我國(guó)生物技術(shù)藥物研究進(jìn)展

我國(guó)生物技術(shù)藥物研究進(jìn)展

我國(guó)“五11”計(jì)劃實(shí)施于“五12”計(jì)劃開(kāi)始后，對(duì)我國(guó)生物技術(shù)藥物的研究和開(kāi)發(fā)具有重要意義?！晃濉陂g全國(guó)生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,從6000億元升至16000億元人民幣,年增速率21.6%。2011年實(shí)現(xiàn)總產(chǎn)值近2萬(wàn)億元,預(yù)計(jì)到2015年生物產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)值將達(dá)到3~4萬(wàn)億元。作者統(tǒng)計(jì)1999~2008年10年中國(guó)生物制藥平均增速29.7%,以后的年份據(jù)吳梧桐研究資料2007~2010年平均增速為27.73%。2012年國(guó)務(wù)院發(fā)布‘十二五’國(guó)家戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃通知宣布:加速構(gòu)建具有國(guó)際先進(jìn)性水平的現(xiàn)代生物產(chǎn)業(yè)體系,加快海洋生物技術(shù)產(chǎn)品的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化,產(chǎn)業(yè)規(guī)摸年增速20%以上。有關(guān)部門計(jì)劃‘十二五’期間投向生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的重大新藥研發(fā)、創(chuàng)制領(lǐng)域?qū)ｍ?xiàng)資金在400億元左右,比‘十一五’期間翻了一番多。無(wú)疑地這將對(duì)生物技術(shù)藥物的研發(fā)在創(chuàng)新疫苗、單抗、基因工程藥物等領(lǐng)域起著重要的作用。新藥研發(fā)非易與之事,據(jù)統(tǒng)計(jì)美國(guó)FDA批準(zhǔn)1個(gè)新藥過(guò)程是:從10000個(gè)化合物(5年時(shí)間)經(jīng)臨床前研究篩出250個(gè)化合物(1.5年時(shí)間),進(jìn)入1、2、3期臨床研究篩出5個(gè)化合物(6年時(shí)間),FDA審批(2年時(shí)間)才獲得1個(gè)新藥。當(dāng)然生物技術(shù)藥物由于以DNA等為基礎(chǔ)的生物親緣性其研發(fā)新藥的命中率可能會(huì)高一些。生物技術(shù)藥物的研究水平,也就體現(xiàn)了我國(guó)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的軟實(shí)力。1細(xì)胞因子類藥物的應(yīng)用細(xì)胞因子具有高效能作用,一般在10-12mol/L水平即有明顯的生物學(xué)作用,它以細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的形式相互間作用的調(diào)節(jié)而發(fā)揮效能。在基因工程藥物發(fā)展的初期,細(xì)胞因子類藥物起到了主導(dǎo)作用,盡管此后有眾多佳麗加盟,但細(xì)胞因子魅力未減,如在2010年世界領(lǐng)先的前10位生物技術(shù)藥物中細(xì)胞因子占了2位,分別為GSF和EPO,銷售額創(chuàng)記錄達(dá)到35.58億和25.24億美元。在我國(guó)批準(zhǔn)上市的39種生物技術(shù)藥物中細(xì)胞因子占了14個(gè)。此外一些細(xì)胞因子如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)具有治療腎纖維化前景。1.1細(xì)胞介素有近年來(lái)已完成基因重組、克隆表達(dá)和活性測(cè)定等的白細(xì)胞介素有:IL-3、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-29、IL-33、IL-35、IL-37等。1.1.1hil-101.1.2hil-31構(gòu)建hIL-31基因真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞,可以通過(guò)自分泌的方式促進(jìn)HaCaT細(xì)胞炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。1.1.3hil-321.2治療冠心病合并心臟病是臨床上的重要職能之一,主要表現(xiàn)為以設(shè)置專門IFN是由病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生的一類因子,作用于其它細(xì)胞而干涉病毒的復(fù)制,在治療傳染性肝炎和一些癌癥方面,臨床上起著重要的作用。目前對(duì)IFN己進(jìn)行研究并取得成效的有:IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、IFNτ、IFNω、IFN-tau、集成IFNα突變體、人復(fù)合IFNα等。1.2.1新型人工化學(xué)在現(xiàn)有人復(fù)合IFNα結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸替換(N-cIFN),在大腸桿菌中表達(dá),純度為92%,效價(jià)測(cè)定體外活性為9×108IU。1.2.2ifn突變體if2002con-m2以抗病毒活性最高的集成IFNα和毒副作用最低的α1b為分子模版,獲得兼具高活性和可用PEG修飾的IFN2-Con-m2。1.2.3天然ifn高這是一個(gè)人工設(shè)計(jì)得到的IFNα,其抗病毒活性比天然IFNα高5~10倍。另2個(gè)IFN-Con1的突變子:cIFN(R164S)和(R22S,R164S)它們對(duì)胃蛋白酶的抗性更強(qiáng)。1.3重組蛋白的活性SCGF基因在大腸桿菌中表達(dá),純度可達(dá)90%以上。純化的重組蛋白rhSCGF-α具有生物學(xué)活性;hSCGF-α及rhGM-CSF對(duì)hUCMSCs均有刺激增殖活性,但協(xié)同作用效果最強(qiáng)。1.4人體胰島素1higf-1原核可溶性表達(dá)hIGF-1,表達(dá)量占菌體總蛋白的30%~35%。具有較強(qiáng)的抗原活性和明顯的促NIH/3T3細(xì)胞增殖作用。1.5細(xì)胞毒性檢測(cè)將hVEGF165克隆于表達(dá)載體pCDNA4.0與T-GS載體共同感染CHO-S細(xì)胞,表達(dá)量50mg/L,純度90%以上,細(xì)胞活性1.94ng/mL。1.6量試驗(yàn)是人內(nèi)皮抑素經(jīng)過(guò)基因突變得到的,具有抗腫瘤活性,在大腸桿菌中表達(dá),目的蛋白產(chǎn)量達(dá)到324mg/L。rhEndostatin是通過(guò)促進(jìn)β-catenin蛋白降解,降低Wnt信號(hào)通路下游癌基因survivin及cyclinD1mRNA的轉(zhuǎn)錄,從而抑制實(shí)驗(yàn)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。1.7基因載體轉(zhuǎn)染建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,基因載體轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞能有效表達(dá)canstatinmRNA和蛋白,能使荷瘤小鼠腫瘤體積明顯減小。