新型食品發(fā)酵重點(diǎn)

發(fā)酵的定義狹義“發(fā)酵”的定義在生物化學(xué)或生理學(xué)上發(fā)酵是指微生物在無氧條件下，分解各種有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生能量如葡萄糖在無氧條件下被微生物利用產(chǎn)生酒精并放出二氧化碳。同時(shí)獲得能量，丙酮酸被復(fù)原為乳酸而獲得能量等等。廣義“發(fā)酵”的定義工業(yè)上所稱的發(fā)酵是泛指利用生物細(xì)胞制造某些產(chǎn)品或凈化環(huán)境的過程，它包括厭氧培育的生產(chǎn)過程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通氣〔有氧〕培育的生產(chǎn)過程，如抗生素、氨基酸、酶制劑等的生產(chǎn)。產(chǎn)品即有細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也包括菌體細(xì)胞、酶等。發(fā)酵工程〔FermentationEngineering〕的定義發(fā)酵工程，是利用“生物細(xì)胞”的特定功能，通過現(xiàn)代工程技術(shù)手段〔主要是發(fā)酵罐生產(chǎn)各種特定的有用物質(zhì)，或者把微生物直接用于某些工業(yè)化生產(chǎn)的一種生物技術(shù)體系。這里的“生物細(xì)胞”包括微生物細(xì)胞和動(dòng)物、植物細(xì)胞及其固定化細(xì)胞。因此，發(fā)酵工程使?jié)B透有工程學(xué)的微生物學(xué)，是發(fā)酵技術(shù)的工程化。發(fā)酵工程是化學(xué)工程與生物工程技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，它將微生物學(xué)、生物化學(xué)、化學(xué)工程學(xué)等的根本原理和技術(shù)有機(jī)地結(jié)合在一起，利用微生物進(jìn)展規(guī)模化生產(chǎn)，是生產(chǎn)加工與生物制造實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的核心技術(shù)。發(fā)酵工程技術(shù)主要包括供給高性能生產(chǎn)菌種的菌種技術(shù)、實(shí)現(xiàn)低本錢大規(guī)模生產(chǎn)產(chǎn)品的發(fā)酵技術(shù)和最終獲得合格產(chǎn)品的分別純化技術(shù)。進(jìn)展發(fā)酵工程的關(guān)鍵技術(shù)〔菌種技術(shù)、發(fā)酵技術(shù)和分別技術(shù)〕及重大產(chǎn)品的爭論開發(fā)，將發(fā)揮中國豐富的生物資源優(yōu)勢(shì)，提高發(fā)酵工程的技術(shù)水平，促進(jìn)生物化工、生物醫(yī)藥、食品加工等相關(guān)行業(yè)的產(chǎn)品競爭力和可持續(xù)進(jìn)展。擴(kuò)大培育，發(fā)酵設(shè)備選擇及工藝條件掌握，發(fā)酵產(chǎn)物的分別提取，廢棄物的回收和利用等。發(fā)酵工程的產(chǎn)品可分為以下六大類：〔1〕微生物菌體細(xì)胞如酵母菌、食用菌、微生物農(nóng)藥的生產(chǎn)?！?〕微生物酶類如各種酶種、酶制劑和各種曲類的生產(chǎn)?！?〕微生物代謝產(chǎn)物如初級(jí)代謝產(chǎn)物氨基酸、有機(jī)酸、有機(jī)溶劑、核苷酸、蛋白質(zhì)、核酸和維生素等，次級(jí)代謝產(chǎn)物抗生素、生物堿和植物激素的生產(chǎn)等?！?〕微生物的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物利用微生物代謝過程中的某一種酶或酶系將一種化合物轉(zhuǎn)化成含有特別功能基團(tuán)產(chǎn)物的生物化學(xué)反響。如將甘油轉(zhuǎn)化為二羥基丙酮，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，將山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖等。特別是甾體激素的轉(zhuǎn)化受到了廣泛的重視?！?〕工程菌發(fā)酵產(chǎn)物2070年月興起的基因工程和細(xì)胞工程，取得了飛躍的進(jìn)展。