藥學(xué)分子生物學(xué)：第二章 DNA的復(fù)制、損傷和修復(fù)

第二章DNA的復(fù)制、損傷和修復(fù)DNA復(fù)制DNA雙鏈在細(xì)胞分裂間期進(jìn)行的以一個親代DNA分子為模板合成子代DNA鏈的過程。DNA復(fù)制的一般特征半保留復(fù)制(semicon-servativereplication)：DNA復(fù)制過程中，兩條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?。ThreeHypothesesofReplicationThreemethodsofDNAreplicationwereconsidered:SemiconservativeConservativeDispersive彌散型復(fù)制實驗證據(jù)（1958Meselson和Stahl）：

MatthewMeselsonFranklinStahl“Heavy”DNA“Hybrid”

DNA“l(fā)ight”DNA“Hybrid”DNA雙向復(fù)制：從復(fù)制起點開始同時向兩側(cè)進(jìn)行復(fù)制20-10枯草桿菌中雙向復(fù)制的證明弱放射線標(biāo)記復(fù)制泡強(qiáng)放射線標(biāo)記的DNA果蠅中雙向復(fù)制的證明復(fù)制過程中對DNA先強(qiáng)標(biāo)記再弱標(biāo)記發(fā)現(xiàn)：從中間向兩側(cè)變?nèi)醣砻鳎簭?fù)制子有一個中央復(fù)制起點和兩個復(fù)制叉20-12不同時間ColE1質(zhì)粒用EcoRI單切在復(fù)制上方的一段DNA始終沒有變化而下方的DNA隨著復(fù)制泡的增大而變小說明：單向復(fù)制3.半不連續(xù)復(fù)制：

DNA復(fù)制過程中，先導(dǎo)鏈合成是連續(xù)的；后隨鏈合成是先形成小片段(Okazakifragment，岡崎片段)，再連接而成DNA長片段。野生型細(xì)菌DNA連接酶突變的細(xì)菌有一定的復(fù)制起始點：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起點(originofreplication,ori)。DNA復(fù)制從起始點開始直到終點為止，每個這樣的DNA單位稱為復(fù)制子(replicon)；復(fù)制起始點兩條鏈解開成單鏈，分別做模板各自合成其互補鏈所形成的Y形結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉(replicationfork)。需要引物

(primer)：DNA聚合酶必須以一段具有3'-OH的RNA作為引物，才能開始聚合子代DNA鏈

DNA復(fù)制的酶學(xué)使DNA鏈解離的酶：解旋酶(helicase)：通過ATP獲能，沿5‘→3’方向解開DNA雙鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白（single-strandbindingprotein,SSB):與單鏈DNA結(jié)合，阻止其再形成雙鏈體狀態(tài)；保護(hù)單鏈DNA不被水解DNA旋轉(zhuǎn)酶：拓?fù)洚悩?gòu)酶II（DNATopisomerase），催化DNA拓?fù)洚悩?gòu)體相互轉(zhuǎn)換，松弛超螺旋DNA復(fù)制過程中的酶RNA引物酶：催化合成與模板DNA3’端互補的RNA引物DNA聚合酶(DNApolymerase)：在引物的3’-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令逐個聚合上核苷酸，從5’→3‘合成新鏈E.coliDNAPolymerasesThereare3DNApolymerases,theenzymesthatmakeDNA,foundinE.coli:polIpolIIpolIIIE.coliDNApolymeraseIwasthefirstpolymeraseidentifiedItwasdiscoveredin1958byArthurKornbergDNAPolymeraseIDNApolymeraseI(polI)isaversatile多功能enzymewith3distinctactivitiesDNApolymerase3’5’exonuclease5’3’exonucleaseMildproteolytic溫和的蛋白酶treatmentresultsin2polypeptidesKlenowfragmentSmallerfragment5’3’exonucleaseThisactivityallowspolItodegradeastrandaheadofadvancingpolymerase降解前方的DNA鏈RemovesandreplacesastrandinonepassBasicfunctionsare:PrimerremovalRNA引物去除和轉(zhuǎn)換Nickrepair切口修復(fù)KlenowFragmentContainsboth:Polymeraseand3’5’exonucleaseactivitywhichservesasproofreadingIfpolIaddedwrongnt,won’tbasepairproperlyPolIpauses,exonucleaseremovesmispairedntAllowsreplicationtocontinueIncreasesfidelityofreplicationPolymerasesIIandIIIPolIIactivityisnotrequiredforDNAreplication非必須PolIappearsmostlyactiveinrepair主要功能是修復(fù)OnlypolIIIisrequiredforDNAreplicationPolIIIistheenzymethatreplicatesbacterialDNAThePolIIIHoloenzyme全酶DNA聚合酶Ⅰ多功能酶

