3種免疫原對海灣鏈球菌強(qiáng)毒株nef832免疫效果的比較

3種免疫原對海灣鏈球菌強(qiáng)毒株nef832免疫效果的比較

首先，跳躍海豚是總督的特征。這是由四種情況引起的人畜共患細(xì)菌病的病原體。革蘭氏陽性感染各種水生動物，如象牙、羅非魚、鯰魚和箭頭，對水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。因此,開發(fā)安全高效的疫苗以實現(xiàn)鏈球菌病的有效防治是當(dāng)前研究的重點和熱點。目前,國內(nèi)外已報道多種形式的海豚鏈球菌疫苗,如福爾馬林滅活全菌(FKC)疫苗,胞外產(chǎn)物(ECPs)、類M蛋白亞單位疫苗,混合組分的疫苗(FKC+ECPs),菌蛻疫苗,弱毒或減毒活菌疫苗,DNA疫苗等。其中,FKC制備方便、成本低廉,常被選作疫苗成分,但其免疫保護(hù)力不理想且交叉保護(hù)效果差,使其應(yīng)用受限;FKC+ECPs成分的疫苗則能夠有效輔助羅非魚、牙鲆抵抗免疫原來源菌株及非免疫原來源菌株的侵襲。然而,針對不同免疫原所引起的魚體免疫應(yīng)答差異的研究較少,尤其缺乏對非特異性免疫的關(guān)注。魚類是較低等的脊椎動物,其特異性免疫機(jī)制還很不完善,多數(shù)硬骨魚類體內(nèi)只有1類免疫球蛋白IgM,且其抗體形成周期長、抗體滴度不高,因此非特異性免疫在魚類的免疫防御中發(fā)揮著重要作用。對魚體非特異性免疫應(yīng)答的研究可輔助評價免疫原的免疫效果,有助于對不同免疫原作用機(jī)制的了解。本文選用牙鲆為實驗動物,測定了血細(xì)胞吞噬能力及血清中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和酸性磷酸酶(ACP)的活力變化,對海豚鏈球菌強(qiáng)毒株NUF849來源的3種免疫原(FKC、ECPs及FKC+ECPs)產(chǎn)生的影響進(jìn)行比較分析,以期為篩選鏈球菌疫苗有效成分,深入了解牙鲆針對不同免疫原所產(chǎn)生的非特異性免疫應(yīng)答機(jī)制提供參考。1材料和方法1.1菌株和培養(yǎng)基健康牙鲆購自日照某養(yǎng)殖場,體質(zhì)量為(20±5)g,蓄養(yǎng)于40cm×40cm×70cm水槽內(nèi),水溫為(23±1)℃,不間斷充氣,日換水2/3,日投喂1%魚體質(zhì)量的商品化飼料。無菌取內(nèi)臟組織平板劃線、尾靜脈取血進(jìn)行抗體檢查,暫養(yǎng)7d證實牙鲆無病原感染后用于實驗。海豚鏈球菌NUF849、NUF812由NagasakiUniversity惠贈。經(jīng)預(yù)實驗測定,菌株NUF849和NUF812對實驗牙鲆的半數(shù)致死量(LD50)分別為3.7×105CFU·mL-1和1.0×106CFU·mL-1,均具較強(qiáng)毒力。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由本室保存。培養(yǎng)基為哥倫比亞血平板(海博),腦心浸液(BHI)(Difco),普通營養(yǎng)瓊脂(奧博星)。酶活試劑盒購于南京建成生物工程研究所,其他試劑均購于上海生工。1.2培養(yǎng)政策及菌株海豚鏈球菌NUF849和NUF812經(jīng)血平板28℃活化24h,轉(zhuǎn)接于BHI平板富集培養(yǎng),以0.01mol·L-1無菌磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.4)洗脫,離心(3000r/min,15min,4℃),棄上清,重復(fù)洗滌3次收集菌體,用于疫苗制備及攻毒。金黃色葡萄球菌以普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng),同法洗滌備用。以平板玻璃紙法制備海豚鏈球菌胞外產(chǎn)物?；罨缶杲臃N于BHI肉湯,28℃靜置培養(yǎng)24h;取1mL培養(yǎng)物涂布于預(yù)先鋪覆1層滅菌玻璃紙的BHI平板(直徑15cm),28℃培養(yǎng)60h;無菌PBS洗下菌苔,收集菌懸液離心(8000r/min,20min,4℃);上清經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌,超純水4℃透析后凍干,以PBS重懸,考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度后,分裝貯存于-20℃?zhèn)溆谩?.3微生物菌樣制備經(jīng)麥?zhǔn)媳葷醿x(BioMérieux)測定菌液濃度,以無菌PBS調(diào)整至109CFU·mL-1,加入福爾馬林使終濃度為0.4%,37℃振搖滅活48h。