2甘精胰島素的檢測(cè)在蛋白質(zhì)、多肽基因工程藥物研究中,新的天然結(jié)構(gòu)產(chǎn)物的研究雖占了一定的比重,但對(duì)天然蛋白質(zhì)多肽分子結(jié)構(gòu)的改造已進(jìn)入日程而且取得很重要的成就,如甘精胰島素。它是經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)改造的胰島素,它的臨床降血糖作用平穩(wěn)、無(wú)峰值而且作用持久,在2010年世界銷售領(lǐng)先的10大生物藥物中排到第7位,達(dá)到46.53億美元。而小分子合成多肽也不容小覷,一個(gè)由谷、丙、酪、賴組成的4肽,治療多發(fā)性硬化癥,也排入第9位,年銷售33.15億美元。2.1hv3和hv3的比較構(gòu)建HVⅢ突變體庫(kù)R33G34D35X36-rHVⅢ,從中篩選出具有與rHV3抗凝血酶活性比活力相當(dāng),同時(shí)又具有很強(qiáng)的抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率的雙作用靶點(diǎn)水蛭素Ⅲ突變體。該突變體庫(kù)第36位氨基酸位點(diǎn)為Met和ser時(shí),突變體具有很好的抗凝血和抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的雙重藥理活性。2.2人類胰高血糖素樣品2pp-h、gly2、glp-21-35用尾酶法構(gòu)建人胰高血糖肽樣肽-2類似物,改變?nèi)诤匣锇楹?目的肽的表達(dá)量從0.106g/L提高到0.372g/L。2.3oxlig-1/r2-gpi/nb免疫產(chǎn)物的形成重組表達(dá)人源β2-GP1及其第V結(jié)構(gòu)域基因,獲得了高水平表達(dá),且具備活性,可抑制oxLig-1/(r)β2-GPI/Antibody免疫復(fù)合物的形成。2.4gc9010基因表達(dá)以苦瓜基因組為模版,在畢赤酵母中高效表達(dá)MAP30蛋白,Mr32000,重組蛋白占上清液重蛋白67%,目的蛋白總回收率32.4%,具有明顯的抑制人胃癌細(xì)胞SGC7901活性,IC50為30μg/mL。2.5小鼠皮下注射、口服糖耐量、胰島素釋放量實(shí)驗(yàn)結(jié)果融合表達(dá)Exendin-4類似物,表達(dá)量占菌體總量的40%,純度達(dá)到91.8%,小鼠皮下注射、口服糖耐量實(shí)驗(yàn),可顯著降低血糖和顯著促進(jìn)胰島素分泌的活性。2.6新a類細(xì)菌素在大腸桿菌中高效表達(dá),純度95%,產(chǎn)量36.1mg/L。對(duì)單核細(xì)胞增生李特氏菌有明顯的抑制作用。2.7sec2突變株利用SEC2基因截短技術(shù),獲得保留T細(xì)胞刺激活力又不引發(fā)催吐效應(yīng)的SEC2突變株(NSM),NSM可顯著刺激T細(xì)胞增殖,并且可顯著抑制人大腸癌細(xì)胞(CX-1)和人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)生長(zhǎng),顯著抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng),而且不再誘發(fā)動(dòng)物嘔吐效應(yīng)。2.8臨床療效研究重組EXf作用H2O2誘導(dǎo)INS-1胰島β細(xì)胞凋亡模型,可使INS-1胰島β細(xì)胞存活率明顯增加,明顯抑制DNALadder的出現(xiàn),并呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。趨化素樣因子(CKLF1)是一個(gè)新的促炎因子,是一個(gè)自身免疫疾病和過(guò)敏性疾病的藥物治療靶標(biāo)。CKLF-C19是其拮抗肽,不僅可拮抗多種趨化因子及受體介導(dǎo)的細(xì)胞趨化功能,在小鼠哮喘模型中可明顯抑制Th細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞在肺部的浸潤(rùn),降低氧通道反應(yīng)性。2.10免疫源性的變化在大腸桿菌中高效表達(dá)hINGAP,表達(dá)量占菌體總蛋白的40%左右,純度達(dá)到98.81%,具有良好的免疫源性,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,它能促使胰島細(xì)胞再生,逆轉(zhuǎn)鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病。2.11人體肝臟星形激活相關(guān)蛋白stp重組表達(dá)了hSTAP,可抑制次氯基三乙酸鐵對(duì)肝星狀細(xì)胞造成的氧化應(yīng)激作用。2.12人體疾病的相關(guān)體rh-apo我國(guó)獨(dú)立研發(fā)的一種抗腫瘤生物制劑。1期臨床研究表明對(duì)人體安全性較好,可能具有一定的抗腫瘤療效。2.13雞胚絨膜血管增殖細(xì)胞系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)人胸腺素β16,比活性5.3×105U/mg。在體外可促進(jìn)BALB/c3T3細(xì)胞、兔角膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及雞胚絨毛膜血管增殖;在體內(nèi)可促進(jìn)家兔堿燒傷皮膚愈合。2.14細(xì)胞免疫誘導(dǎo)Humanin是人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性多肽,能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于各種早老性癡呆癥及相關(guān)因素誘導(dǎo)的凋亡。HN肽鏈第14位氨基酸被Gly取代后的突變體,重組表達(dá)的神經(jīng)保護(hù)肽(HNG)的神經(jīng)保護(hù)作用與天然的HNG相近。2.15產(chǎn)量及分布構(gòu)建了鯊肝活性蛋白原核分泌表達(dá)載體,獲得rSHAP,純度95%,產(chǎn)量約318mg/L。具有刺激SMMC-7221細(xì)胞株增殖活性,體外活性檢測(cè)顯示15~45μg/mL的rSHAP能夠顯著提高正常人肝細(xì)胞HL-7702葡萄糖激酶活性。2.16小劑量順鉑以及其他常用的協(xié)同抑制劑經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)獲得的抗癌多肽A38能抑制人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng),誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡,小劑量順鉑與A38聯(lián)用具有協(xié)同抑制作用,且效果比高濃度下的單用A38或單用順鉑的作用明顯。2.17安氏體異構(gòu)體小肽acsdkp以D型氨基酸替代的方式構(gòu)建一種能抵抗血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)降解的異構(gòu)體小肽AcSDKP,AcSDKP能抗ACE降解,在體外能抑制成纖維細(xì)胞增殖、抑制BMSC向巨噬細(xì)胞分化。