實(shí)驗(yàn)六血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳

醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)使學(xué)生掌握電泳的基本原理學(xué)會薄膜電泳的基本操作掌握血清中不同蛋白質(zhì)的分離方法

本實(shí)驗(yàn)是以醋酸纖維素薄膜作為支持體的區(qū)帶電泳。方法是將少量新鮮血清用點(diǎn)樣器點(diǎn)在浸有緩沖液的乙酸纖維素薄膜上，薄膜兩端經(jīng)過濾紙與電泳槽中緩沖液相連，所用緩沖液pH值為8.6，血清蛋白質(zhì)在此緩沖液中均帶負(fù)電荷，在電場中向正極泳動。由于血清中不同蛋白質(zhì)帶有的電荷數(shù)量及分子量不同而泳動速度不同。帶電荷多及分子量小者泳動速度快；帶電荷少及分子量大者泳動速度慢，從而彼此分離。電泳后，將薄膜取出，經(jīng)染色和漂洗，薄膜上顯示出五條藍(lán)色區(qū)帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)，按泳動快慢順序，各區(qū)帶分別為清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。

經(jīng)洗脫比色觀察不同蛋白質(zhì)的區(qū)帶。實(shí)驗(yàn)原理一、醋酸纖維素薄膜的潤濕和選擇

將2.0cm×8.0cm薄膜放入緩沖液中浸泡20min，整條薄膜顏色一致而無白色斑點(diǎn)，則表明薄膜質(zhì)地均勻(實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選擇質(zhì)地均勻的膜)。

二、制作電橋

將巴比妥緩沖液(pH=8.6)倒入電泳槽內(nèi)，兩槽緩沖液平衡至同一水平面。兩電極槽各放入兩層濾紙，一端浸入緩沖液中，另一端貼附在電泳槽支架上，它們的作用是聯(lián)系薄膜與兩極緩沖液之間的中間“橋梁”。操

作

方

法三、點(diǎn)樣與電泳

取出浸透的薄膜，平放在濾紙上(無光面向上)，輕輕吸去多余的緩沖液。用點(diǎn)樣器蘸取血清，“印”在薄膜的點(diǎn)樣區(qū)（如圖示），點(diǎn)樣區(qū)要呈粗細(xì)均勻一直線。將點(diǎn)好樣的薄膜兩端緊貼在電泳槽支架的濾紙橋上，無光澤面向下，點(diǎn)樣端置負(fù)極，接通電源，電壓160V，電泳25min。點(diǎn)樣區(qū)6.5cm1.5cm四、染色與浸洗

電泳完畢后，切斷電源，用鑷子將薄膜取出，直接浸于氨基黑10B染色液中，10min后取出。再浸泡于漂洗液，反復(fù)漂洗，直至背景無色為止。五、結(jié)果判斷

一般經(jīng)漂洗后，薄膜上可呈現(xiàn)清晰的5條區(qū)帶，由正極端起，依次為清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。六、透明

將薄膜用濾紙吸干或吹風(fēng)機(jī)吹干，浸入透明液中，2min立即取出，緊貼：在載物片上，趕走氣泡。完全干燥后，薄膜完全透明，可作掃描描或照相，將該玻璃板浸入水中，則透明的薄膜可脫下，吸干水分，可長期保存。清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白pI4.885.065.065.126.85-7.3泳動度(cm2/s.v)5.9×10-55.14×10-54.1×10-52.8×10-51.0×10-5分子量(kD)6920030090-150156-300一、試劑

(1)新鮮血清(無溶血現(xiàn)象)(2)巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6)稱取巴比妥1.66g和巴比妥鈉12.76g，溶于少量蒸餾水后定容1000ml。

(3)染色液

稱取氨基黑10B0.5g，加入蒸餾水40ml，甲醇50ml和冰醋酸10ml，混勻，貯存于試劑瓶中。(4)漂洗液

取95％乙醇45ml，冰醋酸5ml和蒸餾水50ml，混勻。(5)透明液

冰乙酸25ml，95％乙醇75ml混勻。(6)洗脫液

0.4mol/LNaOH。二、器材電泳儀、電泳槽、乙酸纖維素薄膜、點(diǎn)樣器、濾紙、剪刀、鑷子、分光光度計(jì)試劑和器材1、醋酸纖維素薄膜一定要充分浸透后才能點(diǎn)樣。點(diǎn)樣后電泳槽一定要密閉。電流不宜過大，以防止薄膜干燥，電泳圖譜出現(xiàn)條痕。2、緩沖溶液離子強(qiáng)度不應(yīng)小于0.05或大于0.07。因?yàn)檫^小可使區(qū)帶拖尾，過大則使區(qū)帶過于緊密。3、電泳槽中緩沖液要保持清潔(