PBS洗滌細(xì)菌以去除福爾馬林。涂布平板檢測無活菌后,4℃?zhèn)溆?。制備的FKC(108CFU)、ECPs(30μg)、FKC+ECPs(FKC108CFU+ECPs30μg)分別與弗氏完全佐劑等體積混合(見表1),每種免疫原注射5尾牙鲆,正常飼養(yǎng)觀察7d以檢測其安全性。7d后受試魚均健康存活,表明免疫原安全性良好。1.4相對免疫保護(hù)率設(shè)3個免疫組與PBS對照組(見表1),每組牙鲆150尾,分別腹腔注射FKC、ECPs、FKC+ECPs3種免疫原與PBS,并以紅霉素軟膏涂抹入針處。在免疫后第42天,每組隨機(jī)取魚80尾并平分為NUF849組和NUF812組,分別腹腔注射10倍LD50(NUF849:106CFU·mL-1,NUF812:107CFU·mL-1)的菌液0.1mL進(jìn)行攻毒,然后將NUF849組和NUF812組再隨機(jī)等分為觀察組與取樣組(見表2),養(yǎng)殖條件同1.1,觀察21d,及時清除死亡魚并統(tǒng)計死亡情況,按下列公式計算相對免疫保護(hù)率(RPS):RPS(%)=(對照組死亡率-免疫組死亡率)/對照組死亡率×100%。1.5尾靜脈血樣的制備以7d為取樣間隔,于免疫后第7、14、21、28、35、42天及攻毒后第7天,每組隨機(jī)取魚5尾,尾靜脈分別取血混合,并將血樣分為2份。一份以肝素鈉抗凝用于吞噬實驗;另一份于室溫傾斜放置1h,4℃放置2h,離心(3000r/min,10min,4℃)獲得血清,分裝后保存于-80℃,用于測定酶活力。1.6血清蛋白的檢測參考Soveyi等的方法,取0.1mL抗凝血,加30μL1.0×109CFU·mL-1熱滅活金黃色葡萄球菌菌液,室溫放置1h,期間每隔10min搖動1次。取混合液涂片,自然風(fēng)干,甲醇固定,Giemsa染色,油鏡下觀察計數(shù)。每組取3份血樣,每份涂片3張,每片隨機(jī)選取10個視野,按以下公式計算吞噬百分?jǐn)?shù)(PP)和吞噬指數(shù)(PI):PP=100個血細(xì)胞內(nèi)參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100×100%;PI=100個血細(xì)胞內(nèi)吞噬細(xì)菌的總數(shù)/100個血細(xì)胞內(nèi)參與吞噬的細(xì)胞數(shù)×100%。1.7血清中三種免疫相關(guān)酶活性變化血清經(jīng)無菌PBS稀釋1倍,以試劑盒測定其中SOD、POD、ACP活力。每組4個平行,重復(fù)測定3次。1.8統(tǒng)計利用軟件Origin8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,所得數(shù)據(jù)均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式(xˉ±SE(xˉ±SE),t檢驗比較組間差異。2結(jié)果2.1pp、pi的變化免疫后及攻毒后,紅細(xì)胞(見圖1-A)、淋巴細(xì)胞(見圖1-B)、單核細(xì)胞(見圖1-C)、嗜中性粒細(xì)胞(見圖1-D)、血栓細(xì)胞(見圖1-E)等均發(fā)生吞噬,其中紅細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的吞噬能力。單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞多伸出指狀或絲狀偽足,其他細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)凹陷吞噬細(xì)菌。免疫后各組PP為10%～28%(見圖2)。ECPs組與FKC+ECPs組PP由免疫后第7天的近20%上升至第42天的30%左右;FKC組PP平緩上升,顯著低于FKC+ECPs組及ECPs組(P<0.05);PBS組PP基本穩(wěn)定,顯著低于各免疫組(P<0.05)。相對于免疫后第42天,以NUF849攻毒后第7天,各組PP均上升,尤其FKC+ECPs組升高至52.62%;以NUF812攻毒后第7天,FKC組與PBS組PP均上升,ECPs組PP則下降,而FKC+ECPs組無明顯變化。免疫后各組PI為1.18～1.45(見圖3)。免疫后第7～35天,免疫組PI均顯著高于PBS組(P<0.05);FKC組PI上升較慢,在第14天上升至ECPs組與FKC+ECPs組的水平,隨后在第35天降至PBS組水平;直至第42天,ECPs組PI無明顯下降,FKC+ECPs組PI降至PBS組水平。