通過基因工程和細(xì)胞工程制造出許很多多的具有特別功能的“工程菌”，用發(fā)酵技術(shù)可以生產(chǎn)出更多更好的產(chǎn)品，發(fā)揮更大的經(jīng)濟(jì)效益?！?〕酶，利用植物細(xì)胞培育技術(shù)生產(chǎn)自然食用色素等。發(fā)酵的類型依據(jù)發(fā)酵的特點(diǎn)和微生物對(duì)氧的不同需要，可以將發(fā)酵分成假設(shè)干類型：(1)按發(fā)酵原料來區(qū)分：糖類物質(zhì)發(fā)酵、石油發(fā)酵及廢水發(fā)酵等類型。(2)按發(fā)酵產(chǎn)物來區(qū)分：如氨基酸發(fā)酵、有機(jī)酸發(fā)酵、抗生素發(fā)酵、酒精發(fā)酵、維生素發(fā)酵等。(3)按發(fā)酵形式來區(qū)分，則有：固態(tài)發(fā)酵和深層液體發(fā)酵。(4)按發(fā)酵工藝流程區(qū)分則有：分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵和流加發(fā)酵。(5)按發(fā)酵過程中對(duì)氧的不同需求來分，一般可分為：厭氧發(fā)酵和需氧發(fā)酵〔通風(fēng)發(fā)酵〕兩大類型。發(fā)酵工程的特點(diǎn)〔1〕發(fā)酵工程使用的原料來源廣泛，多為農(nóng)副產(chǎn)品，其中以碳源為主，只參加少量有機(jī)和無機(jī)氮源，不含有毒物質(zhì)?！?〕發(fā)酵工程的反響過程比較溫順，通常在常溫、常壓下進(jìn)展。而且，反響過程是以生物體的自身調(diào)整方式進(jìn)展，多個(gè)反響就像是一個(gè)反響一樣，可在單一設(shè)備中進(jìn)展，因此一種設(shè)備可有多種用途?！?〕簡潔進(jìn)展簡單的高分子化合物的生產(chǎn)，如酶、化學(xué)活性體等。〔4〕能夠高度選擇性地進(jìn)展復(fù)制化合物在特定部位的反響，如甾體化合物的氧化、復(fù)原等。〔5〕生產(chǎn)產(chǎn)品的微生物菌體本身也可作為發(fā)酵產(chǎn)物。例如，富含蛋白質(zhì)、酶、維生素的單細(xì)胞蛋白等?！?〕發(fā)酵過程是純種培育過程。生產(chǎn)中使用的設(shè)備、管道、截門和培育基都必需嚴(yán)格滅菌，通入的空氣也應(yīng)當(dāng)是無菌空氣。在操作中應(yīng)特別留意嚴(yán)格防止污染，尤其要防止噬菌體的侵入，否則，會(huì)引起重大的損失?！?〕生產(chǎn)力量，可以到達(dá)事半功倍的效果?！?〕在發(fā)酵生產(chǎn)中，還可以通過改進(jìn)工藝技術(shù)和設(shè)備來提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量?；谝陨咸攸c(diǎn)，工業(yè)發(fā)酵日益引起人們重視。和傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝相比，現(xiàn)代發(fā)酵工程除了上述的發(fā)酵特征之外更有其優(yōu)越性。除了使用微生物外，還可以用動(dòng)植物細(xì)胞和酶，也可以用人工構(gòu)建的“工程菌’來進(jìn)展反響；反響設(shè)備也不只是常規(guī)的發(fā)酵罐，而是以各種各樣的生物反響器而代之，自動(dòng)化連續(xù)化程度高，使發(fā)酵水平在原有根底上有所提高和和創(chuàng)。發(fā)酵工程也有一些問題需要引起重視：〔1〕中除了有四環(huán)素外，還會(huì)有金霉素、差向四環(huán)素、脫水四環(huán)素等副產(chǎn)物。這些副產(chǎn)物的存在，給提取和精制帶來了肯定的困難?！?〕一方面受細(xì)胞自身的影響，所以工藝掌握比較困難，生產(chǎn)波動(dòng)比較大。〔3〕發(fā)酵工程需要的關(guān)心設(shè)備多，如空氣壓縮機(jī)、空氣凈化系統(tǒng)、冷卻水系統(tǒng)、滅菌用蒸汽系統(tǒng)等。因此，動(dòng)力費(fèi)用比較高?！?〕發(fā)酵中，由于底物濃度不能過高，導(dǎo)致需要使用大體積的反響器。〔5〕發(fā)酵廢液中具有較高的CODBOD，排放前，必需經(jīng)過處理。發(fā)酵工程的應(yīng)用范圍〔1〕發(fā)酵工程在食品工業(yè)上的應(yīng)用食品工業(yè)是世界上最大的工業(yè)之一，也是微生物技術(shù)最先開發(fā)應(yīng)用的領(lǐng)域。