皖西白鵝間腦內(nèi)vip免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的數(shù)量變化

皖西白鵝間腦內(nèi)vip免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的數(shù)量變化

血管活動（vip）是一種重要的生物活性物質(zhì)。這是一種自由組合的。相對分子量為3233。它是高血糖素-胰溶菌酶家族的成員。在生物體內(nèi),它具有雙重功能,作為胃腸道激素,具有使平滑肌松弛和舒血管作用;作為神經(jīng)肽激素主要是催乳素(PRL)釋放因子,具有刺激和調(diào)節(jié)PRL釋放的作用。因此,VIP是禽類就巢行為的決定因素。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VIP在日本鵪鶉,雞的脊髓,家鴿和環(huán)鴿中腦、下丘腦等處存在VIP。但未見VIP在鵝間腦分布的報(bào)道,本試驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法觀察到皖西白鵝間腦內(nèi)VIP免疫陽性細(xì)胞存在及不同時期內(nèi)該細(xì)胞數(shù)目的變化規(guī)律,為VIP進(jìn)一步研究和調(diào)控禽類的就巢性提供形態(tài)學(xué)的依據(jù)。1材料和方法1.1石蠟切片制作選用健康成年皖西白鵝15只,體質(zhì)量4.5~6kg,其中就巢組、產(chǎn)蛋組與休產(chǎn)組各5只。術(shù)前稱重后,固定在手術(shù)臺上,從跖靜脈注射戊巴比妥鈉30mg/kg,從另一側(cè)跖靜脈注射3.8%檸檬酸三鈉溶液抗凝血。深度麻醉后,從胸骨正中線剪開胸腔,從主動脈入頸動脈處進(jìn)針,快速灌入400mL0.9%生理鹽水,同時剪開右心房減壓,再注入新鮮配制4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定劑600mL。灌流時先快后慢。灌畢后開顱取腦,若發(fā)現(xiàn)腦組織固定欠佳,可在相同固定液中固定3~4h。制作石蠟切片,要求:組織塊長、寬和厚分別約為1、1、0.5cm,不宜太大。切片的厚度為6μm;切片并注明鵝號和片號(如:2-26,表示第2只鵝的第26塊切片)。1.2生物素化方法取每只鵝的雙號切片用尼氏染色,以確定神經(jīng)核團(tuán)的位置,單切片號切片用來SABC染色(SABC試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司)。SABC法主要操作步驟:(1)切片常規(guī)脫蠟至水;(2)3%H2O2室溫5~10min以滅活內(nèi)源性酶,蒸餾水洗3次;(3)滴加復(fù)合消化液5~10min,蒸餾水洗3次;(4)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20min。甩去多余液體,不洗滌(注意濕盒預(yù)先在20℃中平衡,以下相同);(5)滴加一抗(兔抗VIP1∶150,購于武漢博士德生物工程有限公司),20℃2h,PBS洗滌2min,3次;(6)滴加生物素化山羊抗兔IgG,20℃20min左右,PBS洗滌2min,3次;(7)滴加試劑SABC,20℃20min,PBS洗滌2min,3次;(8)DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒,取1mL蒸餾水,加試劑盒中A、B、C試劑各2滴,混勻后加至切片。室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時間,一般在5~30min,蒸餾水洗滌;(9)蘇木素輕度復(fù)染,2s,立即用水沖洗。用乙醇常規(guī)脫水,二甲苯透明,用中性樹膠封片,顯微鏡觀察。SABC法染色切片和相鄰尼氏染色切片對比,確定染色的核團(tuán)。參照對禽類間腦內(nèi)神經(jīng)核團(tuán)的描述資料加以辨認(rèn)。用Nikon全自動顯微照相裝置對陽性區(qū)域進(jìn)行拍照。1.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的染色用正常小牛血清代替一抗陰性對照,其他步驟與SABC法反應(yīng)步驟一樣,染色結(jié)果為陰性。1.4切片分析在顯微鏡下觀察,并對視上核、室旁核、視上交叉和下丘腦外側(cè)核的VIP陽性神經(jīng)元胞體計(jì)數(shù)。用方差分析處理數(shù)據(jù)。2結(jié)果2.1胞體多為圓形,形貌、大小VIP免疫反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色、棕褐色、胞體清楚,輪廓分明,且胞體多為橢圓形,圓形和棱形等。皖西白鵝間腦VIP陽性神經(jīng)元主要分布在間腦視上核、室旁核、外側(cè)核、圓核、丘腦腹外側(cè)核、視上交叉、下丘腦外側(cè)核、丘腦額束核、螺旋外側(cè)核等處。見圖1。2.2anoa多元方差和lsd多重比較光學(xué)顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)經(jīng)MicrosoftExcel15.0初步整理后,利用SPSS進(jìn)行ANOVA多元方差和LSD多重比較。結(jié)果見表1。由表1可知就巢期間腦VIP神經(jīng)元胞體數(shù)目與產(chǎn)蛋期、休產(chǎn)期及產(chǎn)蛋期與休產(chǎn)期間差異均極顯著。3討論3.1麻黃植物體內(nèi)hpv陽性神經(jīng)元體的檢測王蔭亭等發(fā)現(xiàn)VIP陽性神經(jīng)元在家鴿的間腦中有廣泛分布,主要分布于下丘腦外側(cè)核、蔡氏腹區(qū)、丘腦內(nèi)核。左明雪等發(fā)現(xiàn)在環(huán)鴿的下丘腦外側(cè)核、視前前區(qū)核下丘腦前內(nèi)側(cè)核存在VIP陽性物質(zhì)。日本鵪鶉下丘腦的視前核、視旁核漏斗部存在VIP分泌細(xì)胞。在哺乳動物中,李俊鳳等對金黃倉鼠的研究后發(fā)現(xiàn),外側(cè)膝狀體中沒有VIP陽性神經(jīng)元胞體。在貓間腦中主要分布在:上丘、室周核、室旁核、視上核、交叉上核、弓形核等。本試驗(yàn)在間腦圓核、背外側(cè)核、卵圓核、螺旋外側(cè)核等處也發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞。這可能與研究方法和動物種類不同有關(guān)。3.2prl和cvip細(xì)胞的分離和培養(yǎng)Macnamee等對就巢的矮腳雞去巢24h后,靜脈注射合成的VIP,隨著注射的增加,PRL的水平也明顯的上升,PRL的水平比注射同劑量生理鹽水的高14倍。從產(chǎn)蛋和就巢的矮腳雞中取出垂體前葉后,用VIP溶液進(jìn)行培養(yǎng),與對照組相比,PRL的水平明顯上升。Sharp等通過放射免疫的方法測定了正中隆起及下丘腦內(nèi)側(cè)基部VIP水平,發(fā)現(xiàn)就巢雞的明顯大于產(chǎn)蛋雞的。他們又用免疫組織化學(xué)的方法觀察了下丘腦內(nèi)側(cè)基部的CVIP細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在孵化