2.18血管緊張素ng1-7異構(gòu)體血管緊張素ng12以D形氨基酸替代的方式構(gòu)建2種能抵抗胃蛋白酶降解的血管緊張素Ang1-7異構(gòu)體小肽血管緊張素改構(gòu)體1和2。改構(gòu)體能抵抗酶的降解,在體外能結(jié)合于A549細(xì)胞表面抑制A549細(xì)胞增殖。2.19avastin的耐藥性整合素阻斷劑類多肽,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明AP25抗腫瘤作用顯著(相當(dāng)于avastin),不容易產(chǎn)生耐藥性,毒副作用低。人工合成L-酪氨酸、L-絲氨酸、L-亮氨酸三肽,臨床研究表明酪絲亮肽可抑制HCC細(xì)胞發(fā)生的腹壁轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移、肝內(nèi)侵襲和肝轉(zhuǎn)移。3tnf-b-b融合蛋白是生物技術(shù)藥物研究中最精彩的華章。融合蛋白藥物在臨床應(yīng)用范圍上,遍及治療學(xué)中各主要領(lǐng)域?；?基因的融合可創(chuàng)造更多的性能比天然生物藥物結(jié)構(gòu)更好的新藥。融合蛋白可使藥物功能增強(qiáng)(如兩種不同抗菌肽的融合、抗體與力達(dá)霉素輔基蛋白的融合);體現(xiàn)雙功能或多功能(如溶栓作用并具抗凝血作用、加速創(chuàng)傷愈合并有抗感染作用);延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期(融合人血清白蛋白);藥物突破血腦屏障(融合穿膜肽);藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的靶向性(融合主動(dòng)靶向載體蛋白)等。在技術(shù)上融合蛋白也比較成熟,而且已有藥物在臨床上應(yīng)用多年,Entrel是最早于1998年美國(guó)FDA批準(zhǔn)臨床應(yīng)用的一種可與TNF結(jié)合的偶聯(lián)可溶性受體,治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,2005年開(kāi)始就居全球生物技術(shù)藥物銷售額之首,達(dá)到37億美元,2006年44.79億美元,到2010年達(dá)到68.08億美元。我國(guó)批準(zhǔn)了重組腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白上市。其它人血清白蛋白和PEG分子后修飾的基因工程藥物,許多都先后批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療。下面反映的是我國(guó)科技工作者近期在這一領(lǐng)域的研究成果。3.1重組蛋白的融合腫瘤血管導(dǎo)向性干擾素(TFN-α2a-NGK)、重組凋亡融合蛋白(TRAIL-Fc)、FGF21-L-Fc融合蛋白、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白(GW003)、谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶-人核糖核酸酶抑制因子融合蛋白(GST-hRI)、融合蛋白1hFVⅡ-LDM、GST-人S100A2融合蛋白、人B淋巴細(xì)胞刺激因子受體-抗體融合蛋白、人促黃體激素釋放激素-綠膿桿菌A融合蛋白(LHRH-PE-40)、人腫瘤壞死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白、含人Fc重組凋亡融合蛋白(TRAIL-Fc)表皮生長(zhǎng)因子受體干擾序列-白細(xì)胞介素24融合蛋白(EGFRi-IL-24)、重組CTB-GADⅢ蛋白、DNaseⅡ融合蛋白(PLTD)、EGFRvⅢ-HBcAg融合蛋白、BDNF-LINGO-1-Fc融合蛋白、GADⅢ蛋白、CTLA-4Ig融合蛋白、靶向IL18-EGF融合蛋白、靶向表皮生長(zhǎng)因子受體的寡肽配體與力達(dá)霉素強(qiáng)化融合蛋白、融合蛋白KininogenD5_(60-148)-TRAIL-(114-281)、人骨保護(hù)素-熱休克蛋白70融合蛋白、抗凝溶栓雙功能HV12p-rPA融合蛋白、重組雙功能水蛭素12肽-瑞替普酶(rPA)融合蛋白、GM-CSF/IL-3融合蛋白、BPI_(23)-haFGF融合蛋白、抗EGFR單鏈抗體與力達(dá)霉素融合蛋白、白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑與免疫球蛋白E融合蛋白。靶向抗腫瘤VEGF-α-Gal融合蛋白、GSFhS1009A融合蛋白、人超氧化物歧化酶-胸腺素α1融合蛋白、抗CD20單鏈抗體與力達(dá)霉素強(qiáng)化融合蛋白、hK1-L-Fc融合蛋白、人干細(xì)胞因子模擬肽與c-JUN亮氨酸拉鏈融合蛋白、重組融合蛋白EGFE4orf4、人可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ與IgGFc融合蛋白、人白介素-4二硫鍵異構(gòu)酶DsbC融合蛋白、抗HIV融合多肽、可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ-脂聯(lián)素球部融合蛋白(sTNFRⅡ-gAD)、PEP-1-CAT融合蛋白、靶向IL18-EGF融合蛋白、靶向融合蛋白XE-TNFαm2、人干擾素α2b和IgGFc融合蛋白、人表皮生長(zhǎng)因子8p67信號(hào)肽融合蛋白、抗乙肝病毒表面抗原單鏈抗體與γ-干擾素融合蛋白、重組胸腺素α1(TM-α1)與復(fù)合α干擾素(IFNα-con)融合蛋白、KininogenD5和TRAIL融合蛋白、重組人B7-H4IGⅤ融合蛋白、截短組織因子tTF的融合蛋白、葡激酶-水蛭素融合蛋白、天蠶素-馬蓋寧融合蛋白、TNF受體-血管活性腸肽融合蛋白、血管生成素-干細(xì)胞因子融合蛋白(TPO-SCF)、降鈣素-骨生長(zhǎng)肽融合蛋白(SCT-OGP)。3.2人血清氨基酸突變體ames重組人血清白蛋白-干擾素α2a融合蛋白(HSA-IFN-α2a)、重組人血清白蛋白-干擾素α-2b融合蛋白(HSA-IFN-α2b)、重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白(rHSA-GCSF)、HSA與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白(HAS/GM-CSF)、重組骨保護(hù)素片段與人血清白蛋白融合蛋白(rhOPG179-HAS)、重組白蛋白融合人胰島素樣肽突變體的串聯(lián)體[rh(GLP-1A2G)2-HAS(GGH)]、IL-1RaHAS融合蛋白、人β干擾素-人血清白蛋白融合蛋白、ApotPA融合蛋白、融合蛋白STH、人甲狀旁腺素(1-34)二聯(lián)體與人血清白蛋白融合蛋白、人Leptin基因融合蛋白、截短型胰高血糖素樣肽-1融合蛋白(SGLP-1/HSA)、KGLP-1/HSA融合蛋白、人胰高血糖素樣肽-1與人血清白蛋白融合蛋白、HSA-GHRH融合蛋白。3.3mdc-egfp/mdcsfp融合蛋白的相關(guān)變化帶有穿膜肽重組DTD-KLF4、人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子與穿膜肽融合蛋白、細(xì)胞穿膜肽融合蛋白PEP1-vMIP-Ⅱ、Sox2-Rp-EGFP融合蛋白、攜帶11R穿膜肽p53融合蛋白、家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白(Mdc-hly)、人抗HER2單鏈抗體/精氨酸九聚融合蛋白(scFv-9R)、重組融合蛋白IL-3-PE38KDEL、多聚精氨酸轉(zhuǎn)導(dǎo)域-凋亡素融合蛋白、PTD-SARA融合蛋白、(RGD)3/tTF、VEGF-抗菌肽融合蛋白、天蠶素B和表皮生長(zhǎng)因子融合蛋白。