例如以糖類物質(zhì)為主要原料釀造葡萄酒、白酒、黃酒和啤酒，以牛奶為原料生產(chǎn)奶酒、奶酪、酸奶等發(fā)酵乳制品，以淀粉類物質(zhì)為主要原料生產(chǎn)谷氨酸、賴氨酸等，以豆類和谷物為原料生產(chǎn)醬油、醋、腐乳和泡菜等，以及用各種原料生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白等。近年來，發(fā)酵工程應(yīng)用于食品生產(chǎn)和開發(fā)，促進(jìn)了食品工業(yè)的飛速進(jìn)展，主要表達(dá)在四個(gè)方面：一是對(duì)食品資源的改造與改進(jìn)；二是將農(nóng)副原材料加工成商品，如酒類、調(diào)味品等發(fā)酵產(chǎn)品；三是對(duì)產(chǎn)品進(jìn)展二次開發(fā)，形成的產(chǎn)品，如很多食品添加劑等；四是對(duì)傳統(tǒng)食品加工工藝進(jìn)展改造，降低能耗，提高產(chǎn)率，改善食品品質(zhì)等。發(fā)酵工程的進(jìn)展史1.6.1自然發(fā)酵階段 19世紀(jì)，人們利用自然發(fā)酵現(xiàn)象，從事釀酒、醬、醋、奶酪等“發(fā)酵”的本質(zhì)的了解，直到19世紀(jì)末仍舊是一知半解。因此，當(dāng)時(shí)完全是憑閱歷而進(jìn)展家庭作坊式生產(chǎn)，時(shí)常被雜菌污染所困擾?？梢?9飲料酒、酒精、醬、醬油、醋、干酪、酸乳及酵母等。多數(shù)產(chǎn)品為嫌氣發(fā)酵，非純種培育，憑閱歷傳授技術(shù)，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定是這個(gè)階段的特點(diǎn)。1.6.2微生物純培育技術(shù)的建立-列文虎克(AntonievanLeeuwenhoek)〔當(dāng)時(shí)被稱為微小動(dòng)物20019世紀(jì)中葉，巴斯德通過著名的Pasteur試驗(yàn)，證明白發(fā)酵原理，指動(dòng)身酵現(xiàn)象是微小生命體進(jìn)展的化學(xué)反響。其后，他連續(xù)對(duì)當(dāng)時(shí)的乳酸發(fā)酵、酒精發(fā)酵、葡萄酒釀造、食醋制造等各種發(fā)酵現(xiàn)象進(jìn)展?fàn)幷摚鞔_了這些不同“酒精發(fā)酵〔醋酸菌〕”免受酸敗之苦。巴斯德也因此被人們譽(yù)為“發(fā)酵之父”?！睟refeld〕〔1872年〔Hansen〕建立了啤酒酵母的純粹培育發(fā)酵1878年；柯赫KochR〕完成了細(xì)菌純粹培育技術(shù)〔1872年，從而確立了單種微生物的分別和純粹培育技術(shù)，使發(fā)酵技術(shù)從自然發(fā)酵轉(zhuǎn)變?yōu)榧兇馀嘤l(fā)酵。為此，人們?cè)O(shè)計(jì)了便于滅除其他雜菌的密閉式發(fā)酵罐以及其他滅菌設(shè)備，開頭了乙醇、甘油、丙酮、丁醇、乳酸、檸檬酸、淀粉酶和蛋白酶等的微生物純種發(fā)酵生產(chǎn)，與巴斯德以前的自然發(fā)酵是兩個(gè)迥然不同的概念。此階段稱為發(fā)酵工程的第一個(gè)里程碑——以微生物的純種培育技術(shù)為主要特征。1.6.3微生物液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)的建立1929年，弗萊明〔FlemingA〕覺察了青霉菌能抑制其菌落四周的細(xì)菌生長的現(xiàn)象，并證明白青霉素的存在。但由于當(dāng)時(shí)青霉素的產(chǎn)量格外低，并未受到廣泛重視。其1940年，錢恩〔ChainEB〕和弗洛里〔FloreyH〕兩位博士精制出青霉素，并確認(rèn)青霉素對(duì)傷口感染癥比當(dāng)時(shí)的磺胺藥劑更具療效，加上其次次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，青霉素作為醫(yī)治戰(zhàn)傷感染的藥物而大力推動(dòng)了青霉素的工業(yè)化生產(chǎn)和爭論，成功創(chuàng)立了液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)。承受液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)，再配以離心、溶劑萃取和冷凍干燥等技術(shù)，使青霉素的生產(chǎn)水平有了很大提高，其中發(fā)酵水平從液體淺盤發(fā)酵的40U·mL-1200U·mL-1〔1943年。