柴胡的薄層色譜鑒別研究

柴胡的薄層色譜鑒別研究

柴胡，真名胡，是波形科植物柴胡d.或窄葉柴胡b.unifoliumscor世代gilfoliumwd的干燥根。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣、清膽截瘧的功效。藥理研究表明,柴胡具有解熱、抗病毒、降血脂、保肝、抗炎、抗腫瘤等作用。柴胡的化學(xué)成分復(fù)雜,主要含有皂苷、黃酮、揮發(fā)油、香豆素、甾醇、多糖等成分。不同產(chǎn)地、不同采收時間的柴胡質(zhì)量相差較大,為了評價柴胡的質(zhì)量優(yōu)劣,本文從薄層鑒別、含量測定兩方面對15個批次的柴胡樣品進行研究,初步建立質(zhì)量評價方法,為其規(guī)范使用,作為制劑原料的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。1材料表面1.1聲波清理器、標準液相色譜儀SartoriusBS110S精密天平;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清理器;RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;WFH-203B三用紫外分析儀;UVmini-1240紫外分光光度計;島津LC-10ATvpPlus高效液相色譜儀,包括二元泵、柱溫箱;Phenomenex預(yù)柱。1.2藥品、試劑與儀器柴胡皂苷a對照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批號:11052402),柴胡皂苷d對照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批號:12020301);柴胡對照藥材(中國藥品生物制品檢定所,批號:120992-201108);德國Merck公司色譜乙腈;Merck硅膠G薄層板;其他試劑均為分析純。1.3張丹雁的鑒定柴胡藥材由人工在河北、山東、山西當?shù)夭杉?經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)教授張丹雁鑒定為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.的干燥根(產(chǎn)地及來源見表1)。對15批柴胡藥材進行總皂苷及柴胡皂苷a、d的含量測定。2方法和結(jié)果2.1包裝侵權(quán)2.1.1供試品溶液配制取本品粉末0.5g,加甲醇20ml,超聲處理10min,濾過,濾液濃縮至5ml,作為供試品溶液。吸取上述三種溶液各5μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液,在60℃加熱至斑點顯色清晰,分別置日光和紫外光燈(365nm)下檢視。2.1.2經(jīng)過優(yōu)化的薄膜識別2.2胡蘿卜干總皂苷溶液的制備按2.1.2項下供試品溶液的制備方法制備柴胡總皂苷溶液。精密稱取柴胡皂苷d對照品適量,加甲醇制成每1ml含0.814mg的溶液,即得。2.2.3吸光度的測定精密吸取供試品溶液與對照品溶液各0.2ml,分別加入1%對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1ml,70℃溫?zé)?0min,取出放冷,加入磷酸4.0ml,70℃反應(yīng)30min,放冷,在波長545nm處分別測定供試品溶液與對照品溶液的吸光度值。2.2.5精密度測試2.2.6穩(wěn)定性測定取12號樣品制成的供試品溶液,按2.2.3項下分別于配制后0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h進行測定,測定吸光度平均值為0.656,RSD為1.16%,表明本品在2.5h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。2.2.7重現(xiàn)性的測定取12號樣品,平行6份,按供試品溶液制備方法和測定方法項下操作,測定吸光度平均值為0.635,RSD為2.06%,表明本法具有良好的重現(xiàn)性。2.2.8加樣回收率測定精密稱定已知含量的12號樣品6份,分別精密加入一定量的柴胡皂苷d對照品溶液,按供試品溶液制備方法和測定方法項下操作,測得平均加樣回收率為99.73%,RSD為2.07%,表明總皂苷回收率良好。結(jié)果見表2。2.2.9測定總皂苷含量分別取15批樣品粉末(過四號篩),按2.2.1項下方法制備供試品溶液,依2.2.3項下測定方法進行測定,記錄吸光度值,并計算柴胡藥材中總皂苷的含量,結(jié)果見表3。2.3柴胡a、d含量的測定2.3.1流動相、柱溫度色譜柱:AgilentZORBAXEclipseXDB-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:乙腈-水;流速:1.0ml·min-1;檢測波長:210nm;柱溫:30℃;梯度洗脫:0~5min:25%~90%(A);50~55min:90%(A)。在此色譜條件下,樣品分離良好(見圖2)。2.3.2超聲法提取濃氨試液取本品粉末(過四號篩)約0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25ml,密塞,30℃水溫超聲處理30min,濾過,用甲醇20ml分2次洗滌容器及藥渣,洗液與濾液合并,回收溶劑至干。殘渣加甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。2.3.3對照溶液的制備精密稱取柴胡皂苷a1.29mg、柴胡皂苷d1.19mg,分別置5ml量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。2.3.4標準曲線的繪制分別精密吸取柴胡皂苷a、d對照品溶液0.1ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml,分別加甲醇定容至刻度,搖勻。