刺五加皂甙對(duì)青霉素致癇大鼠海馬長時(shí)程增強(qiáng)的影響

刺五加皂甙對(duì)青霉素致癇大鼠海馬長時(shí)程增強(qiáng)的影響

癲癇的出現(xiàn)與細(xì)胞外液鉀離子濃度異常增加和大量鈣離子內(nèi)流密切相關(guān)，并常伴有學(xué)習(xí)記憶能力的下降。刺五加皂甙(acantbepanaxsenticsussaponin,ASS)具有阻止鈣離子通道、清除自由基等藥理活性,對(duì)腦有保護(hù)作用,并且對(duì)大鼠海馬腦片長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)有明顯促進(jìn)作用,而ASS對(duì)青霉素致癇大鼠海馬LTP的影響未見報(bào)道。海馬的LTP是突觸水平研究學(xué)習(xí)和記憶的模型,故實(shí)驗(yàn)研究ASS對(duì)青霉素致癇大鼠海馬LTP的影響,為改善癲癇特別是青霉素腦病患者認(rèn)知能力提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1ass海水淡化注射用青霉素鈉(批號(hào):08019579,華北制藥廠生產(chǎn));ASS(由吉林大學(xué)有機(jī)化學(xué)教研室提取,淡黃色粉末狀);氨基甲酸乙酯(批號(hào):20080414,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。1.2立體定向器多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)RM6240B型(成都儀器廠生產(chǎn));江灣I-C型立體定向器(第二軍醫(yī)大學(xué)器材處生產(chǎn));絕緣雙極同芯電極(自制,尖端直徑0.1mm,阻抗0.5～1.0M);不銹鋼注射套管(內(nèi)徑0.5mm)。1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及密度雄性Sprague-Dawley大鼠45只[武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(鄂)2008-2009],體質(zhì)量200～250g,SPF級(jí)。1.4側(cè)腦室注射按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),以體質(zhì)量相近原則每組5只。各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);非NS對(duì)照組大鼠癲癇發(fā)作級(jí)別即行為學(xué)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。通過不銹鋼注射套管內(nèi)的硅膠管,側(cè)腦室微量注射不同劑量藥物或生理鹽水,2min內(nèi)緩慢注射完畢。非NS對(duì)照組腹腔注射(500±50)萬U/kg青霉素(8.00×105U/ml)誘發(fā)大鼠癲癇,24h后ASS小劑量組(6.25μg/ml,5μl)、ASS中劑量組(25μg/ml,5μl)和ASS大劑量組(100μg/ml,5μl)行側(cè)腦室注射;ASS小劑量組(25mg/kg)、ASS大劑量組(100mg/kg)行腹腔注射,模型組同樣途徑注射同體積的生理鹽水,NS對(duì)照組也均以同體積的生理鹽水代替。1.5記錄小鼠癲癇的程度給青霉素后1h內(nèi)連續(xù)觀察大鼠的行為學(xué)改變,依據(jù)Racine標(biāo)準(zhǔn)分為0～Ⅴ級(jí)。1.6legrano大鼠腦定位圖譜腹腔注射10%烏拉坦(1ml/kg)麻醉后行常規(guī)氣管插管,將大鼠頭部固定在立體定向儀上,暴露顱骨,確定冠矢交點(diǎn),標(biāo)記CA1、CA3大致位置,打開標(biāo)記范圍顱骨,去除硬腦膜,38℃液體石蠟油保護(hù)腦組織。動(dòng)物體溫維持在38℃左右。根據(jù)Pellegrino大鼠腦定位圖譜,將記錄電極放置在CA1區(qū)(P4.0,L2.4,H2.6),刺激電極放置于CA3區(qū)(P3.0,L2.8,H3.6),側(cè)腦室注射的位置為(P0.8,L1.4,H3.6)。信號(hào)輸入生物信號(hào)處理系統(tǒng),進(jìn)行記錄、分析和儲(chǔ)存,電腦同步監(jiān)視。在CA3區(qū)給以單刺激(0.6～1.2mA,調(diào)至引起場電位最大振幅的50%左右,波寬1ms,20次/20min);20min后給予條件刺激(強(qiáng)度同前,波寬1ms,波間隔10ms,脈沖數(shù)50,4串/6s),5min后開始以同樣方式再施以單刺激,繼續(xù)觀察120min左右,并記錄CA1區(qū)群峰電位(Populationspike,PS)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后電極通電,灼燒插入點(diǎn),然后用生理鹽水和10%甲醛溶液左心室灌流取腦(普魯藍(lán)法定位)。