相對于免疫后第42天,以NUF849攻毒后第7天,FKC組、FKC+ECPs組及PBS組PI值均上升,其中FKC+ECPs組與PBS組升高至1.50左右;NUF812攻毒后第7天各組PI均上升,且PBS組>FKC組>ECPs組>FKC+ECPs組。2.2兩組免疫指標(biāo)比較各組SOD活力(見圖4)在免疫后第7～42天隨時間下降,而ECPs組下降趨勢較緩,在28d顯著高于其他組(P<0.05);在第35天和42天各組SOD活力趨于穩(wěn)定。相對于免疫后第42天,以NUF849攻毒后第7天,PBS組和FKC組SOD活力顯著上升(P<0.05),ECPs組與FKC+ECPs組略上升,而FKC+ECPs組最低;以NUF812攻毒后第7天,PBS組SOD活力升高(P<0.05),其他組無明顯變化。免疫組POD活力(見圖5)在第28天停止升高開始下降,FKC+ECPs組值顯著高于FKC組與ECPs組(P<0.05);除FKC+ECPs組免疫后第28天的POD活力高于PBS組外,免疫組POD活力均低于PBS組。相對于免疫后第42天,NUF849攻毒后第7天POD活力下降,FKC+ECPs組顯著高于其他組(P<0.05);以NUF812攻毒后第7天,各組POD活力均下降,組間差異不顯著(P>0.05)。免疫組ACP活力(見圖6)在第21天以后顯著高于PBS組(P<0.05),第28天達(dá)到峰值,FKC組顯著高于其他組(P<0.05)。以NUF849攻毒后第7天,FKC+ECPs組ACP活力相對于免疫后第42天有所上升,且顯著高于其他組(P<0.05);其余各組ACP活力均下降。以NUF812攻毒后第7天,各組ACP活力均下降,PBS組幾乎降至0。2.3各組小鼠fkc和ecps的急性毒性比較在免疫后第42天以菌株NUF849與NUF812分別攻毒,部分牙鲆表現(xiàn)出典型鏈球菌感染癥狀,即體色發(fā)黑、眼球白濁、游動遲緩、呼吸困難,解剖可見黃色或血樣腹水,肝臟充血,脾腫大,腎臟色深,膽汁色淺,腸壁變薄、腸腔積液,腦組織與內(nèi)臟中可分離到鏈球菌。PBS組為第2天(NUF849)和第3天(NUF812)開始出現(xiàn)死亡,在第10天(NUF849)和第15天(NUF812)死亡率達(dá)到100%;3個免疫組在攻毒后出現(xiàn)死亡的時間均遲于PBS組,其中FKC+ECPs組出現(xiàn)死亡的時間最晚。FKC、ECPs、FKC+ECPs3組均表現(xiàn)出一定免疫保護(hù)效果,對菌株NUF849的RPS分別為50%、40%和90%,對NUF812的RPS分別為60%、30%和80%,FKC+ECPs組顯著高于其他組(P<0.05)(見圖7,8)。3ecps和fkc后牙免疫活性的變化吞噬以及免疫相關(guān)酶類的作用是魚類非特異性免疫的重要組成部分。本文比較了海豚鏈球菌3種免疫原(FKC、ECPs及FKC+ECPs)所引起的牙鲆血細(xì)胞吞噬能力及血清中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和酸性磷酸酶(ACP)活力的變化,證實3種免疫原可不同程度地誘導(dǎo)牙鲆非特異性免疫應(yīng)答。病原菌能夠誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生趨化因子,在趨化因子和細(xì)菌成分及其代謝產(chǎn)物的共同作用下,吞噬細(xì)胞能夠接近抗原物質(zhì),通過吞噬或吞飲的方式將病原菌吞入。用于研究魚類吞噬能力的材料多是血液中的白細(xì)胞,由于牙鲆紅細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬能力,本文計數(shù)了全血細(xì)胞,結(jié)果證實牙鲆紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、血栓細(xì)胞等均具有吞噬能力。免疫后各免疫組PP、PI均有升高,表明3種免疫原可促進(jìn)牙鲆血細(xì)胞的吞噬能力,尤其FKC+ECPs組。其中,FKC+ECPs組與ECPs組的PP值以及PP值上升速度均高于FKC組,且FKC+ECPs組的PP值在以NUF849攻毒后達(dá)52.62%,顯著高于其他組(P<0.05),說明FKC+ECPs包含的豐富生物分子能夠更好地誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞對外源物質(zhì)進(jìn)行吞噬。