5’3’外切酶

3’5’外切酶

5’3’聚合酶單鏈多肽大小二個片段切除RNA引物，填補空缺損傷后修復(fù)DNA聚合酶Ⅱ與Ⅲ多功能酶

5’3’聚合酶

3’5’外切酶

不對稱二聚體單體1-前導(dǎo)鏈/單體2-隨從鏈DNA復(fù)制的主要酶高續(xù)進(jìn)性高聚合酶活性高產(chǎn)物真實性MultipleEukaryoticDNAPolymerasesdeltaepsilon真核細(xì)胞DNA聚合酶的作用DNA聚合酶功能DNA聚合酶αDNA復(fù)制合成后隨鏈DNA聚合酶δDNA復(fù)制合成先導(dǎo)鏈DNA聚合酶ε參與DNA的修補合成DNA聚合酶βDNA修復(fù)DNA聚合酶γ線粒體DNA復(fù)制DNA復(fù)制的過程復(fù)制的起始復(fù)制的延伸復(fù)制的終止1.復(fù)制的起始復(fù)制原點(OriC):245bp的DNA序列,富含A-T,3個13聚體的回文結(jié)構(gòu)和4個9聚體的重復(fù)序列雙鏈解開、復(fù)制起始大約20個DnaA蛋白在ATP的作用下與oriC處的4個9bp保守序列相結(jié)合在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna復(fù)制起始復(fù)合物使3個13bp直接重復(fù)序列變性,形成開鏈解鏈酶六體分別與單鏈DNA相結(jié)合(需DnaC幫助),進(jìn)一步解開DNA雙鏈蛋白質(zhì)DnaADnaBDnaCDnaG（引物酶）結(jié)合到DNA雙鏈復(fù)制起始部位(需ATP)解鏈酶的作用輔助DnaB結(jié)合到復(fù)制起始點合成RNA引物RNA引物的合成和復(fù)制的起始必需的2.復(fù)制的延伸先導(dǎo)鏈(leadingstrand)合成：以3’→5’親本鏈為模板，由引發(fā)體合成引物，DNA聚合酶Ⅲ催化以5’→3’合成一條完整的新鏈后隨鏈(laggingstrand)合成：引物RNA合成→DNApolⅢ→合成岡崎片段→

DNA

polI切除岡崎片段上的RNA引物→由DNA連接酶連接兩個岡崎片段→形成完整的DNA后隨鏈3.復(fù)制的終止E.ColiDNA具有終止位點(ter)，與蛋白質(zhì)Tus結(jié)合，阻止解鏈酶活性而終止復(fù)制兩個環(huán)狀DNA分子，經(jīng)過拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ作用分離真核生物DNA復(fù)制的特點真核生物多起點復(fù)制，形成多個復(fù)制叉，自主復(fù)制序列啟動DNA復(fù)制DNA聚合酶α和δ是主要復(fù)制酶DNA的延長取決于增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)真核細(xì)胞染色體為線性，末端有由端粒酶合成的端粒結(jié)構(gòu)染色體復(fù)制涉及核小體，DNA復(fù)制后需要與組蛋白結(jié)合形成染色體端粒結(jié)構(gòu)的形成端粒是一段DNA序列和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合體端粒DNA由多個串聯(lián)的5-8bp寡核苷酸序列組成端粒DNA的合成端粒酶是反轉(zhuǎn)錄酶，由蛋白質(zhì)和RNA兩部分組成，它以自身的RNA為模板，在后隨鏈模板DNA的3’OH末端延長DNA再以這種延長的DNA為模板，繼續(xù)合成后隨連形成端粒結(jié)構(gòu)端粒的功能和特點保證線性DNA的完整復(fù)制保護(hù)染色體末端不受核酸酶水解和不發(fā)生染色體的異常重組體細(xì)胞端粒酶活性低隨著復(fù)制次數(shù)的增加端粒DNA逐步縮短，細(xì)胞逐漸停止分裂，進(jìn)而進(jìn)入凋亡惡性腫瘤細(xì)胞可表達(dá)端粒酶，永生分裂線粒體DNA(mtDNA)復(fù)制mtDNA結(jié)構(gòu)：雙鏈閉環(huán)，含有大量G的重鏈和含有大部分C的輕鏈，各有一個復(fù)制區(qū)，均有編碼功能。mtDNA復(fù)制過程：環(huán)取代方式復(fù)制①H-鏈?zhǔn)紫群铣桑涸趶?fù)制起點處以L鏈為模板合成RNA引物，合成H鏈片段并與L鏈以氫鍵結(jié)合形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，將親代的H鏈置換出來，產(chǎn)生一種D環(huán)復(fù)制中間物②L-鏈的合成：當(dāng)H-鏈的復(fù)制進(jìn)行到2/3基因組的位置時，L-鏈的復(fù)制起點被暴露，以被置換下來的親代H鏈為模板，開始合成L-鏈DNA，合成也需要RNA引物③復(fù)制的完成：H鏈的合成先完成，L鏈合成隨后結(jié)束單鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制φX174噬菌體由一個單鏈環(huán)狀DNA組成，這條鏈稱為正（+）鏈；合成的互補鏈稱為負(fù)（一）鏈。雙鏈體的復(fù)制以滾環(huán)復(fù)制方式進(jìn)行雙鏈線狀DNA的復(fù)制過程復(fù)制從DNA中間開始—T7噬菌體復(fù)制起始必需的三個酶：T7RNA聚合酶、T7DNA聚合酶和基因4蛋白(geneproduct4,gp4)復(fù)制由轉(zhuǎn)錄開始必需以RNA為引物T7噬菌體DNA的復(fù)制復(fù)制從末端開始—腺病毒,以單鏈置換形式進(jìn)行復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄病毒：RNA病毒。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下首先將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，并插入宿主的DNA中，進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯達(dá)到擴(kuò)增目的RNA→DNA→RNA逆轉(zhuǎn)錄酶RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶：以RNA為模板合成DNADNA指導(dǎo)的DNA聚合酶：以DNA為模板合成DNA核糖核酸酶H(RNaseH)活性：特異性水解RNA-DNA雜交雙鏈上的RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制第二節(jié)DNA損傷外界因素（如輻射、藥物等）使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生不正常改變，或由于DNA鏈中某一核苷酸發(fā)生突變，使DNA堿基序列改變從而干擾復(fù)制和轉(zhuǎn)錄DNA損傷的原因內(nèi)源性損傷：DNA復(fù)制錯誤堿基互變異構(gòu)體導(dǎo)致錯配DNA自發(fā)的化學(xué)改變氧化作用損傷堿基外源性損傷物理因素：紫外線及各種射線化學(xué)因素：堿基類似物、堿基修飾劑、DNA插入劑

