胰蛋白酶的制備

、豬胰蛋白酶制備（一） 豬胰蛋白酶原的提取豬胰臟1.0Kg（新鮮的或殺后立即冷藏的），除去脂肪和結(jié)締組織后，絞碎。加入2倍體積預(yù)冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10?15°C攪拌提取24小時，四層紗布過濾得乳白色濾液，用2.5MH2SO4調(diào)pH至2.5?3.0,放置3?4小時后用折迭濾紙過濾得黃色透明濾液（約1.5升）。加入固體硫酸銨（予先研細(xì)），使溶液達(dá)0.75飽和度（每升濾液加492克）放置過夜后抽濾（擠壓干），得豬胰蛋白酶原粗制品。（二） 胰蛋白酶原激活向胰蛋白酶原粗制品濾餅分次加入10倍體積（按餅重計）冷的蒸餾水，使濾餅溶解，得胰蛋白酶原溶液。將研細(xì)的固體無水氯化鈣慢慢加入酶原溶液中（濾餅中硫酸銨的含量按餅重的四分之一計），使Ca2+與SO42-結(jié)合后，邊加邊攪拌均勻，邊加邊攪拌，使溶液中最終仍含有0.1MCaCl2。用5MNaOH調(diào)pH至8.0，加入極少量豬胰蛋白酶（約2-5mg）輕輕攪拌，于室溫下活化8?10小時，（2?3小時取樣一次，并用0.001MHCl稀釋），測定酶活性增加的情況。活化完成（比活約3500?4000BAEE單位）后，用2.5MH2SO4調(diào)pH至2.5?3.0，抽濾除去CaSO4沉淀。（三）胰蛋白酶的分離將已激活的胰蛋白酶溶液按242克/升加入細(xì)粉狀固體硫酸銨，使溶液達(dá)到0.4飽和度，放置數(shù)小時后，抽濾，棄去濾餅。濾液按250克/升加入研細(xì)的硫酸銨，使溶液飽度達(dá)到0.75，放置數(shù)小時，抽濾，棄去濾液。（四） 胰蛋白酶的結(jié)晶將上述胰蛋白酶濾餅（粗胰蛋白酶）溶解后進(jìn)行結(jié)晶：按每克濾餅溶于1.0mlpH9.0的0.4M硼酸緩沖液的量計加入緩沖液，小心攪拌溶解。用2MNaOH調(diào)pH至8.0，注意要小心調(diào)節(jié)，偏酸不易結(jié)晶，偏堿易失活，存放于冰箱。3.放置數(shù)小時后，應(yīng)出現(xiàn)大量絮狀物，溶液逐漸變稠呈膠態(tài)，再加入總體積的1/4?1/5的pH8.0的0.2M硼酸緩沖液，使膠態(tài)分散，必要時加入少許胰蛋白酶晶體。4.放置2?5天可得到大量胰蛋白酶結(jié)晶，待結(jié)晶析出完全時，抽濾，母液回收。（五） 胰蛋白酶的重結(jié)晶將第一次結(jié)晶的胰蛋白酶產(chǎn)物進(jìn)行重結(jié)晶：用約1倍的0.025MHCl，使上述結(jié)晶分散，加入約1.0?1.5倍體積的pH9.0的0.8M硼酸緩沖液，至結(jié)晶酶全部溶解，取樣后，用2MNaOH調(diào)溶液pH至8.0（準(zhǔn)確）（體積過大，很難結(jié)晶），冰箱放置1?2天，可將大量結(jié)晶抽濾得第二次結(jié)晶產(chǎn)物（母液回收），冰凍干燥后得重結(jié)晶的豬胰蛋白酶。二、胰蛋白酶活性的測定以苯甲酰L—精氨酸乙酯（英文縮寫為BAEE）為底物，用紫外吸收法進(jìn)行測定。苯甲酰L—精氨酸乙酯在波長253nm下的紫外吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于苯甲酰L一精氨酸（英文縮寫為BA）。在胰蛋白酶的催化下，隨著酯鍵的水解，苯甲酰L—精氨酸逐漸增多，反應(yīng)體系的紫外吸收宜隨之相應(yīng)增加。取2個光程為1厘米的帶蓋石英比色杯，分別加入25。。予熱過的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml0.001mol/LHCl，作為空白，校正儀器的253nm處光吸收零點。再在另一比色杯中加入0.2ml待測酶液（用量一般為10微克結(jié)晶的胰蛋白酶），立即混勻并記時，每半分鐘讀數(shù)一次，共讀3~4分鐘?？刂艱A253/min在0.05~0.100左右為宜。繪制酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線，從曲線上求出反應(yīng)起始點吸光度隨時間的變化率（即初速度）DA253/min。胰蛋白酶活力單位的定義規(guī)定為：以BAEE為底物反應(yīng)液pH8.0，25°C，反應(yīng)體積3.0ml，光徑1厘米的條件下，測定DA253,每分鐘使DA253增加0.001，反應(yīng)液中所加入的酶量為一BAEE單位。mm x稀釋倍數(shù)胰蛋白酶溶液的活力單位（BAEE單位/mL）=°?°°*酶液加入體積 酶液活力 胰蛋白酶比活力（BAEE單位/mg）=胰酶派度（幽M初）區(qū)酶液加入體積注意事項（1） 胰臟必需是剛屠宰的新鮮組織或立即低溫存放的，否則可能因組織自溶而導(dǎo)致實驗失敗。（2） 在室溫14?20C條件下8?12小時可激活完全，激活時間過長，因酶本身自溶而會使比活降低，比活性達(dá)到“3000?4000BAEE單位/mg蛋白”時即可停止激活。（3） 要想獲得胰蛋白酶結(jié)晶，在進(jìn)行結(jié)晶時應(yīng)十分細(xì)心地按規(guī)定條件操作，切勿粗心大意，前幾步的分離純化效果愈好，則培養(yǎng)結(jié)晶也較容易，因此每一步操作都要嚴(yán)格。酶蛋白溶液過稀難形成結(jié)晶，過濃則易形成無定形沉淀析出，因此，必需恰到好處，一般來說待結(jié)晶的