ECPs在其中起了重要作用,可能是由于其中存在的多種有絲分裂原有效刺激了淋巴細(xì)胞的增生與分化從而促進(jìn)血細(xì)胞吞噬。Lee等研究亦發(fā)現(xiàn),適量的Edwardsiellatarda強(qiáng)毒株ECPs能有效激發(fā)牙鲆的細(xì)胞免疫,促進(jìn)吞噬作用,可作為良好的疫苗佐劑;Chen等用Mycobacteriumspp.的ECPs免疫虹鱒(Oncorhynchusmykiss),血細(xì)胞PP也出現(xiàn)了顯著提高,同樣證實了ECPs的免疫促進(jìn)作用。同時,PP和PI數(shù)值的變化程度表明,3種免疫原能使參與吞噬的細(xì)胞比例(PP)提高,而對單個細(xì)胞吞噬能力(PI)的促進(jìn)無顯著作用。超氧化物歧化酶(SOD)催化過氧陰離子發(fā)生歧化生成過氧化氫和氧,是清除體內(nèi)自由基的首要物質(zhì),當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時,其活力相應(yīng)變化,以消除細(xì)胞損害、促進(jìn)吞噬等。本文中各免疫組SOD活力表現(xiàn)出不同變化規(guī)律,總體趨勢隨時間下降,在第35天后趨于穩(wěn)定,說明牙鲆由注射后的應(yīng)激狀態(tài)恢復(fù)正常。在以NUF849攻毒后第7天,各組SOD活力上升,表明牙鲆因活菌刺激又進(jìn)入了應(yīng)激狀態(tài)。而FKC+ECPs組與ECPs組SOD活力維持于相對低的水平,可能由于FKC+ECPs與ECPs更好地激發(fā)了牙鲆的免疫應(yīng)答,使大部分受免疫牙鲆能夠有效地抵抗病原菌的侵染、維持穩(wěn)定狀態(tài)。在病原入侵、環(huán)境脅迫與免疫增強(qiáng)劑作用等情況下,機(jī)體SOD活力可能升高、降低或無顯著變化,也有研究指出其活力與誘導(dǎo)因素之間存在劑量效應(yīng)關(guān)系,其具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍不明確。所以,不能單純依據(jù)SOD活力數(shù)值的升降來判斷機(jī)體免疫力的高低,應(yīng)結(jié)合其他指標(biāo)具體分析。過氧化物酶(POD)與過氧化氫酶(CAT)同為SOD下游酶類,催化過氧化氫與氫供給體之間的氧化反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)呼吸爆發(fā),進(jìn)而提高粒細(xì)胞對外源異物的吞噬能力。本文在攻毒前免疫組POD活力先升后降,在35和42d趨于穩(wěn)定,與SOD相似,說明2種酶在免疫后的變化可能是由于牙鲆對注射的應(yīng)激;以NUF849攻毒后,FKC+ECPs組POD活力升高且顯著高于其他組(P<0.05),同時SOD活力也上升,說明FKC+ECPs能夠快速激活牙鲆抗氧化體系,進(jìn)而提高其吞噬能力與免疫保護(hù)力。本文POD與SOD的變化,符合抗氧化酶體系成分間相互制約、相互作用,以達(dá)到動態(tài)平衡從而抵抗細(xì)胞損害的規(guī)律。ACP是吞噬溶酶體的重要組成部分,在血細(xì)胞進(jìn)行吞噬和包囊反應(yīng)中會伴隨ACP釋放。對于被識別并吞噬的病毒或細(xì)菌,溶酶體能將其殺死并進(jìn)一步降解。ACP活力會隨著病原、外物入侵而變化。本文中免疫后牙鲆ACP活力在第28天達(dá)到峰值后下降,說明免疫原、免疫操作等激活了牙鲆的免疫系統(tǒng),隨時間推移其回復(fù)正常狀態(tài);以NUF849攻毒后,FKC+ECPs組ACP活性顯著高于其他組(P<0.05),其變化規(guī)律與該組的吞噬能力相對應(yīng),呈正相關(guān)關(guān)系,這與2次接受細(xì)菌刺激的櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)ACP活力與吞噬能力高于對照組的結(jié)果類似。免疫后第42天,各項指標(biāo)組間差異減弱,表明牙鲆狀態(tài)已趨于穩(wěn)定,因此本文選取這一時間點分別以菌株NUF849和NUF812攻毒。結(jié)果表明免疫組均表現(xiàn)出不同程度的免疫保護(hù)力。在停乳鏈球菌(Streptococcusdifficile)疫苗的研究中,ECPs對疫苗來源菌株的攻毒表現(xiàn)出92%的RPS,高于本文的40%(NUF849)及30%(NUF812),這可能是免疫劑量對比懸殊所致(400μg/尾:30μg/尾);而Shin等