隨后，鏈霉素、金霉素等抗生素相繼問世，抗生素工業(yè)快速崛起。此階段稱為發(fā)酵工程的其次個(gè)里程碑——以微生物液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)為主要特征。1.6.4微生物酶轉(zhuǎn)化及代謝調(diào)控技術(shù)的應(yīng)用1950年—1960飛速進(jìn)展，再加上型分析方法和分別方法的進(jìn)展，發(fā)酵工程領(lǐng)域有了兩個(gè)顯著進(jìn)步。其一是承受微生物進(jìn)展甾體化合物的轉(zhuǎn)化技術(shù)，其二是以谷氨酸等發(fā)酵生產(chǎn)成將載體轉(zhuǎn)化成副腎上腺皮質(zhì)激素、性激素等技術(shù)，進(jìn)展了格外廣泛爭論，結(jié)果幾個(gè)1956年由日本的木下祝郎弄清楚了生物素對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響，在培育基中限量供給生物素影響了膜磷脂的合成，1957年，日本將這一技術(shù)應(yīng)用到谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，從而首先實(shí)現(xiàn)了L-谷氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)。谷氨酸工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的成功促進(jìn)了代謝調(diào)控理論的爭論，承受養(yǎng)分缺陷型及類似物抗性突變株實(shí)現(xiàn)了L-賴氨酸、L-蘇氨酸等的工業(yè)化生產(chǎn)。此階段稱為發(fā)酵工程的第三個(gè)里程碑——以微生物酶轉(zhuǎn)化及代謝調(diào)控技術(shù)為主要特征。1.6.5微生物發(fā)酵原料的拓寬1960年~1970年這段時(shí)期，微生物代謝調(diào)控技術(shù)在發(fā)酵工程中得到了廣泛的應(yīng)用，發(fā)酵原料多樣化開發(fā)爭論的開展，促進(jìn)了單細(xì)胞蛋白發(fā)酵工業(yè)的興起，使發(fā)酵原料由過去單一性碳水化合物向非碳水化合物過渡。從過去僅僅依靠農(nóng)產(chǎn)品的狀況，過渡到從工廠、礦業(yè)資源中查找原料，開拓了非糧食〔如甲醇、甲烷、氫氣等〕發(fā)酵技術(shù)，拓寬了原料來源的途徑。此時(shí)期稱為發(fā)酵工程的第四個(gè)里程碑——以發(fā)酵原料的轉(zhuǎn)變或拓寬為主要特征。1.6.6微生物基因工程育種1953年，WatsonJDCrickFHC提出了DNA的雙螺旋構(gòu)造，為基因重組奠定了2070DNA技術(shù)的進(jìn)展，人們可以按預(yù)定方案把外源目的基因克隆到簡潔大規(guī)模培育的微生〔如大腸桿菌、酵母菌〕細(xì)胞中，通過微生物的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，即可得到原先只有動(dòng)物或植物才能生產(chǎn)的物質(zhì)，如胰島素、干擾素、白細(xì)胞介素和多種細(xì)胞生長因子等。從過去繁瑣的隨機(jī)選育生產(chǎn)菌株朝著定向育種轉(zhuǎn)變，這給發(fā)酵工程帶來了劃時(shí)代的變革，被稱為發(fā)酵工程的第五個(gè)里程碑——以引入基因工程，到達(dá)微生物定向育種為主要特征。思 考 題什么是發(fā)酵？發(fā)酵工程是指什么？發(fā)酵工程經(jīng)受了幾個(gè)主要的進(jìn)展階段？發(fā)酵工程的內(nèi)容及特點(diǎn)是什么？2章發(fā)酵工業(yè)菌種選育工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)水平的凹凸取決于生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝和后提取工藝三個(gè)因素，其中擁有良好生產(chǎn)菌種是前提，菌種質(zhì)量好壞直接影響了發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量、質(zhì)量及其本錢。例如，青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)，在投產(chǎn)之初只有40U·mL-1，得到黃色晶體，青霉素純度很低，價(jià)比黃金；而現(xiàn)在承受型菌種可以到達(dá)60000U·mL-1以上，得到晶體為純95%0.1元。