3.4peg通過(guò)修飾多肽蛋白質(zhì)1991年用于治療兒童免疫缺陷癥的第一個(gè)PEG-腺苷脫氨酶(adagen)獲FDA批準(zhǔn)上市。目前已有PEG修飾的門冬酰胺酶、IFNα2a和2b等多種生物技術(shù)藥物批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。PEG定點(diǎn)修飾多肽蛋白質(zhì)的途徑主要有:氨基修飾、巰基修飾、羥基修飾、羧基修飾、糖基殘基的修飾等,修飾后的蛋白質(zhì)、多肽最顯著的是PEG的多聚物增加了結(jié)合蛋白的分子質(zhì)量大小,降低了腎臟的濾除率,從而延長(zhǎng)了藥物的半衰期,增強(qiáng)了藥物在體內(nèi)的活性、理化穩(wěn)定性及降低了藥物的毒性和免疫原性等。我國(guó)PEG-蛋白質(zhì)分子后修飾主要品種有:PEG修飾尿酸酶(PEG-Uricase)、PEG修飾促胰島素分泌肽(PEG-Ex4C)、PEG修飾IL-6(PEG-rhIL-6)、PEG修飾人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-rhGCSF)、PEG-HM-3等。4抗菌肽的形成細(xì)胞穿膜肽是一類以非受體依賴方式、非經(jīng)典的內(nèi)吞方式直接穿過(guò)細(xì)胞膜的多肽。穿膜肽的防御肽部分如抗菌肽(AMPs)能在極短的時(shí)間內(nèi)2~3min殺死微生物。一部分抗菌肽還具有明顯的抗腫瘤活性,又被稱為抗癌肽(ACPs)。穿膜肽的另一重要作用就是在體內(nèi)起到傳遞生物活性分子(蛋白質(zhì)、核酸、小分子物質(zhì)),這對(duì)藥學(xué)和治療學(xué)領(lǐng)域?yàn)樗幬镞f送及靶向治療提供了新的途徑。CPPs穿膜機(jī)制一般認(rèn)為是:CCPs或CCP2與小分子的結(jié)合物內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞是通過(guò)靜電作用和形成氫鍵的易位或轉(zhuǎn)導(dǎo)作用;而CPPs與大分子的結(jié)合物是通過(guò)能量依賴的內(nèi)吞作用,特別是胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞。抗菌肽(AMPs)最早在昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn),此后,天然抗菌肽和基因重組抗菌肽平行發(fā)展。目前已經(jīng)過(guò)鑒別的AMPs超過(guò)2000種,研究的AMPs超過(guò)8000種。在美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的AMPs有Cubicin,用以治療革蘭氏陽(yáng)性菌引起的皮膚感染;正在臨床前和臨床研究的有11種。在抗菌肽基因重組表達(dá)方面尚有一些困難要克服:①由于抗菌肽是小分子堿性多肽,極易受到體內(nèi)蛋白酶的攻擊;②很多抗菌肽都含有二硫鍵翻譯后修飾,因此外源性表達(dá)較其他多肽類藥物更復(fù)雜;③由抗菌肽自身的抗菌作用對(duì)宿主工程菌產(chǎn)生自噬,限制了高表達(dá)的水平,但AMPs因廣譜抗菌、熱穩(wěn)定強(qiáng)、對(duì)病原體不產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn),倍受人們關(guān)注。我國(guó)已研究獲得成果的抗菌肽有:棕點(diǎn)湍蛙抗菌肽、抗菌肽Folicidin-3、合成抗菌肽TachyplesinI、雜合抗菌肽HMCM、雜合抗菌肽(ADM)、β-發(fā)卡抗菌肽、新型抗菌肽(MDP-1和MDP-2)、霉肽素(AF)、新型穿膜肽(CGRLWMRWYSPWARRYGC)、家蠅防御素(defensin)、海蠶抗菌肽(perinerin)、抗真菌肽(Drs)、人源抗菌肽(IL-37)、中國(guó)家蠶抗菌肽(ABP-CM4)、Magainin的融合肽、牛娃Tempurins抗菌肽、中國(guó)林蛙皮膚抗菌肽、抗菌肽Cecropin、人類抗菌肽hepcidin、抗菌肽CM4、抗菌肽CP10A、抗菌肽GKI、抗菌肽DermaseptinS4等。5溶栓治療藥物的選擇酶在治療藥物中作用機(jī)制明了,專一性強(qiáng),靶點(diǎn)明確,因此在消化性疾病、心血管疾病的溶栓治療及遺傳缺陷病的治療等方面成了不可替代的首選藥物。我國(guó)有5種重組藥用酶上市。我國(guó)正在研究的藥用酶主要有:5.1alf在畢赤酵母溶血栓中的活性該酶為ALF的N端突變體,屬金屬蛋白酶,其溶血栓的速度是傳統(tǒng)的纖溶酶原激活酶的6倍,有纖溶活性而無(wú)出血活性,已建立了ALF在畢赤酵母高效活性分泌性表達(dá)系統(tǒng)。5.2蛇毒酶anschod采用酵母偏錄密碼子合成了ancrod全長(zhǎng)基因,其比活力與天然ancrod相近。5.3游泳纖溶酶efe是從赤子愛(ài)勝蚓中克隆到一種纖溶酶新基因Efp-o,在大腸桿菌中表達(dá),具有抗凝和溶栓作用。5.4嗜血蝙蝠唾液纖溶酶原激活劑bt-pa首次在體外人工合成Bat-PA全長(zhǎng)基因序列,在畢赤酵母中表達(dá),產(chǎn)量達(dá)到30mg/L。5.5治療經(jīng)口損傷CAT能高效清除過(guò)氧化氫,阻斷體內(nèi)高毒性的羥自由基的生成,用于抗燒傷、缺血再灌流及肺炎損傷等的治療。CAT在畢赤酵母中表達(dá),純度高達(dá)到95%以上。5.6rsjluss對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌的抑菌效果在大腸桿菌中表達(dá)得到酶活力為19.2U/mg的rSjLys,對(duì)革蘭氏陰性、陽(yáng)性菌均有抑制作用,尤其對(duì)常見(jiàn)的海洋致病菌副溶血弧菌和銅綠假單孢菌具有很強(qiáng)的抑菌活性。5.7plg-sp的制備研究重組人纖溶酶原絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(rhPLG-SP)的酵母表達(dá),表達(dá)量400mg/L,純度大于96%,等電點(diǎn)pH7.5、Mr27877、比活性23.6U/mg。5.8尿激酶激活速率從畢赤酵母表達(dá)RGD-hPGL-K,產(chǎn)量0.16g/L,純度90%以上,其尿激酶激活速率和纖溶活性與hPLG-K無(wú)顯著差別,而血小板聚集抑制率顯著高于hPLG-K。5.9lg1hlyz酶在大腸桿菌中表達(dá)人溶菌酶,Mr約40000,表達(dá)量占菌體總量的46.5%,純度95%以上,hLYZ酶活力為2389U/mg,對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有抑制作用。5.10磷酸酶uc合成黃曲霉尿酸氧化酶基因,大腸桿菌表達(dá),目的蛋白占菌體總蛋白的50%,純度為95%,體外活性測(cè)定具有分解尿酸的能力。5.11人源基酶-2氨基c-2c-血漿遺傳因子實(shí)體段pexPEX在大腸桿菌中表達(dá),在雞胚脲囊膜模型上研究,具有抑制血管生成,進(jìn)而抑制乳腺癌BICR-H1細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移作用。