細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)1:實(shí)驗(yàn)用品（1） 儀器：超凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋，電熱干燥箱，濾器，酸缸，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，液氮罐，紫外燈。（2） 耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板，凍存管（3） 試劑和藥品：平衡鹽溶液PBS，RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗（抗青霉素和抗鏈霉素），0.25%的胰酶，凍存液，DMSO。溶液的配制：PBS:5.8gNa2HPO4,0.1gKCl,0.1gK3PO4,4gNaCl（500mldistilledwater）pH7.4PH=7.4的PBS液的配制：稱取Nacl20g，Kcl0.5g，Na2HPO4-12H2O8.725g/Na2HPO45.8g，KH2PO40.5g，加三蒸水2500ml，溶解，過濾，121°C滅菌20min，冷藏（4°C）備用。0.25%的胰酶的配制：0.25g胰酶加100mlPBS溶液，冰浴中緩慢攪拌使完全溶解，過膜過濾器（0.22膜過濾器）除菌，冷藏（4C）備用。培養(yǎng)基的配制：RPMI-1640培養(yǎng)基原液450ml+胎牛血清50ml+雙抗（抗青霉素和抗鏈霉素）5ml，冷藏（4C）備用。凍存液的配制：RPMI-1640培養(yǎng)基原液30ml+胎牛血清6ml+DMSO4ml，冷藏（4C）備用。2：培養(yǎng)用品的清洗和消毒殺菌2.1:培養(yǎng)用品的清洗2.1.1:玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個(gè)步驟浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運(yùn)輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)等。先用自來水簡單刷洗，然后用5%稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉。用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)。刷洗要適度，過度會(huì)損害器皿表面光澤度。浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中，清潔液對(duì)玻璃器皿無腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)。浸泡時(shí)器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時(shí)間：一般為過夜，不應(yīng)少于6小時(shí)。一般為24小時(shí)。清潔液常用三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）-強(qiáng)清潔液63:1000:200次強(qiáng)清洗液 125:200:1000弱清潔液100:100:1000配制時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分；配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。本實(shí)驗(yàn)用次強(qiáng)酸：重鉻酸鉀125g+濃硫酸250ml+蒸^水1000ml為一份，配制八份放入酸缸中，備用。沖洗：在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或清潔液的殘跡。最好用洗滌裝置，如用手工操作：需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次，晾干備用。2.1.2:膠塞的清洗新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理。常規(guī)清洗方法：每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘（以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)），蒸餾水煮10分鐘或者10%Hcl半個(gè)小時(shí)，然后自來水沖洗干凈，蒸餾水沖洗2-3次，晾干備用。2.1.3:塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時(shí)用2%NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。2.2消毒：細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染。2.2.1常見原因：a操作間或周圍空間的不潔。b培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底。由于有關(guān)培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染。2.2.2消毒滅菌方法：物理消毒滅菌法：紫外線：用于空氣，超凈工作臺(tái)表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒的培養(yǎng)器皿，30min。濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121°C，20min。一般培養(yǎng)瓶，離心管，凍存管，槍頭，PBS液等等都是濕熱法。過濾：0.22以m微孔膜過濾器?；瘜W(xué)消毒滅菌法：75%酒精：主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。1%。新潔爾滅：主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。抗生素：主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染。3：細(xì)胞培養(yǎng)3.1細(xì)胞種類：MCF-7細(xì)胞（乳腺癌細(xì)胞），Hela細(xì)胞（宮頸癌細(xì)胞），HepG2細(xì)胞（肝癌細(xì)胞）都為貼壁細(xì)胞。3.2細(xì)胞計(jì)數(shù)原理：當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。操作：蓋好蓋玻片：取血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測(cè)細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，分別數(shù)出四角的四個(gè)大鉻（每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻）中死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)。計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml=（四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4）X2X104說明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1:1稀釋。公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm（長）X1.0mm（寬）X0.1mm（高）=0.1mm3而1ml=1000mm33.3:MCF-7細(xì)胞的傳代原理：體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2或1:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。操作：（1） :將長成單層的細(xì)胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺(tái)中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液。（2） :加入少許消化液即胰酶（以液面蓋住細(xì)胞為宜），靜置1分鐘左右，在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞，如果細(xì)胞變圓，相互之間不再連接成片，這時(shí)應(yīng)立即在超凈臺(tái)中將消化液倒掉。注意消化時(shí)間的控制，不能過長也不能過短。（3） :加入3?5ml新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液移入離心管，1000r/min，離心5分鐘，棄去上清液，再加入3ml新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。⑷：將細(xì)胞懸液吸出加到兩個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，每個(gè)瓶中加上1?2ml（加入量由細(xì)胞濃度來定），并向每瓶中分別加10ml左右培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)一般情況，傳代后的細(xì)胞在2小時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2?4天就可在瓶內(nèi)形成單層，需要再次進(jìn)行傳代。3.4細(xì)胞凍存原理:凍存細(xì)胞時(shí)要緩慢冷凍。因?yàn)榧?xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接冷凍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)很快形成冰晶，冰晶的形成將引起一系列的不良反應(yīng)。如：細(xì)胞脫水使局部電解質(zhì)濃度增高，PH改變，部分蛋白質(zhì)由于上述因素而變性；細(xì)胞核內(nèi)DNA也是冷凍時(shí)細(xì)胞易受損傷的部分。。凍存時(shí)要盡可能的均勻地減少細(xì)胞內(nèi)的水分，減少細(xì)胞內(nèi)的冰晶的形成是減少細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO,它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反.結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂標(biāo)準(zhǔn)程序：當(dāng)溫度在-25°。以上時(shí)，1?2°C/min當(dāng)溫度達(dá)-25C以下時(shí)，5?10C/min當(dāng)溫度達(dá)-100C時(shí)，可迅速放入液氮中簡易程序：常溫一個(gè)小時(shí)，4C一個(gè)小時(shí)，-20C一個(gè)小時(shí)，然后將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，液氮上層的液氮?dú)庵?0個(gè)小時(shí)，最后放入液氮中長期保存。操作：1：用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來，依據(jù)傳代方法把消化好的細(xì)胞收集于離心管并計(jì)數(shù)，離心1000r/min,5min。2：去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入配制好的凍存液，凍存液中細(xì)胞的最終密度為（1?5）X106個(gè)/ml。用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，然后分裝入凍存管中，每只凍存管加液1?1.5ml。3：凍存管必須旋緊確保封閉。凍存管上應(yīng)寫明細(xì)胞的名稱、凍存時(shí)間等信息。4：封存好的凍存管即可直接凍存。常溫一個(gè)小時(shí)，4°C一個(gè)小時(shí)，-20°C一個(gè)小時(shí)，然后將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，液氮上層的液氮?dú)庵?0個(gè)小時(shí)，最后放入液氮中長期保存。3.5細(xì)胞的復(fù)蘇原理：復(fù)蘇細(xì)胞與凍存的要求相反，應(yīng)采用快速融化的手段。這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化。避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害。用品：操作步驟：（1） 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