1、DNA復(fù)制錯誤

堿基配對的錯誤頻率約為10-1～10-2，DNA聚合酶的作用下降到約10-5-10-6，校正后的錯配率仍約在10-10左右。2、DNA自身的不穩(wěn)定性

(1)堿基的異構(gòu)互變

使堿基配對間的氫鍵改變，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鳥嘌呤等

（例如烯醇式與酮式堿基間的互變）

(2)堿基的脫氨基作用

堿基的環(huán)外氨基有時會自發(fā)脫落，從而胞嘧啶會變成尿嘧啶、腺嘌呤會變成次黃嘌呤（H）、鳥嘌呤會變成黃嘌呤（X）等，遇到復(fù)制時，U與A配對、H和X都與C配對就會導(dǎo)致子代DNA序列的錯誤變化。胞嘧啶自發(fā)脫氨基的頻率約為每個細(xì)胞每天190個。

(3)脫嘌呤與脫嘧啶

自發(fā)的水解可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落下來。一個哺乳類細(xì)胞在37℃條件下，20h內(nèi)DNA鏈上自發(fā)脫落的嘌呤約1000個、嘧啶約500個；估計一個長壽命不復(fù)制繁殖的哺乳類細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）在整個生活期間自發(fā)脫嘌呤數(shù)約為108，這占細(xì)胞DNA中總嘌呤數(shù)約3%。

3、機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的活性氧

細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)物O2-、H2O2等會造成DNA損傷，能產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇等堿基修飾物，還可能引起DNA單鏈斷裂等損傷，每個哺乳類細(xì)胞每天DNA單鏈斷裂發(fā)生的頻率約為5萬次。（二）環(huán)境因素1、物理因素（1）電離輻射（2）非電離輻射（1）電離輻射：能直接或者間接引起被穿透物質(zhì)產(chǎn)生電離包括α粒子、β粒子、γ射線、X射線等。

（2）非電離輻射：包括紫外以及能量低于紫外的所有電磁輻射，傳遞能量，使物質(zhì)分子或原子中的軌道電子從較低的能態(tài)躍遷到較高的能態(tài)。同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連成二聚體，相鄰的兩個T、或兩個C、或C與T間都可以環(huán)丁基環(huán)（cyclobutanering）連成二聚體，其中最容易形成的是TT二聚體。2、化學(xué)因素（1）自由基（2）堿基類似物（3）堿基修飾物（4）嵌入性染料（1）自由基導(dǎo)致的損傷定義：指能夠獨立存在，核外帶有未配對電子的原子或者分子。具有強(qiáng)烈奪取或喪失電子以成為配對電子的趨向。（2）堿基類似物：一類與DNA正常堿基結(jié)構(gòu)類似的化合物，在DNA復(fù)制時取代正常堿基摻入并與互補鏈堿基配對，從而引起堿基對的置換。（3）堿基修飾物：一類通過對DNA堿基的某些基團(tuán)的修飾，改變其配對性質(zhì)，進(jìn)而改變DNA結(jié)構(gòu)的化合物。①脫氨基劑（亞硝酸）②其它類（羥胺（HA）還原劑，專一性的與胞嘧啶作用）③烷化劑對DNA的損傷