5.12民機(jī)基因重組蛋白β-內(nèi)酰胺酶是一種可以用于腫瘤生物治療ADEPT(單抗導(dǎo)向酶活化前藥)重組蛋白,Mr約為42000,得到的純化蛋白具有較好的腫瘤細(xì)胞靶向性。6rnai在其他特殊細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程,是通過(guò)雙鏈DNA分子在mRNA水平上關(guān)閉相應(yīng)基因的表達(dá),對(duì)引發(fā)RNAi現(xiàn)象的小片段RNA雙鏈分子即為小干擾RNA(siRNA)。RNAi技術(shù)為人類疾病發(fā)病機(jī)制研究和基因治療開(kāi)辟了一個(gè)新領(lǐng)域。由于siRNA技術(shù)的巨大潛力,世界各國(guó)都一直致力于該技術(shù)的完善,推向臨床治療的實(shí)際應(yīng)用。目前有用于治療可導(dǎo)致失明的老年黃斑變性癥(AMD)、由呼吸道融合病毒(RSV)所引發(fā)的小兒疾病RNAi藥物,用于癌癥治療的CALAAOI及ALN-VSPO2都已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。我國(guó)在腫瘤治療方面的實(shí)驗(yàn)研究方面取得成果有:利用靶向CCK-B受體的siRNA能阻斷人胃癌SGC-7901細(xì)胞系CCK-B受體的表達(dá)、細(xì)胞增殖受到明顯抑制;靶向kappaBP65的RNAi研究顯示體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)芤种坡闶笠浦材Ｐ偷哪[瘤細(xì)胞增殖;將VEGF特異性siRNA轉(zhuǎn)染人類卵巢癌細(xì)胞系,結(jié)果顯示VEGF在mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均受到明顯抑制,細(xì)胞增殖及侵襲能力明顯下降;在人類結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系中,VEGFsiRNA顯著下調(diào)VEGF蛋白表達(dá),抑制細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。該siRNA還能抑制HIF-1a(含氧誘導(dǎo)因子-1a)的表達(dá)水平,阻斷腫瘤血管的生成;利用在大腸癌中高表達(dá)的Bcl-xL基因的特異性siRNA轉(zhuǎn)染大腸癌HT29細(xì)胞,結(jié)果顯示該基因在mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平被顯著抑制,細(xì)胞uPA蛋白水平也明顯下降,大腸癌細(xì)胞惡性侵襲能力明顯下降;相應(yīng)的siRNA使Survivin和Livin基因表達(dá)下調(diào),顯著的抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖;通過(guò)RNAi干擾骨髓細(xì)胞系RPMI8226的TRAF6表達(dá),抑制了骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。RNAi特異下調(diào)Hela細(xì)胞β-catenin的表達(dá)后,許多促凋亡基因被活化,促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡;此外應(yīng)用RNAi技術(shù)在胃癌、大腸癌和肝細(xì)胞癌的實(shí)驗(yàn)研究中都取得了明顯效果,對(duì)子宮內(nèi)膜癌、肺癌、荷瘤裸鼠均顯示在體內(nèi)有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明RNAi治療技術(shù)的可行性和有效性,但用于臨床尚待進(jìn)一步研究。其他有關(guān)siRNA的研究項(xiàng)目還有:沉默核糖核酸酶抑制因子(RI)、LivinsiRNA、miRNA-29c、Id2shRNA、RNA干擾PDK-1、APE1siRNA、shRNA-β-catenin、microRNA-99a、amiRNA、siRNA-STAT3、siRNA-BMP、siRNA-COX-2、1504-siRNA、HPIPsiRNA、DcR3siRNA、CT45-5-siRNA、siRNA-HIF-1α、siRNA-BSP、siRNA-PrxI、siRNA-PESI、siRNA-NRP1、shRNA-p115、hTERT-shRNA等。6.2反義核酸的藥效學(xué)研究反義核酸是根據(jù)堿基互補(bǔ)原理,利用特異互補(bǔ)的DNA或RNA片段與目的序列核酸結(jié)合,通過(guò)空間位阻效應(yīng)或誘導(dǎo)的RNase活性的降解作用,抑制或封閉目的基因的表達(dá)。國(guó)外,反義核酸vitravene于1998年上市,以后又有10多個(gè)反義核酸藥物上市。已進(jìn)入臨床研究的反義核酸新藥約有38種,處在實(shí)驗(yàn)室研究階段的達(dá)上百種。我國(guó)也在此領(lǐng)域做了大量研究工作,近期完成的如下:反義核酸可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、分化及誘導(dǎo)等凋亡。PKC、cyclin及CDK基因的變異和腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系,利用反義RNA技術(shù),抑制乳腺癌細(xì)胞PKCα的表達(dá),結(jié)果顯示細(xì)胞增殖速率明顯減慢,cyclin與CDK4的表達(dá)水平下降;PEI介導(dǎo)的蛋白激酶α(PKα)基因反義核酸(ASODN)能誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞的凋亡;WT1反義核酸明顯抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖,抑制率達(dá)49.48%,凋亡率為13.18%;靶向過(guò)氧化物酶增殖活化受體α(PPARα-2)高核苷酸可劑量依賴性地抑制肝癌細(xì)胞中HBsAg和HBeAg的表達(dá),顯著降低細(xì)胞中PPARαmRNA水平和蛋白水平,同時(shí)也驗(yàn)證確定了PPARα可能成為HBV藥物作用的靶點(diǎn);比較了NDP-1反義寡核苷酸與VEGFR-2反義寡核苷酸對(duì)人胃癌SGC7901的細(xì)胞增殖的凋亡的影響,證明兩者均有抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,兩者聯(lián)合轉(zhuǎn)染比單獨(dú)作用明顯增強(qiáng);人反義端粒酶能明顯減低BEL-7402肝癌細(xì)胞的黏附和侵襲能力,其機(jī)制可能與上調(diào)E-cad的表達(dá)、下調(diào)INTβ1的表達(dá),并抑制MMP-2和MMP-9有關(guān)。6.3基因治療在多種致命性疾病中的進(jìn)展基因治療是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞,以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷式異常引起的疾病,從而達(dá)到治療的目的?；蛑委煹难芯繗v盡波折,1990年因治療腺苷脫氨酶缺陷病人曾獲得成功引發(fā)了世界基因治療的研究熱潮。1999年由于經(jīng)基因治療的一例患先天性鳥氨酸轉(zhuǎn)甲酰胺酶缺陷癥的患者死去而使研究蒙受重創(chuàng)。