第十二章色譜分離

第十二章色譜分離一、色譜分離概述色譜分離：又稱色層分離或?qū)游龇蛛x，在分析檢測(cè)中則常稱為色譜分析，他是一種物理的分離方法。原理：利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在固定相和流動(dòng)相中，當(dāng)多組分混合物隨流動(dòng)相流動(dòng)時(shí)，由于各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別，而以不同的速率移動(dòng)，使之分離。二、色譜分離分類按分離機(jī)理不同分為五大類

1、吸附色譜

2、分配色譜

3、離子交換色譜

4、凝膠色譜

5、親和色譜1、吸附色譜吸附色譜

Adsorptionchromatography，AC是指混合物隨流動(dòng)相通過固定相（吸附劑）時(shí)，由于固定相對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物分離的方法。

吸附作用力可以是物理吸附作用，也可以是化學(xué)吸附作用。物理吸附的特點(diǎn)是選擇性低，吸附速度較快，吸附過程可逆；化學(xué)吸附的特點(diǎn)是有一定選擇性，吸附速度較慢，不易解吸。物理吸附和化學(xué)吸附可以同時(shí)發(fā)生，在一定條件下也可以互相轉(zhuǎn)化。1、吸附色譜吸附色譜是各種色譜分離技術(shù)中應(yīng)用最早的一類，傳統(tǒng)的吸附色譜以各種無機(jī)材料為吸附劑。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的吸附色譜技術(shù)，如疏水作用色譜，金屬螯合作用色譜和共價(jià)作用色譜等，所用吸附劑一般為有機(jī)基質(zhì)并通過化學(xué)修飾后制成，它們都有比較明確的作用機(jī)理，即疏水作用，螯合作用和共價(jià)作用2、分配色譜Distributionchromatography,DC

又稱為液液色譜，其原理是利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。

分配色譜可分為正相色譜和反相色譜。3、離子交換色譜離子交換色譜（ionexchangechromatography，IEC）是基于離子交換原理進(jìn)行的色譜分離。廣泛用于生物大分子的分離純化中。

4、親和色譜親和色譜（affinitychromatography,AFC）

是將與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相從混合物中分離目的產(chǎn)物的過程。

親和作用是特殊的吸附作用。

5、凝膠色譜凝膠色譜（gelchromatography,GC）以凝膠為固定相，是一種根據(jù)各物質(zhì)分子大小不同而進(jìn)行分離的色譜技術(shù)，因而又稱為分子篩色譜（MSC）；空間排阻色譜（SEC）。

凝膠色譜分為兩大類，凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。

二、色譜分離分類按固定相形狀不同分類

1、柱色譜分離

2、紙上色譜分離

以濾紙為載體的分配色譜，濾紙纖維能吸附25%-29%的水分，其中6%-7%以氫鍵與纖維素的羥基結(jié)合。而濾紙纖維與有機(jī)溶劑的親和力甚弱。紙上色譜分離是以濾紙纖維及其結(jié)合水為固定相，以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的?？捎糜诙ㄐ院投糠治?。二、色譜分離分類3、薄層色譜分離

將固定相在玻璃平板上鋪成薄層而進(jìn)行分離的一種分離技術(shù)。根據(jù)玻璃平板上所涂固定相的不同，又可分為多種功能色譜。薄層色譜是柱色譜和紙上色譜兩者的結(jié)合，薄層色譜分離法主要用于分析。二、色譜分離分類根據(jù)流動(dòng)相的