青霉素發(fā)酵生產(chǎn)的這種質(zhì)的飛躍，生產(chǎn)所用菌種在其中起了關(guān)鍵作用。菌種選育有何意義？菌種選育的意義：供給產(chǎn)量提高產(chǎn)品質(zhì)量改善加工工藝和開發(fā)產(chǎn)品。在科學(xué)爭論中，通過菌種選育還可以了解菌種的遺傳學(xué)性質(zhì)代謝作用是生物體維持生命活動(dòng)過程中的一切生化反響的總稱，是生命活動(dòng)的最根本特征，與生命的存在、進(jìn)展嚴(yán)密相聯(lián)。依據(jù)代謝產(chǎn)物的生理作用不同，將代謝分為初級(jí)代謝和次級(jí)代謝兩種類型。初級(jí)代謝主要是指把養(yǎng)分物質(zhì)轉(zhuǎn)化為機(jī)體構(gòu)造和生理活性物質(zhì)以及供給能量的代謝作用。微生物通過初級(jí)代謝途徑，產(chǎn)生微生物自身生長生殖所必需的代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物稱為初級(jí)代謝產(chǎn)物。初級(jí)代謝產(chǎn)物包括分解或合成過程中的各種中間代謝物、前提物、高分子物質(zhì)以及能量代謝和代謝調(diào)控中起作用的各種物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、多糖和核酸等。次級(jí)代謝是微生物在肯定的生理階段消滅的一種特別代謝類型，是某些微生物為了避開在代謝過程中某些代謝產(chǎn)物的積存造成的不利作用，而產(chǎn)生的一類有利于生存的代謝類型。次級(jí)代謝產(chǎn)物通常是在生長后期合成。次級(jí)代謝產(chǎn)物是通過次級(jí)代謝合成的產(chǎn)物，如抗生素、生物堿、色素、激素和毒素等，這些產(chǎn)物是對(duì)微生物本身無明顯生理作用或?qū)ψ陨砩L是非必需的，但對(duì)產(chǎn)生菌的生存可能有肯定價(jià)值。工業(yè)發(fā)酵對(duì)生產(chǎn)菌種的一般要求〔1〕安全性。〔2〕有在較短的發(fā)酵周期內(nèi)產(chǎn)生大量發(fā)酵產(chǎn)物的力量?！?〕物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，削減分別純化的難度，降低本錢，提高產(chǎn)品的質(zhì)量。〔4〕生長生殖力量強(qiáng)，生長、反響速度快，發(fā)酵周期短，產(chǎn)孢菌應(yīng)具有較強(qiáng)的產(chǎn)孢子力量?！?〕原料來源廣，價(jià)格低廉，菌種能高效地將原料轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品?！?〕對(duì)需要添加的前體物質(zhì)有耐受力量，并不能將前體作為一般碳源利用?！?〕菌種純，遺傳特性穩(wěn)定，抗噬菌體力量強(qiáng)，以保證發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品的穩(wěn)定性。工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)菌種來源從自然界分別篩選。自然界是菌種和優(yōu)良菌種的寶庫。但一般從自然界直接分別到的菌種，大多數(shù)不能馬上適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)需要。由于在正常生理?xiàng)l件下，微生物的主要特性是快速生長和生殖，但是，發(fā)酵工業(yè)的目的主要是積存大量的代謝產(chǎn)物。因此從自然界分別到的菌種往往要通過菌種改進(jìn)即菌種選育，才能得到符合工藝要求的菌種。從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得。這些菌種離生產(chǎn)工藝要求已根本接近或接近，稍加選育即簡潔獲得優(yōu)良菌種，可節(jié)約人力和時(shí)間。從生產(chǎn)過程中已有菌種中篩選發(fā)生正突變的優(yōu)良菌種。化。選擇和培育適合的優(yōu)良菌種是重要的環(huán)節(jié)。菌種選育就是依據(jù)生產(chǎn)的要求，依據(jù)微生物遺傳和變異的理論，用自然或人工的方法造成菌種變異，再經(jīng)過篩選而到達(dá)菌種改進(jìn)的目的。