Co-IP技術服務常見問題解析

[在此處鍵入]Co-IP技術服務常見問題解析Co-IP技術服務常見問題解析本文對免疫共沉淀（Co-IP）實驗中常見的問題進行匯總分析，并附有針對性的解決方案1、免疫共沉淀（Co-IP）實驗目的蛋白高背景產(chǎn)生的原因及處理方法?目的蛋白高背景產(chǎn)生的原因有很多種，比如：

(2)有非特異性蛋白結合

(2)轉移膜上的非特異性吸附

針對有非特異性蛋白結合這種情況，我們可以在無血清培養(yǎng)液中裂解細胞，而對于轉移摸上的非特異性吸附，我們就要注意實驗的操作問題，一定要戴手套，用鑷子夾取，以及不接觸轉移膜轉移面。2、免疫共沉淀（Co-IP）實驗失敗的原因及處理方法。答：（1）樣品被蛋白酶降解，應對措施：裂解樣品中加入蛋白酶抑制劑，注意冰上操作，避免反復凍融；

（2）抗體濃度太低，應對措施：調(diào)整抗體濃度，必要時設立濃度梯度，摸索最佳濃度；

（3）抗體親和力低，應對措施：先用合適的抗體；

（4）IP抗體未與agarose珠子結合，應對措施：選用合適的agarose珠子，正確保存防止變質(zhì)或干燥；

（5）Tag未暴露在融合蛋白構象的表面，應對措施：改變?nèi)诤献兇蟛课唬?/p>

（6）裂解液嚴謹度太高，應對措施：改用低嚴謹度的裂解液。3、免疫共沉淀（Co-IP）實驗成敗的關鍵在哪里？答：實驗最需要注意點就是抗體的性質(zhì)。尤其是多抗的特異性是問題；

為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進行實驗；

考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋；

確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的，這需要進行蛋白質(zhì)的定位來確定。4、免疫共沉淀（Co-IP）中抗體怎么選擇？多克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體群（由一個免疫原產(chǎn)生的多個單克隆抗體混合物）抗體抗原信號強度極佳由抗體的親和力決定（極佳或者極弱）極佳特異性通常很好，但有時會有非特異性相互作用極佳，但有時會有交叉反應極佳（由于選擇可以進行IP且沒有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）優(yōu)點親和力高（由于抗體可以與目的蛋白的多個抗原決定簇相互作用）特異性好，且可以無限量供應特異性好，親和力高（由于選擇可以進行IP且沒有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）缺點非特異性相互作用很難去除需要篩選親和力高的抗體；抗原表位可能會被相互作用蛋白遮蔽能夠篩選得到的符合條件的單克隆并不多，所以單克隆抗體群也就不容易獲得免疫沉淀效果極佳（由于親和力高）由抗體的親和力決定（極佳或極弱）極佳（由于選擇可以成功進行IP且沒有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）免疫共沉淀效果通常很好，但有時非特異性相互作用會帶來假陽性有抗體的親和力決定和抗原表位是否被相互作用蛋白遮蔽決定（極佳或極弱）極佳（由于選擇可以成功進行IP且沒有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）染色質(zhì)免疫沉淀效果通常很好，但有時非特異性相互作用會帶來假陽性由抗體的親和力決定和抗原表位是否被遮蔽或者以及抗原表位是否被交聯(lián)實驗所破壞決定（極佳或極弱）極佳（由于選擇可以成功進行IP且沒有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）5、Co-IP實驗中沒有檢測到與目的蛋白相互作用的蛋白或檢測得到的信號太弱？答：裂解液中去垢劑濃度過高或者配方太強烈；

蛋白和蛋白之間的相互作用太弱或不穩(wěn)定。6、IP和CoIP有什么區(qū)別？答：IP是在已知一種蛋白質(zhì)的抗體情況下，直接用這種抗體將目標蛋白質(zhì)提取出來，是一種提純蛋白質(zhì)的方法。

免疫共沉淀（Co-IP）實驗主要用于檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間連接作用，如你想檢測蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B之間是否有相互作用，你手中又有蛋白質(zhì)A的特異抗體，就將蛋白質(zhì)A和抗體加入到含有蛋白質(zhì)B的細胞解液中去，利用抗體提純，如果蛋白質(zhì)A，B之間有相互作用，則最后提純產(chǎn)物是抗體——蛋白質(zhì)A——蛋白質(zhì)B。由于最后終產(chǎn)物是多種蛋白質(zhì)復合物，所以這種技術叫做co-immunoprecipitation，和IP的用途區(qū)別還是很大的。7、免疫共沉淀（Co-IP