烷化劑是一類親電子的化合物，很容易與生物體中大分子的親核位點起反應(yīng)。烷化劑的作用可使DNA發(fā)生各種類型的損傷。甲基硫酸乙酯（EMS）（4）嵌入性染料包括溴化乙錠、吖啶橙等，可以直接插入到DNA堿基對中，可導(dǎo)致堿基間的距離撐大一倍，極易造成DNA兩條鏈的錯位，而在DNA復(fù)制過程中引起核苷酸缺失、移碼或插入。DNA損傷（突變）的類型點突變(pointmutation)

：又稱錯配，指DNA上單一堿基的變異，分為轉(zhuǎn)換和顛換兩種形式。移碼突變（frameshiftmutation）：指DNA片段中某一位點插入插入或丟失一個或幾個（非3的倍數(shù)）堿基對時，造成插入或丟失位點以后的一系列編碼順序發(fā)生錯位的一種突變。引起該位點以后的遺傳信息出現(xiàn)異常重排和/或重組：DNA分子內(nèi)較大片段的交換5’-G-C-A-G-U-A-C-A-U-G-U-C-3’丙氨酸纈氨酸組氨酸纈氨酸5’-G-A-G-U-A-C-A-U-G-U-C-3’谷氨酸酪氨酸蛋氨酸絲氨酸第三節(jié)DNA修復(fù)復(fù)制修復(fù)：校正DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的堿基錯誤連接尿嘧啶糖基酶系統(tǒng)：切除進(jìn)入DNA分子的尿嘧啶核苷酸錯配修復(fù)：修復(fù)DNA堿基錯配、增強(qiáng)DNA復(fù)制忠實性、維持基因組穩(wěn)定性和降低自發(fā)突變無嘌呤（AP）修復(fù)：AP內(nèi)切酶去除DNA中無堿基核糖損傷修復(fù)光復(fù)活修復(fù)甲基轉(zhuǎn)移酶切除修復(fù)：堿基切除修復(fù)、核苷切除修復(fù)復(fù)制后修復(fù)

(postreplicationrepair)大腸桿菌的重組修復(fù)系統(tǒng)SOS修復(fù)：DNA分子受損傷的范圍較大，在復(fù)制受到抑制時出現(xiàn)的一種應(yīng)急修復(fù)作用DirectlyUndoingDNADamage

直接修復(fù)光復(fù)活作用模型紫外線照射引發(fā)嘧啶二聚體的形成DNA光裂合酶與DNA損傷區(qū)結(jié)合酶吸收近紫外到可見光光譜范圍的光酶將嘧啶二聚體斷裂，然后與被修復(fù)的DNA解離DirectlyUndoingDNADamage

直接修復(fù)鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶將鳥嘌呤O6上的烷基轉(zhuǎn)移到自身的一個氨基酸殘基上ExcisionRepair

切除修復(fù)細(xì)菌的堿基切除修復(fù)DNA糖基化酶使受損堿基外突DNA糖基化酶切除外堿基AP內(nèi)切酶從AP5端一側(cè)切開DNADNA磷酸二酯酶去除AP位的脫氧核糖磷酸DNA聚合酶I填補空隙，同時向下合成DNA連接缺口ExcisionRepair

切除修復(fù)人類的堿基切除修復(fù)胞嘧啶發(fā)生自發(fā)脫落氨基作用，使C轉(zhuǎn)變?yōu)閁糖基化酶將尿嘧啶切除在AP位點處切斷聚合酶將C準(zhǔn)確填補，同時將磷酸切除連接酶修復(fù)缺口，DNA恢復(fù)正常不正確填補，留下一個切口APE1外切錯配T聚合酶加入正確的C20-81NucleotideExcisionRepair

核苷酸切除修復(fù)NucleotideexcisionrepairtypicallyhandlesbulkydamagethatdistortsDNAdoublehelixNER主要作用于會導(dǎo)致DNA雙螺旋發(fā)生扭曲的嚴(yán)重?fù)p傷NERinE.coli核酸切除酶在嚴(yán)重受損堿基的兩側(cè)對DNA鏈進(jìn)行切割（12nt）聚合酶I以上方鏈為模板填補核苷酸再由連接酶粘合切口NERinHuman在多種因子作用下：部分解鏈，切除突變鏈合成新的正確鏈Double-StrandBreakRepairinEukaryotesdsDNAbreaksineukaryotesareprobablymostdangerousformofDNAdamageThesearereallybrokenchromosomesIfnotrepairedleadt