養(yǎng)7d，得到單菌落。將分離純化的單菌落回接到初篩培養(yǎng)基上，觀察其對(duì)濾紙的分解。將分離到的單菌落接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上。15C下培養(yǎng)7d,4C保留菌種或用作各種鑒定。3、 菌種形態(tài)觀察個(gè)體形態(tài)觀察。對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色、莢膜染色和芽抱染色，觀察結(jié)果；進(jìn)行牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基（含瓊脂O.4%）穿刺接種，觀察游動(dòng)性；對(duì)菌體形態(tài)進(jìn)行鏡檢，菌體大小采用數(shù)字顯微圖像處理軟件MIE測量。4、 菌落形態(tài)觀察。在復(fù)篩培養(yǎng)基上15°C下培養(yǎng)7d,進(jìn)行菌落形態(tài)觀察。5、 菌株最適溫度與ph的測定將篩選菌株分別在II、15、20、25、29、37C下涂布培養(yǎng)5d（密度不可過高），至少選取加個(gè)單菌落測量其直徑，繪制3株菌的單菌落平均直徑隨溫度的變化曲線，作為最適生長溫度的參考。同樣.不同pH梯度下涂布培養(yǎng)5d，測量單菌落平均直徑，繪制其隨pH的變化曲線，作為最適生長pH的參考。6、 生理生化特征鑒定采用“1.2.4”所述的生理生化反應(yīng)鑒定培養(yǎng)基對(duì)篩選的3株菌進(jìn)行鑒定。7、 16srDNA鑒定菌株VCR模板制備㈣9。取培養(yǎng)3d的平板單菌落懸于50m無菌蒸餾水中，于100C水浴5—10min，取出立即放置冰上，保存。16SrDNA的PaR擴(kuò)增與測序。采用上海生工生物工合成的l對(duì)16SrDNA引PCR擴(kuò)增條件：94C預(yù)變性5rain，94C變性45s.50C退火45s，72C延伸，50lll反應(yīng)體系30個(gè)循環(huán)后再72C延伸5min。8、 序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。將測得的16SrDNA序列在Genlhnk上進(jìn)行BLA.gI”比對(duì)，對(duì)獲得的同源序列進(jìn)行序列分析。取同源性較高的不同種的模式序列（TypeStrain^MEGA4。10：進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。五、結(jié)果與分析：1、 菌株的篩選通過菌株的初篩、復(fù)篩和同接試驗(yàn)，共分離出15種具有纖維素降解活性的菌株。其中的13株細(xì)菌，分別命名為WHI—WHl3。測量15C下培養(yǎng)10d的濾紙分解圈.WHl2平均為7.0咖.WH3為5.5rrlin，Will為5.0ml'n，其他菌株均在3.0mm以下。選取菌株Will、WH3、WHl2繼續(xù)研究。菌株wHl2對(duì)濾紙分解能力最強(qiáng).15C下培養(yǎng)10d.該2、 菌種形態(tài)觀察結(jié)果1個(gè)體形態(tài)觀察結(jié)果、通過染色，光鏡（10X100）下進(jìn)行形狀觀察和半固體培養(yǎng)基穿刺接種運(yùn)動(dòng)性觀察.采用數(shù)字顯微圖像處理軟件MIE對(duì)菌體大小進(jìn)行測量，結(jié)果見表l。3株菌均為革蘭氏陰性桿菌，有莢膜.不產(chǎn)生芽抱.均呈桿狀。穿刺接種顯示細(xì)菌沿穿刺線擴(kuò)散，說明細(xì)菌口，能有鞭毛。3、 菌落形態(tài)觀察結(jié)果。對(duì)3株菌在復(fù)篩培養(yǎng)基上15C下培養(yǎng)7t，3株菌具有不同的菌落形態(tài)。在復(fù)篩培養(yǎng)基上均為淺顏色，但在濾紙培養(yǎng)基上Will菌落為鮮綠色.WI-13為棕黃色。WHl2為桔黃色。生理生化結(jié)果顯示，3種菌均能利用葡萄糖；能產(chǎn)生胞外呈陽性。脂酶，但都不明顯；能利用多種碳源。WH!和WI-112能水解2.4培養(yǎng)特征測定結(jié)果明膠，即分泌胞外的蛋白酶；WH3和Wttl2則能水解蛋白胨中的色氨酸.產(chǎn)生吲哚反應(yīng)；Will和WH3分解匍萄糖產(chǎn)酸，能使漠甲酚紫變黃（PH值5.2）但不能使甲基紅變紅（pH值=4.2）。grill能分解硫代硫酸鈉產(chǎn)生硫化氫。4、 最適生長溫度。在不同溫度下培養(yǎng)，3株菌的培養(yǎng)曲用單菌落測量生長曲線雖不典型，。但也能表現(xiàn)出菌的最適生長溫度。WHI和WH3在20°C左右菌落直徑最大。