按2.3.1項下色譜條件進樣10μL進行測定,記錄峰面積值。以柴胡皂苷a、d的進樣量X(μg)為橫坐標,峰面積值Y為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程為:柴胡皂苷a:Y=142840X-6110.6,r=0.9996,柴胡皂苷a在0.258~2.580μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;柴胡皂苷d:Y=170759X-1637.5,r=0.9997,柴胡皂苷d在0.238~2.380μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.3.5儀器精密度試驗精密吸取柴胡皂苷d對照品溶液10μL,重復(fù)進樣5次,測定峰面積平均值為400858.8,柴胡皂苷d的RSD為1.64%,表明儀器精密度良好。2.3.6穩(wěn)定性試驗的結(jié)果精密稱取12號樣品制成供試品溶液,按上述色譜條件操作,分別于0h、2h、4h、6h、12h、24h進樣測定,結(jié)果表明,柴胡皂苷a的RSD為1.82%,柴胡皂苷d的RSD為1.58%,表明本品24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.3.7方法的rsd和重現(xiàn)性精密稱取12號樣品6份,分別按供試品溶液制備方法制成樣品溶液,按上述色譜條件操作,結(jié)果表明,柴胡皂苷a的RSD為1.18%,柴胡皂苷d的RSD為1.03%,表明方法重現(xiàn)性良好。2.3.8加樣回收率試驗精密稱定已知含量的12號樣品6份,分別精密加入一定量的柴胡皂苷a、d對照品溶液,分別按供試品溶液制備方法制成樣品溶液,按上述色譜條件操作,計算回收率,柴胡皂苷a的平均回收率為100.40%,RSD為1.72%;柴胡皂苷d的平均回收率為99.70%,RSD為1.50%。2.3.9供試品溶液測定分別取15批樣品粉末(過四號篩),按2.3.2項下方法制備供試品溶液,依2.3.1項下色譜條件進行測定,記錄柴胡皂苷a、d的峰面積,并計算其含量,結(jié)果見表3。3測定柴胡皂苷a、d的含量3.1柴胡中皂苷類成分主要有柴胡皂苷a、d,其含量較高,故選柴胡皂苷a、d作為對照,建立薄層鑒別。參考藥典柴胡薄層鑒別條件,選用硅膠G薄層板,并比較了7個不同的展開系統(tǒng):(1)乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)(藥典);(2)乙酸乙酯-乙醇-水(12∶2∶1);(3)氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶20∶10)(下層);(4)氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)(下層);(5)氯仿-甲醇-水(30∶10∶1);(6)氯仿-甲醇-甲酸(14∶4∶1);(7)氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)(下層)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)第(7)種系統(tǒng)效果最為理想,該展開系統(tǒng)下柴胡皂苷a、d能明顯分開,且斑點信息量最大,最清晰,且圓整度很好。所以,選擇(7)為展開劑。3.2總皂苷含量測定方法的選擇:比較香草醛-高氯酸顯色法和對二甲氨基苯甲醛-磷酸顯色法發(fā)現(xiàn),香草醛-高氯酸顯色法下供試品與對照品在相同波長下沒有共同吸收峰,而對二甲氨基苯甲醛-磷酸顯色法下供試品與對照品在相同波長(545nm)下有共同吸收峰,且吸光度值正常,故選擇對二甲氨基苯甲醛-磷酸顯色法。3.3測定結(jié)果可發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地、不同采收時間的柴胡中總皂苷及柴胡皂苷a、d的含量相差比較大,柴胡皂苷a、d高者,總皂苷不一定高,反之亦然。因此,應(yīng)綜合考察三者的含量評價柴胡的質(zhì)量,只有三者均高才是質(zhì)量最佳。本實驗采用高效液相色譜法和紫外分光光度法對柴胡中柴胡皂苷a、d和總皂苷的含量進行研究,建立了各自的測定方法,其方法穩(wěn)定可靠、簡便易行快速,結(jié)果準確。取柴胡樣品粉末(過四號篩)0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別加入5%濃氨水試液的甲醇溶液25ml,密塞,30℃水溫超聲處理30min,濾過,用甲醇分2次洗滌容器及藥渣,洗液與濾液合并,回收溶劑至干。殘渣加少量水溶解,再用飽和正丁醇提取,合并正丁醇液,用水洗滌2次,每次20ml,棄去水液,回收正丁醇至干,甲醇溶解,并定容至5ml,搖勻,作為供試品溶液。另取北柴胡對照藥材0.5g,同法制成對照藥材溶液。再取柴胡皂苷a、d對照品適量,分別加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,作為對照品溶液。吸取上述供試品溶液各4μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)(10℃以下放置的下層溶液)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液,在60℃加熱至斑點顯色清晰,分別置日光和紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的黃色熒光斑點。該展開系統(tǒng)下柴胡皂苷a、d與其他斑點能明顯分開,斑點信息量大,清晰,且圓整度很好(見圖1)。2.2.1樣品溶液的制備2.2.2對照溶液的制備2.2.4柴胡皂苷d對照品線性關(guān)系的測定分別精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml至1ml容量瓶