在1990~2001年間,全世界已有532個(gè)基因治療的臨床試驗(yàn)在各國(guó)展開(kāi),19000名以上的志愿者參與其中,結(jié)果并不如意。但該研究并沒(méi)有因此而停頓,2009年因治療先天性黑蒙癥(LCA)使基因治療出現(xiàn)了轉(zhuǎn)機(jī),被評(píng)為:‘終點(diǎn)線前的最后沖刺’。美國(guó)Science雜志公布了2009年的十大科學(xué)突破,第7項(xiàng)就是:基因治療在多種致命性疾病中獲得成功。至今美國(guó)FDA尚未批準(zhǔn)一個(gè)基因治療產(chǎn)品上市,而我國(guó)SFDA批準(zhǔn)的基因藥物上市的有2種:重組人p53腺病毒注射液,重組人5型腺病毒注射液。至今我國(guó)已有20多個(gè)基因治療項(xiàng)目申請(qǐng)臨床試驗(yàn),申請(qǐng)的治療領(lǐng)域主要是腫瘤、遺傳性疾病(如血友病)、傳染病(慢性乙肝)、慢性疾病(如下肢血管閉塞癥)等。2009年我國(guó)基因治療臨床研究的產(chǎn)品有,重組腺病毒載體介導(dǎo)單純皰疹病毒胸苷激酶基因制劑、特異性溶瘤重組腺病毒注射液KH901、重組人內(nèi)皮抑素腺病毒EDS01、重組腺病毒肝細(xì)胞因子注射液(AD-HGF)、AAV-hFIX肌肉注射液,基因溶瘤腺病毒注射液(SG600-P53)、OrionX010重組人GMCSF單純皰疹病毒注射液?！晃濉?63計(jì)劃“基于功能基因組和結(jié)構(gòu)基因組的藥物分子統(tǒng)計(jì)”實(shí)驗(yàn)結(jié)果也令人鼓舞,該項(xiàng)目發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了5個(gè)新化合物進(jìn)入臨床前研究;鑒定了9個(gè)治療用腫瘤藥物的新靶標(biāo);開(kāi)發(fā)及結(jié)構(gòu)優(yōu)化了針對(duì)哮喘相關(guān)的趨化因子CKLF1為靶標(biāo)的藥物先導(dǎo)化合物;發(fā)現(xiàn)了并具抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的候選藥物MTC-200;抗艾滋病藥物候選物F18等。我國(guó)基因治療Ⅱ型糖尿病取得進(jìn)展,“突變性葡萄糖激酶基因治療Ⅱ型糖尿病”,現(xiàn)已進(jìn)入中試階段。該項(xiàng)目申請(qǐng)了國(guó)際專利。近期完成的治療基因?qū)嶒?yàn)研究項(xiàng)目如下:(1)抑制腫瘤mosm是對(duì)胰腺疾病的載體ad-osm(2)mir29c重組腺體病毒ad5f11pmir29cAd5F11p-miR29C可使骨髓SKO-007細(xì)胞凋亡率達(dá)到26.5%,XG7細(xì)胞的凋亡率46.9%。(3)損傷的治療pUDK-HGF對(duì)大慶霉素誘導(dǎo)的人鼠腎纖維化損傷可使腎功能有所改善,緩解腎纖維化的進(jìn)展。對(duì)已纖維化腎臟直接注射HGF基因,可促進(jìn)腎間質(zhì)血管再生,并進(jìn)一步降低腎小管間質(zhì)損傷積分。(4)胰腺疾病基因-p1b腫瘤adcvm-p16AdCMV和P16協(xié)同作用,能增強(qiáng)對(duì)SMMC-7221肝癌細(xì)胞移植瘤的抑制作用,促進(jìn)移植瘤細(xì)胞的凋亡。(5)新型吸毒性腺體cnh500-h7治療非常廣闊疾病的功能干細(xì)胞是一種具有自我復(fù)制和多向增殖分化潛能的未分化細(xì)胞,能培育成肌肉、骨骼和神經(jīng)等人體組織和器官,可用于治療白血病、先天性代謝疾病、某些實(shí)體瘤、糖尿病、心臟病和腦癱等多種疾病,具有非常廣闊的醫(yī)療用途。全球干細(xì)胞醫(yī)療市場(chǎng)大約有800億美元,如果將藥物等有關(guān)產(chǎn)業(yè)計(jì)算在內(nèi),2020年全球市場(chǎng)規(guī)模可達(dá)4000億美元,是21世紀(jì)世界重點(diǎn)戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)之一。7.1國(guó)家批準(zhǔn)的fna批準(zhǔn)的臨床干預(yù)項(xiàng)目骨髓原始間充質(zhì)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞心梗注射液、自體骨骼間充質(zhì)干細(xì)胞注射液,臍帶血巨核系祖細(xì)胞注射液、臍帶血紅系祖細(xì)胞注射液。7.2術(shù)準(zhǔn)入階段目前干細(xì)胞藥物尚未獲FDA批準(zhǔn)應(yīng)用,自體成體干細(xì)胞、供受者1對(duì)1的異體干細(xì)胞尚處于三類技術(shù)準(zhǔn)入階段(醫(yī)療技術(shù))。以造血干細(xì)胞為例,非相關(guān)供體白細(xì)胞(HLA)配型相合率只有10萬(wàn)分之一。從臍帶血配型,理論上配型幾率是1/10000到1/400,如果臍帶血庫(kù)有足夠大,則每個(gè)患者都有可能找到合適的臍帶血干細(xì)胞。如果不能形成產(chǎn)業(yè),干細(xì)胞受惠的患者群將大大減少。7.3聯(lián)合用藥細(xì)胞hsc、成體干細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞主要包括胚胎干細(xì)胞(ES)、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)、成體干細(xì)胞(如間充質(zhì)干細(xì)胞MSC和造血干細(xì)胞HSC)。間充質(zhì)干細(xì)胞除了人臍帶血、人臍帶(比臍帶血更好)外,最近又發(fā)現(xiàn)胎盤組織,取材更方便,而且沒(méi)有倫理問(wèn)題。7.4我國(guó)早期干預(yù)臨床藥效學(xué)的探討7.4.1治療青少年特殊類型患者的療效自體骨髓MSC能顯著改善心肌梗死患者左心室的功能;自體骨髓MSC移植治療24例肝衰竭、肝硬化失代償期患者,肝功能、凝血功能、肝炎貯備功能明顯改善,縮小的肝臟有所增大。能夠相對(duì)降低肝硬化患者發(fā)生肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)和死亡率;對(duì)60例末期肝硬化患者治療安全有效,能改善肝功能、凝血功能及臨床癥狀;對(duì)30例肝炎患者,經(jīng)自體干細(xì)胞回植治療后,HBsAg、HBeAg、抗-HBc、抗HBe及HBV-DNA均轉(zhuǎn)陰,臨床癥狀無(wú)反彈,表明體內(nèi)肝炎病毒清除,且無(wú)病毒復(fù)制,其中多數(shù)病例肝功能也明顯改善,ALT、AST水平恢復(fù)正常,彩超指標(biāo)較治療前均有明顯好轉(zhuǎn);骨髓MSC與異基因造血干細(xì)胞移植能顯著降低植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率;移植自體的G-CSF動(dòng)員的外周血單個(gè)核干細(xì)胞能改善糖尿病患者的嚴(yán)重肢體缺血;移植自體骨髓干細(xì)胞(BMSCs)治療Ⅱ型糖尿病可改善其胰島功能,減輕對(duì)外源性降糖藥物的依賴;用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,治療腦癱患者229例,治療前后ADL評(píng)分總分、步行動(dòng)作、床上運(yùn)動(dòng)、認(rèn)識(shí)交流動(dòng)作比較證明對(duì)智力障礙腦癱患者治療有效,另外還有報(bào)導(dǎo)對(duì)腦外傷的試驗(yàn)結(jié)果;用樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)繼免疫治療兒童急性白血病,44例接受DC-CIK治療后44例患兒持續(xù)完全緩解,不良反應(yīng)輕微;以異常行為量表(ABC)的效度對(duì)23例兒童孤獨(dú)癥患者用臍血單核細(xì)胞(CBMNCs)與臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSCs)治療的療效進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)論應(yīng)用干細(xì)胞聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練治療兒童孤獨(dú)癥療效顯著高于單純康復(fù)訓(xùn)練組。