1、根據(jù)流動(dòng)相物態(tài)不同可分為：氣相色譜法（氣液色譜和氣固色譜）分離、液相色譜（液液色譜和液固色譜）分離和超臨界色譜分離

2、根據(jù)操作壓力不同分為：低壓色譜分離、中壓色譜分離和高壓色譜分離。

3、根據(jù)洗脫操作時(shí)展開方式不同可分為：洗脫展開法、前沿分析法和置換展開法。三、生物工業(yè)中的色譜分離

色譜和電泳是目前所知最好的兩種分離方法，其塔板數(shù)可達(dá)百萬數(shù)量級(jí)。1、色譜分離的規(guī)模

根據(jù)分離時(shí)一次進(jìn)樣量的多少，色譜分離的規(guī)模可分為如下4類：

色譜分析：＜10mg

半制備（或稱中等規(guī)模制備）：10～50mg

制備（或稱樣品制備）：0.1～10g

工業(yè)生產(chǎn)：＞20g2、色譜分離方法的選擇應(yīng)用色譜分離方法制備和生產(chǎn)生物體組成成分，包括各種初級(jí)代謝產(chǎn)物、次級(jí)代謝產(chǎn)物以及各種生物大分子，使用色譜技術(shù)來分離純化這些物質(zhì)時(shí)常根據(jù)如下幾個(gè)方面來選擇不同的色譜分離方法。

①目的產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)特性、及分子量的大??；

②主要雜質(zhì)，特別是分子結(jié)構(gòu)、大小和理化特性與目的產(chǎn)物相近的雜質(zhì)的成分與含量；

③目的產(chǎn)物在色譜分離過程中生理活性的穩(wěn)定性。

3、分析色譜與工業(yè)色譜的比較應(yīng)用色譜技術(shù)范圍的不同分析色譜的流動(dòng)相包括氣相和液相，固定相形狀包括柱、紙和薄板，而制備和工業(yè)色譜主要是采用以液相為流動(dòng)相的柱色譜。

操作上的不同

在分析色譜中，進(jìn)樣量愈小愈好，因此出現(xiàn)了當(dāng)今的微型毛細(xì)管柱色譜；在制備和工業(yè)色譜中，則要求進(jìn)樣量越多越好，色譜柱也應(yīng)適當(dāng)大些，從而出現(xiàn)了大直徑的徑向色譜柱。3、分析色譜與工業(yè)色譜的比較色譜分離理論上的不同1）理論塔板數(shù)的不同

對(duì)于生物大分子而言，分離的好壞往往與理論塔板數(shù)沒有明顯的關(guān)系。2)分配系數(shù)的不同

線性色譜與非線性色譜3)樣品保留值與峰高的不同

制備色譜和工業(yè)色譜中，不能根據(jù)保留值定性，色譜的峰高也不能作為制備色譜和工業(yè)色譜定量分析的指標(biāo)。

三、柱色譜分離法層析劑——用于色譜分離技術(shù)中的固定相或分離介質(zhì)，總稱為層析劑。

基質(zhì)材料表面活性官能團(tuán)生物產(chǎn)品所需層析劑應(yīng)具有的特性1）不溶于流動(dòng)相，具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度；能經(jīng)受生物降解作用；能耐受各種環(huán)境。2）具有較大的表面積和孔隙度，粒度、孔徑均勻。3）有較高的回收率和負(fù)載量。4）有的需要有較好的熱穩(wěn)定性。5）無毒，不引起產(chǎn)物的變性或失活，價(jià)格合理三、柱色譜分離法1、常用層析劑

無機(jī)基質(zhì)層析劑：硅膠、氧化鋁、活性炭、多孔玻璃、羥基磷石灰；

有機(jī)基質(zhì)層析劑：瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、聚乙烯醇。2、裝置2、裝置1）流動(dòng)相供給部分