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以xˉ±sxˉ±s表示,多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1ass濃度對(duì)ps幅度的影響單個(gè)刺激后產(chǎn)生場電位(0.206±0.161)mV,條件刺激后NS對(duì)照組PS幅度顯著增高,從35min開始PS幅度大于130%一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束;條件刺激后模型對(duì)照組PS幅度顯著降低,范圍為46%～80%,持續(xù)2h以上。ASS小劑量組從條件刺激后5min開始PS幅度增大,90min后幅度大于130%一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束;中劑量組從5min后PS幅度增大,25min后幅度大于160%一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束;大劑量組從40min開始PS幅度大于100%一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。ASS小﹑中﹑大劑量組條件刺激后每15分鐘統(tǒng)計(jì)的PS幅度均大于模型組;ASS中劑量組條件刺激后PS幅度比ASS小﹑大劑量組都大(P<0.01);ASS小﹑大劑量組條件刺激后PS幅度之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),可見ASS改善了青霉素模型組對(duì)PS的抑制作用。見表1、圖1。2.2ass小劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)開始ps的影響單個(gè)刺激后產(chǎn)生場電位(0.171±0.133)mV,條件刺激后NS對(duì)照組PS幅度顯著增高,從10min開始PS幅度大于130%一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束;條件刺激后模型對(duì)照組PS幅度顯著降低,為35.34%～59.16%。ASS小劑量組條件刺激后PS幅度為70.33%～98.68%,大劑量組為83.1%～102.74%,均顯著高于模型對(duì)照組(P<0.01)ASS小、大劑量組無明顯差異(P>0.05)。見表2、圖2。3ass改善了癲癇大鼠的ps從Bliss首次描述長時(shí)程增強(qiáng)現(xiàn)象(LTP)、單個(gè)細(xì)胞研究,到如今的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)編碼表達(dá)模型都表明:雖然海馬細(xì)胞興奮依賴的突觸可塑性在理論上使人佩服的同時(shí)不易用實(shí)踐證明,但海馬LTP已成為反映神經(jīng)元學(xué)習(xí)記憶過程的一個(gè)重要的客觀指標(biāo),LTP表現(xiàn)為條件刺激后PS幅度,幅度越大則神經(jīng)元越活躍,整個(gè)海馬結(jié)構(gòu)發(fā)揮的記憶功效也越強(qiáng)。側(cè)腦室注射ASS后對(duì)青霉素致癇大鼠的PS抑制有明顯的改善效果,且小﹑中劑量有量效關(guān)系,但大劑量的作用低于中劑量。已知癇樣放電與細(xì)胞外液鉀離子濃度異常增高及大量鈣離子內(nèi)流有密切關(guān)系,而ASS可以阻止鈣離子通道,清除自由基、提高腦內(nèi)SOD活性的作用,故推測ASS對(duì)PS幅度的改善與阻止鈣離子通道等有關(guān),但其大劑量作用低于中劑量的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。腹腔注射實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示腹腔注射ASS對(duì)青霉素致癇大鼠的PS抑制有改善效果,但兩個(gè)劑量間無劑量反應(yīng)關(guān)系。這種無差異可能是因?yàn)锳SS經(jīng)腹腔注射透過血腦屏障需要更長的時(shí)間,或其透過的量存在一個(gè)最大值,且這個(gè)最大值在25mg/kg之下,以上推論尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)提示青霉素致癇后大鼠海馬LTP轉(zhuǎn)變