按ABC表中嗜睡與刻板行為評(píng)分,CBMNCs聯(lián)合UCMSCs+康復(fù)治療組療效最良好?；仡櫺匝芯?31例中晚期惡性腫瘤手術(shù)于放、化療后靜脈輸注DC-CIK細(xì)胞治療的療效,DC-CIK細(xì)胞安全、有效,能明顯增強(qiáng)免疫功能,改善生存質(zhì)量,提高3年生存率;以CIK治療119例腎細(xì)胞癌患者作為治療組,IL-2聯(lián)合IFN治療的119例腎細(xì)胞癌作為對(duì)照組,結(jié)果CIK免疫療程可以顯著改善Ⅲ、IV期腎細(xì)胞癌患者的預(yù)后,增加CIK治療療程可以提高療效。7.4.2骨髓間充質(zhì)細(xì)胞治療間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)治療小鼠放射性損傷、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷、兔股骨頭壞死、大鼠脊髓損傷均有良好的恢復(fù)作用;γ射線照射后的IL-15基因修飾的NK細(xì)胞對(duì)原代卵巢癌細(xì)胞有明顯的殺傷作用;樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞(DC-CIK)對(duì)肺癌皮下移植瘤細(xì)胞的抑制率達(dá)到70.3%,明顯高于DC或CIK細(xì)胞的抑制作用;研究骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)對(duì)大鼠離體肝切除自體肝移植功能的保護(hù)作用;證明BMSCs能通過(guò)門靜脈注射入肝,改善移植大鼠后肝功能;將微載體培養(yǎng)的永生化肝細(xì)胞(IHH)注射于用CCl4建立的裸鼠ALF模型腹腔內(nèi)進(jìn)行腹膜透析治療,未治療組及空微載體治療組48h全部死亡,而采用IHH治療組48h動(dòng)物生存率為83.3%,持續(xù)14d后轉(zhuǎn)為長(zhǎng)期存活;對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎(UC模型),MSCs可促進(jìn)UC大鼠損傷結(jié)腸的修復(fù),部分MSCs可分化為結(jié)腸上皮細(xì)胞參與損傷的修復(fù);比較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和全骨髓細(xì)胞治療免疫介導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠的療效,單獨(dú)使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療能夠部分使再生障礙性貧血小鼠癥狀改善、造血功能恢復(fù)。骨髓間充質(zhì)細(xì)胞治療有效率不如全骨髓細(xì)胞,但兩組無(wú)顯著差異;利用腺病毒載體技術(shù),研究目的基因修飾的人源性外周血單核細(xì)胞來(lái)源的樹突狀細(xì)胞對(duì)抗人類免疫缺陷病毒-1的感染,目的基因修飾后對(duì)人類免疫缺陷病毒-1的抵抗力明顯增強(qiáng)。8生物技術(shù)藥物單抗的市場(chǎng)復(fù)合增長(zhǎng)率高單克隆抗體是繼重組蛋白藥物之后引領(lǐng)的世界生物制藥第二次高潮。2010年單克隆抗體藥物以480億美元的銷售額繼續(xù)領(lǐng)跑全球藥品市場(chǎng),2000~2010年10年的市場(chǎng)復(fù)合增長(zhǎng)率高達(dá)32%。2010年在全球20個(gè)處方藥和10個(gè)領(lǐng)先生物技術(shù)藥物中單抗分別占了6個(gè),每個(gè)品種年銷售額29.36~65.48億美元。IMS數(shù)據(jù)2007年全球單抗藥物已占整個(gè)生物技術(shù)藥物的34.4%,而在中國(guó)僅占1.7%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于全球平均水平。我國(guó)已批準(zhǔn)生產(chǎn)的治療性單抗產(chǎn)品有2個(gè),另3個(gè)正處于臨床試驗(yàn)階段,多個(gè)單抗藥物處于臨床前研究階段,已批準(zhǔn)的診斷性單抗有31個(gè)。8.1克隆抗體注射用鼠源性抗人T淋巴細(xì)胞CD3抗原單克隆抗體(OKT3),免疫抑制劑,可逆轉(zhuǎn)對(duì)移植器官的排斥反應(yīng);恩博克乳膏(抗人白細(xì)胞介素-8單克隆抗體),用于銀屑病。8.2肺癌單抗免疫治療劑碘人鼠嵌合型腫瘤細(xì)胞單克隆抗體注射液(131I-chTNF,用于實(shí)體瘤;碘131I肝癌單抗免疫診斷和治療劑,用于肝癌的體內(nèi)定向診斷和導(dǎo)向治療;人源化單克隆抗體h-R3,hR3是繼用于治療結(jié)腸癌淋巴癌轉(zhuǎn)移患者的Panorex和用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌Herctptin之后第三個(gè)單克隆抗體實(shí)體瘤治療藥物,比美國(guó)同類藥物Erbitux人源化程度更高。8.3在臨床前研究中，單抗抗CEA嵌合抗體,治療結(jié)腸癌;破傷風(fēng)抗體,預(yù)防破傷風(fēng);抗乙型腦炎單抗,用于乙型腦炎;抗Fabc1027,用于治療肝癌。8.4單克隆抗體hula-332、mabf抗腫瘤壞死因子-α單鏈抗體在大腸桿菌中表達(dá),Mr28000,表達(dá)量占總菌體蛋白的15%;抗腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體2嵌合抗體在CHO細(xì)胞中表達(dá),對(duì)體外培養(yǎng)的人淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞SVT35有顯著的殺傷作用;TNF-α單克隆抗體可以減輕實(shí)驗(yàn)鼠梗阻性黃疸的腎損傷及對(duì)肝肺綜合征實(shí)驗(yàn)大鼠有治療作用;131I-腫瘤細(xì)胞核人鼠嵌合單抗(131I-chTNT)治療12例突發(fā)性膠質(zhì)瘤病人,總有效率66.6%;抗腫瘤壞死因子-α人鼠嵌合單抗(IFX)IFX對(duì)中、重度活動(dòng)性RA患者有較好的短期療效,迅速改善RA患者的病情,尤其對(duì)中度RA患者療效更顯著;抗白細(xì)胞介素6單克隆抗體(anti-IL-6mAb)延長(zhǎng)同種小鼠移植心臟的存活時(shí)間;重組hIL-31抗體,IL-31抗體能使皮膚炎癥中的炎性細(xì)胞減少,血清中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