一般包括貯液罐、高壓泵、液體混合室及梯度洗脫系統(tǒng)。2）檢測(cè)器

根據(jù)組分的物理化學(xué)特性，例如紫外吸收、熒光性、電導(dǎo)率、旋光性以及可見光光密度等，進(jìn)行在線檢測(cè)。3）流分收集器

是將柱后流出的液體，定時(shí)定量分別收集的儀器。有滴數(shù)式，容量式，質(zhì)量式等若干種。2、裝置4）色譜柱色譜柱通常用玻璃柱，工業(yè)上大型色譜柱可用金屬制造。為保護(hù)色譜柱常在其柱前加一層多孔尼龍圓片或保持一段緩沖液液層；柱底部有支撐固定相的物質(zhì)，可以是玻璃棉、砂芯玻璃板或是用鋪有濾布的橡皮塞。根據(jù)需要可用在色譜柱外加夾套，有的柱需要進(jìn)行消毒處理。設(shè)計(jì)色譜柱長(zhǎng)時(shí)需要注意的：1）柱的最小長(zhǎng)度取決于所要達(dá)到的分離程度，目的產(chǎn)物的分離程度高，分辨率低，需要較長(zhǎng)的色譜柱。2）較大的柱直徑需要較長(zhǎng)色譜柱。3）柱越長(zhǎng)，l/d比值越大，就越難得到均勻的填裝，直徑大時(shí)，l可長(zhǎng)些。色譜柱的填裝層析劑顆粒均勻度不一致，會(huì)影響其有效結(jié)合位點(diǎn)的分布不均勻。層析劑分批加入影響柱內(nèi)流速的均勻度。裝柱時(shí)：層析劑+緩沖液一次性加完；同時(shí)柱底部出口閥打開；傾倒完漿料，再用緩沖液流過色譜柱，平衡色譜柱。3、操作技術(shù)3、操作技術(shù)

（一）樣品溶解與進(jìn)樣方法對(duì)粗顆粒需進(jìn)行過濾和離心沉降法除去；增加蛋白質(zhì)溶解度的常用試劑：甲酸、尿素、十二烷基硫酸鈉、三氯醋酸等；溶劑性質(zhì)必須適應(yīng)所用固定相如：

反相色譜中，溶解樣品溶劑極性必須大于流動(dòng)相；

吸附色譜與之相反；

疏水作用色譜，溶劑的離子強(qiáng)度大于或等于流動(dòng)相的離子強(qiáng)度(二)展開操作1、洗脫展開法2、前沿分析法3、置換展開法1、展開操作法操作時(shí)，先將樣品輸入色譜柱，隨即加入一種不與固定相發(fā)生作用的溶劑或幾種溶劑的混合物作為流動(dòng)相沖洗。以柱內(nèi)流出體積對(duì)溶質(zhì)濃度作圖如下圖，通過該圖可以對(duì)溶質(zhì)作定量分析。根據(jù)洗過過程中洗脫劑的組成是否改變，洗脫展開法可分為：恒定洗脫法、逐次洗脫法、梯度洗脫法。2、前沿分析法此法樣品溶液本身起流動(dòng)相的作用。當(dāng)溶液通過固定相，不同組分與固定相作用力不同而產(chǎn)生不同的移動(dòng)速率。以溶質(zhì)濃度對(duì)流出液體積作圖，分離結(jié)果為一階梯形線。該法不能將樣品中每個(gè)組分都分離回收，而只能得到其中作用力最弱的純物質(zhì)。適合產(chǎn)品的精制中除去痕量雜質(zhì)。3、置換展開法又名頂替法或取代法。該法樣品輸入色譜柱后，用一種與固定相作用力極強(qiáng)的置換劑作為流動(dòng)相，去替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。3、置換展開法置換劑要求：1)吸附等溫線是凸形，且吸附系數(shù)要大于樣品中的任何組分；2）在流動(dòng)相中易溶；3）不與樣品及流動(dòng)相發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)；4)易從固定相表面洗脫下來。四、凝膠色譜凝膠層析的基本原理

凝膠層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對(duì)混合物中各組份按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)，又稱為分子篩。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，會(huì)被全部排阻在凝膠顆粒之外，即全排阻；兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能分開；它們下行速度快。

分子直徑比凝膠最小孔隙直徑小的，能進(jìn)入凝膠顆粒的全部孔隙即使大小不同也不能分開；它們的下行速度慢。鑒于上述原理，凝膠層析可用于重組蛋白溶液脫鹽、分子量測(cè)定以及分離純化。四、凝膠色譜四、凝膠色譜1、凝膠層析原理凝膠層析的幾種原理1、平衡排阻原理2、擴(kuò)散分離理論3、流動(dòng)分離理論分離過程4、凝膠層析的特點(diǎn)5、凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)1）葡聚糖凝膠

葡聚糖凝膠的種類有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50即表示每克干凝膠的吸水量為5.0毫升,葡聚糖凝膠對(duì)堿比較穩(wěn)定，在酸性環(huán)境中其糖苷鍵易水解濕態(tài)的葡聚糖可加熱到110℃，干的則能耐受120℃高溫。葡聚糖凝膠（Sephadex