5、 菌種鑒定上述試驗(yàn)結(jié)果表明3株菌進(jìn)行化能異養(yǎng)、短桿狀、無出芽分裂、好氧、革蘭氏染色陰性.無芽抱、無絲狀菌體、有細(xì)胞壁且能獨(dú)立生存。應(yīng)為其第二部分滑動(dòng)細(xì)菌或第七部分的假單胞菌類。由于滑動(dòng)細(xì)菌能在“固體表面和汽一水交界面緩慢滑動(dòng)”，故其固體菌落邊緣應(yīng)不整齊，且其一般形成亮色肉眼可見的子實(shí)體。Will、WH3和WH12都未發(fā)現(xiàn)類似菌落特征。故認(rèn)為3株菌屬假單胞菌類。根據(jù)3株菌生化反應(yīng)特征，氧化酶反應(yīng)陽性和分解蛋白質(zhì)，確定不屬于黃單胞菌屬和滑動(dòng)單胞菌屬，故可能為假單胞菌屬和葡糖桿菌屬。6、 16srDNA餅姨鑒定結(jié)果BLAST比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示菌株Will的16SrDNA測試結(jié)果為I442個(gè)堿基，共有198條序列最大相似度（Maxldent）在99%以上，幾乎均鑒定為假睢胞菌屬，涉及到已鑒定的12個(gè)種。當(dāng)前普遍觀點(diǎn)認(rèn)為：16SrDNA序列同源性大于99%，可以認(rèn)為屬于同一種;小于98%，則可認(rèn)為屬于不同的種；16SrDNA序列同源性小于95%，則可認(rèn)為屬于不同屬："-I3『。由于假單胞菌屬菌種相對(duì)較復(fù)雜，相似度為99%仍不能鑒定到種，但可以確定的是Will屬于假單胞菌屬，同時(shí)可進(jìn)一步通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹尋求wHl與其他種可能的進(jìn)化關(guān)系。菌株WH3的16srDNA測試結(jié)果為：l443個(gè)堿基（Gen.Bank序列號(hào):H262367）°BLASI"GenBank的基因序列后，分析確定WH3為假啦胞菌屬。菌株WHl2的16SrDNA測得l439個(gè)堿基（GenBank序列號(hào)：H262368）。BLASTGenBank的基因序列后分析確定WHl2。仍為假單胞菌屬。7、 系統(tǒng)發(fā)育樹。通過構(gòu)建同屬不同種序列的系統(tǒng)發(fā)育樹可進(jìn)一步鑒定菌株的種型。通過在Ge刪數(shù)據(jù)庫的BLAST.選取同屬已鑒定的所有不同種12條模式種序列。通過MEGA4的CLUbTALW進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由于這12條序列具較高的同源性（均在99%以上），即進(jìn)化距離較短，宜采用最小演化長度法（Minim,,,nEvolmion）構(gòu)建L14。，.經(jīng)自舉法（1kmtstmpMethod）檢驗(yàn)，該樹基本正確。一般認(rèn)為，當(dāng)一個(gè)給定的內(nèi)部樹枝的自舉值為95%或者更高.才認(rèn)為樹枝結(jié)構(gòu)正確-14一二所以不能鑒定WHI具體足Pseudornor船屬的哪一種，為驗(yàn)汪假?zèng)]的正確性，隨機(jī)取假單胞菌科（Pseu（b咖哪Iaccac）的4個(gè)屬（Pseudomonas、Xanthomonas、Zoogloea和C.1uconobacter）的菌株構(gòu)建發(fā)育樹，驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)Will屬于假單胞菌屬的可信度為100%，則暫定Will名為Pseudomonassp.strainWillo與WH3BLAST顯示的共3個(gè)不同種.參考WHI，同樣選擇各個(gè)種的16SrDNA序列，采用MEGA4通過最小演化長度法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選取不同種各一條模式種基因序列，采用MF_EA4通過最小演化長度法構(gòu)建系經(jīng)自舉法檢驗(yàn)，發(fā)育樹構(gòu)建基本正確。WI-112與WHI情況相似，很難據(jù)此確定為何種.但確定認(rèn)為WHl2屬假單胞菌屬（Pseudomonas），暫定名為Pmudomonassp.血dillWH120o8、 結(jié)論與討論綜合以上結(jié)果，菌株Will、WH3和WHl2經(jīng)初步鑒定可能為假單胞菌屬和（或）葡糖桿菌屬的種，通過16SrDNA分析進(jìn)一步確定該3株細(xì)菌均屬假單胞菌WH3為惡臭假單胞菌。未曾有關(guān)其降解纖維素的報(bào)道。試驗(yàn)對(duì)其做的相關(guān)特性鑒定.個(gè)