子明顯降低;VEGF受體Ⅱ胞外Ⅲ區(qū)單克隆抗體,能特異阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子與KDR分子的相互作用,有良好的特異性和中和活性;抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2雙價(jià)單鏈抗體(BsFv),在大腸桿菌內(nèi)表達(dá),純度90%,可劑量依賴性抑制HUVEC細(xì)胞增殖,抑制效果優(yōu)于AK404;血管生長(zhǎng)因子VEGF165單克隆抗體,在大腸桿菌表達(dá),mAb能抑制雞胚血管生成,抑制HUVEC遷移及血管形成;人表皮生長(zhǎng)因子受體α人源化單克隆抗體(rhHER2-mAb),在CHO細(xì)胞表達(dá),表達(dá)量(152±20)mg/L,純度95%以上,其活性親和力與赫賽汀相當(dāng);抗表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體(ERCFv),在大腸桿菌表達(dá),表達(dá)量10mg/L,對(duì)腫瘤細(xì)胞具有良好的親和力和一定的生長(zhǎng)抑制作用;bFGF單克隆抗體(MabF),MabF可明顯抑制C57BL/小鼠Lewis肺癌生成及轉(zhuǎn)移,其作用與抑制腫瘤增殖及微血管生成相關(guān);人鼠肉瘤OS-732單克隆抗體,通過(guò)雜交瘤細(xì)胞腹腔注射BALB/C小鼠制備腹水,純化后純度93%,ELISA抗體免疫活性效價(jià)為1×10-7;抗人DR5功能性單克隆抗體(mDRA-6),mDRA-6通過(guò)激活外源性膜受體,繼而啟動(dòng)細(xì)胞線粒體途徑導(dǎo)致Jurkat細(xì)胞凋亡;Aβ1-42單克隆抗體(Aβ1-42mAb),可改善AD大鼠的認(rèn)知功能,其機(jī)制可能與抗原體結(jié)合減少Aβ積聚,亦與調(diào)節(jié)ChAT活性有關(guān)。9預(yù)防免疫反應(yīng)治療性疫苗是一類用于治療疾病而非用于預(yù)防疾病、通過(guò)打破慢性感染者體內(nèi)免疫耐受,重建成增強(qiáng)免疫應(yīng)答的新型疫苗。而預(yù)防性疫苗則主要是用于未感染的健康個(gè)體。世界上第一個(gè)腫瘤治療疫苗——表皮生長(zhǎng)因子(EGF)腫瘤性治療疫苗已于2008年上市。目前世界已有52種腫瘤疫苗正在進(jìn)行臨床I、Ⅱ期研究。9.11乳腺癌和肺癌ICT-107(適應(yīng)癥:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤);VGX-3100(子宮頸非典型增生和癌癥);MAGE-A3(皮膚癌和肺癌);NewVax(同時(shí)聯(lián)合GM-CSF應(yīng)用,推遲低到中等水平乳腺癌患者的疾病復(fù)發(fā)和發(fā)展);AE37(乳腺癌);Nexvax2(乳糜瀉);ADXS-HPV(子宮頸及頭頸部癌);CRS-207(胰腺癌);PEV7(復(fù)發(fā)性外陰道念珠菌病);GI-4000(胰腺癌)。9.2中國(guó)治療性疫苗的進(jìn)展9.2.1口服幽門螺旋桿菌疫苗是我國(guó)率先在世界上研制成功的,具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的口服疫苗,預(yù)防和治療胃幽門螺旋桿菌感染。9.2.2多肽疫苗reeq-th蛋白疫苗(HBsAg+人抗-HBs免疫球蛋白),Ⅲ期臨床;多肽疫苗(MAP短肽,TT830、HBc18~27),Ⅱ期臨床;多肽疫苗(PreS2B細(xì)胞表位,破傷風(fēng)類毒素通用Th表位連接于HBV免疫優(yōu)勢(shì)表位的N-末端及C-末端構(gòu)成的多肽),Ⅱ期臨床;蛋白質(zhì)疫苗(亞單位疫苗+LMS+CIM)、丙肝疫苗、DNA疫苗均處于臨床前階段。9.2.3子宮頸癌的治療插入革登熱病毒RNA,復(fù)制子的抗原基因可以是腫瘤抗原基因和病毒抗原基因,含有這種載體的基因可以預(yù)防和治療腫瘤及病毒性疾病。9.2.4艾滋病毒DNA-天壇痘苗復(fù)合型愛(ài)滋病疫苗,已完成Ⅱ期臨床試驗(yàn);DNA/MAV載體愛(ài)滋病疫苗已完成Ⅱ期臨床試驗(yàn)。9.2.5瘧疾原生動(dòng)物感染與肺癌dna疫苗聯(lián)合使用該機(jī)制有可能用于肺癌的免疫治療,也可能作為攜帶抗原的新載體用于開(kāi)發(fā)新型有效的治療性肺癌疫苗。9.2.6基因疫苗mage-1、il-18人和鼠可溶性VEGFR2的雙基因疫苗(pVITRO2-hm-sVEGFR2),該疫苗能明顯抑制新生血管生成活性,其作用大于人和鼠的單基因疫苗;PVAX-MAGE-1基因疫苗,可顯著延緩移植性H22腹水瘤及實(shí)體瘤在子宮體內(nèi)的生長(zhǎng),其抑瘤作用與提高T淋巴細(xì)胞IL和IFN表達(dá),增強(qiáng)對(duì)腫瘤的殺傷作用有關(guān);共表達(dá)基因疫苗MAGE-1/IL-18抗腫瘤疫苗,該疫苗在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)有顯著的誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫作用,對(duì)腫瘤的生成有一定的抑制作用;對(duì)MAGE-1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞有明顯殺傷作用;人乳頭病毒16型E5與IL-12聯(lián)合基因疫苗,該疫苗能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答,聯(lián)合基因疫苗優(yōu)于單基因疫苗;口服人乳頭病病毒18E7與次級(jí)淋巴組織趨化因子聯(lián)合基因疫苗,該聯(lián)合疫苗使荷瘤鼠瘤重降低,生存率延長(zhǎng),其發(fā)揮的抗腫瘤作用可能可增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。9.2.7基因修飾疫苗印記基因PEG10修飾的樹突狀細(xì)胞(DC)疫苗,制備的DC疫苗能有效激發(fā)特異性CTL應(yīng)答,并對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞有明顯的殺傷毒性;GM-CSF修飾腫瘤細(xì)胞疫苗(GVAX),肺癌患者85例治療后Treg比例下降,提高其療效和預(yù)防都較好;新型樹突狀細(xì)胞疫苗,成功構(gòu)建了可同時(shí)沉默SOCS1、HMGR1刺激和腫瘤相關(guān)抗原負(fù)載的新型DC疫苗;樹突狀細(xì)胞疫苗,人外周血單核細(xì)胞用rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-2和IFN-γ誘導(dǎo)擴(kuò)增,CEA相關(guān)多肽致敏,該DC給晚期胃腸道惡性腫瘤患者回輸后1個(gè)月、3個(gè)月,患者的細(xì)胞免疫CD4、CD8和體液免疫IgG、IgM顯著提高,IgA有一定提高;攜帶HPV16E6E7基因的重組腺病毒感染DCs制備基因修飾DC疫苗,該DC具有殺傷子宮頸癌CaSki細(xì)胞的作用;IL-18基因修飾的成熟樹突狀細(xì)胞疫苗,對(duì)卵白蛋白誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥具有一定的預(yù)防作用;IL-2膜表面修飾MB49細(xì)胞疫苗,用蛋白膜錨定技術(shù),該疫苗既可保護(hù)IL-21生