）

SephadexLH是羥丙基化的Sephadex，這類層析介質(zhì)的流動(dòng)相既可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機(jī)溶劑，因此適用于非水溶性溶質(zhì)的凝膠過濾。葡聚糖凝膠（Sephadex）葡聚糖凝膠編號(hào)與性能的關(guān)系修飾葡聚糖凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是一種以丙烯酰胺為單位由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成的人工合成凝膠，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠，交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品名為Bio-Gel，型號(hào)從P-2至P-300共10種（數(shù)字X1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度）聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)

瓊脂糖凝膠：是由瓊脂中分離出來的天然凝膠，常見的有Sepharose（Sepharose2B、4B、6B，數(shù)字代表干膠的百分比）和Bio-Gel-A等（Bio-Gel-A0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，數(shù)字X106代表排阻限度）。瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠

當(dāng)溫度高于50℃時(shí)瓊脂糖凝膠便融化，只能在較低的溫度下使用。瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠，因而適合于分離分子量較大的生物大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)和DNA）。SepharoseCL是二溴丙醇交聯(lián)的瓊脂糖，其孔徑大小和分離范圍與普通瓊脂糖一樣，但熱和化學(xué)穩(wěn)定性增加，能高溫消毒。瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠特點(diǎn)五、親和純化技術(shù)親和純化技術(shù)3、葡聚糖凝膠

包括甲殼素和殼聚糖親和配基（一）糖類載體的活化與偶聯(lián)

影響親和吸附力的幾個(gè)因素配基與間隔臂的連接親和層析的吸附和洗脫離子效應(yīng)疏水基團(tuán)復(fù)合親和力（二）親和層析的洗脫非專業(yè)性洗脫A重組蛋白分離純化方法選擇的基因原則

外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化針對(duì)不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略針對(duì)不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用合適分離純化介質(zhì)的選擇分離純化過程的規(guī)模化針對(duì)不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略

采用分泌型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應(yīng)在純化之前采用沉淀或超濾等方法先進(jìn)行濃縮處理

采用包涵體型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，應(yīng)先離心回收包涵體

采用融合型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，一般是胞內(nèi)可溶性的，擬首先選用親和層析進(jìn)行純化；表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的間隙中的蛋白質(zhì)，應(yīng)用低濃度的溶菌酶處理，然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白。針對(duì)不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型

等電點(diǎn)處于極端區(qū)域（pI≤5或pI≥8）的重組蛋白應(yīng)首選離子交換法進(jìn)行分離，這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白；重組蛋白特異性的配體、底物、抗體、糖鏈等都是首選親和層析，純化方法的重要條件，原則是它們與目標(biāo)蛋白之間的解離常數(shù)應(yīng)在合適的范圍內(nèi)（10-8-10-4mol/L）；

針對(duì)不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型疏水層析和反相層析是根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性差異進(jìn)行分離的；凝膠過濾層析是根據(jù)蛋白的分子量和體積差異進(jìn)行分離的。徑向?qū)游鍪墙陙戆l(fā)展起來的集層析分離和膜分離于一體的一種復(fù)合技術(shù)，在流量、負(fù)荷量等參數(shù)方面顯示出極大的優(yōu)越性。多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用在進(jìn)行重組蛋白的純化時(shí)，通常需要綜合使用多種技術(shù)，一般來說，在選擇分離純化方法時(shí)應(yīng)遵循下列原則：應(yīng)選擇不同分離純化機(jī)理的方法聯(lián)合使用應(yīng)首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法應(yīng)盡量選擇高效的分離方法應(yīng)將最費(fèi)時(shí)、成本最高的分離純化方法安排在最后階段合適分離純化介質(zhì)的選擇常用的蛋白質(zhì)分離純化介質(zhì)有Sephadex和Seperose。理想的分離純化介質(zhì)應(yīng)具有下列性質(zhì)對(duì)目標(biāo)蛋白具有較高的分離效率對(duì)目標(biāo)蛋白不會(huì)造成變性化學(xué)性能和機(jī)械性能穩(wěn)定，重復(fù)性好價(jià)格低廉分離純化過程的規(guī)?；?/p>

蛋白質(zhì)分離純化的實(shí)驗(yàn)室工藝、技術(shù)、方法在大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化過程未必合適，如：實(shí)驗(yàn)室方法在工程上可能難以實(shí)現(xiàn)（超聲波破細(xì)胞壁）實(shí)驗(yàn)室方法在大規(guī)模生產(chǎn)中可能成本過高（超速離心）

因此，在很多情況下，實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)路線不等于生產(chǎn)工藝。B離子交換層析外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化離子交換層析的基本原理離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換層析的基本操作離子交換介質(zhì)的選擇原則離子交換層析的基本原理

離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以特定的含離子溶液為流動(dòng)相，利用離子交換劑對(duì)待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)

離子交換劑亦稱離子交換介質(zhì)，通常是一種不溶性高分子化合物如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等；離子交換劑中所含的可解離基團(tuán)在水溶液中能與溶液中的其他陽離子或陰離子起交換作用；如果有兩種以上的成分被吸附在離子交換劑上，則在用洗脫液洗脫時(shí)，各成分被洗脫的可能性取決于各自反應(yīng)的平衡常數(shù)；

離子交換劑的基本性能離子交換劑的基本性能吸附在離子交換劑上的蛋白質(zhì)可通過改變pH使吸附的蛋白質(zhì)失去電荷而解離下來；不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間形成離子鍵數(shù)目不同，即親和力大小有差異，因此只要選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件便可將混合物中的成分逐個(gè)洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。離子交換介質(zhì)的選擇原則12346789105pH+-蛋白質(zhì)凈電荷等電點(diǎn)吸附陰離子交換劑吸附陽離子交換劑pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）對(duì)pI=5的某酸性蛋白質(zhì)在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)，應(yīng)首選DEAE纖維素；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時(shí)在pH3.5-4.5的范圍內(nèi)，應(yīng)首選CM纖維素當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陽離子時(shí)離子交換層析的基本操作層析柱平衡平衡緩沖液的用量至少為柱體積的2

倍平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速平衡終點(diǎn)以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、pH值與緩沖液一致為準(zhǔn)，其中pH值最重要離子交換層析的基本操作樣品進(jìn)柱為了達(dá)到滿意的分離效果，進(jìn)樣量一般為介質(zhì)交換容量的10%～20%為了避免進(jìn)樣溶液中的離子強(qiáng)度過高，樣品濃度不宜太高交換容量：離子交換劑中全部可交換的離子或功能基團(tuán)的總數(shù)離子交換層析的基本操作樣品洗脫恒定洗脫階段洗脫梯度洗脫102030405060708090分子濃度離子強(qiáng)度pH值C凝膠層析外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化凝膠層析的基本原理凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)凝膠層析的基本操作凝膠介質(zhì)的選用原則凝膠介質(zhì)的選用原則

將樣品中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分開，稱為組別分離，其分離策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。

組別分離一般選用SephadexG-25或G-50；

對(duì)于小肽和低分子量的物質(zhì)（分子量范圍1000-5000）的脫鹽可選用SephadexG-10、G-15、Bio-GelP-2或P-4組別分離凝膠介質(zhì)的選用原則

將樣品中一些分子量比較接近的物質(zhì)分開，這種分離叫分級(jí)分離。該策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。分級(jí)分離一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠。在層析過程中，樣品中各組份均能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，但由于深入凝膠空隙程度上的差異，最后得到分離。分級(jí)分離凝膠層析的基本操作平衡溶液的流速應(yīng)低于層析時(shí)需要的流速注意凝膠的斷層和氣泡層析柱平衡操作壓控制平衡和洗脫時(shí)應(yīng)維持流速恒定恒定的操作壓是恒流的先決條件凝膠層析的基本操作上柱樣品溶液的體積根據(jù)分離要求來確定：進(jìn)樣體積進(jìn)行組別分離時(shí)，樣品溶液最大可為柱體積