菌種選育方法主要包括自然選育、誘變育種、雜交育種和基因工程育種。自然選育概念：〔SpontaneonsMutatiton〕而進(jìn)展菌種篩選的過程，稱為自然選育或自然分別。自然突變就是指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變。稱它為自然突變絕不意味著這種突變是沒有緣由的。一般認(rèn)為引起自然突變有兩個(gè)緣由：即多因素低劑量的誘變效應(yīng)和互變異構(gòu)效應(yīng)。所謂多因素低劑量的誘變效應(yīng)，是指自然突變實(shí)質(zhì)上是由一些緣由不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長期綜合效應(yīng)，例如布滿宇宙空間的各種短波輻射、自然界中普遍存在的一些低濃度誘變物質(zhì)以及微生物自身代謝活動(dòng)中所產(chǎn)生的一些誘變物質(zhì)〔如過氧化氫〕的作用等。所謂互變異構(gòu)效應(yīng)是指四種堿基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶〔T〕和鳥嘌呤〔G〕可以酮式或烯醇式消滅，胞嘧啶〔C〕和腺嘌呤〔A〕可以氨基式或亞氨基DNA雙鏈構(gòu)造中以AT和GC堿基對(duì)為主。可是在偶然狀況下，TDNA復(fù)制到達(dá)這一位DNA多聚酶的作用，在它的相對(duì)位置上就不消滅AG。同樣，假設(shè)C以稀有的亞氨基形式消滅，在合成的DNA單鏈的相對(duì)位置上就將是A而不是G。這或許就是發(fā)生相應(yīng)的自然突變的緣由。由于在任何一瞬間，某一堿基是處于酮式或烯醇式還是氨基式或亞氨基式狀態(tài)目前還無法推測，所以要預(yù)言在某一時(shí)間、某一基因?qū)?huì)發(fā)生自然突變是難以做到的。但是，人們對(duì)這些偶然大事作了大量統(tǒng)計(jì)分析后，還是可以覺察并把握其中規(guī)律的。例如，據(jù)統(tǒng)計(jì)，堿基對(duì)10-8~10-9。自然突變有兩種狀況，一種是生產(chǎn)上所不期望有的，表現(xiàn)為菌種的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降；另一種是對(duì)生產(chǎn)有益的。為此，為了確保生產(chǎn)水平不致下降，生產(chǎn)菌株經(jīng)過肯定時(shí)期的使用后須純化，淘汰衰退的；保存優(yōu)良的菌種。這就是通常所指的菌株的自然分別。自然選育是一種簡潔易行的選育方法，它可以到達(dá)純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量的目的。但是自然選育的最大缺點(diǎn)是效率低、進(jìn)展慢，很難使生產(chǎn)水平大幅度的提高。因此，常常把自然選育和誘變育種交替使用，這樣可以收到良好的效果。自然選育〔自然分別〕的一般程序，是把菌種制備成單孢子懸浮液，經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂屢院?，在固體平板上進(jìn)展分別，挑取局部單菌落進(jìn)展生產(chǎn)力量的測定，經(jīng)反復(fù)篩選，以確定生產(chǎn)力量更高的菌株代替原來的菌株。自然選育的菌種來源于自然界、菌種保藏機(jī)構(gòu)或生產(chǎn)過程，從自然界中選育菌種的過程較為簡單，而從生產(chǎn)過程或菌種保藏機(jī)構(gòu)得到菌種的自然選育過程較為簡潔。因此，下面以從自然界中選育菌種的過程為例，闡述菌種自然選育的主要步驟。其具體做法一般分為四個(gè)步驟：樣品采集、增殖培育、純種分別和篩選等。假設(shè)產(chǎn)物與食品制造有關(guān)，還要對(duì)菌種進(jìn)展毒性鑒定2-2。土壤往往是首選的采集目標(biāo)微生物的養(yǎng)分需求和代謝類型與其生長環(huán)境有很大關(guān)系。富集培育由于采集樣品中各種微生物數(shù)量有很大差異，假設(shè)估量到要分別的菌種數(shù)量不多時(shí)，就要富集培育。假設(shè)采集樣品中需要的菌種原來就多，就不需要再作富集培育，直接進(jìn)展分別即可；假設(shè)一次增殖數(shù)量不夠，可以連續(xù)進(jìn)展富集培育，直至到達(dá)分別要求。為了所需菌種增殖后在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，一般人為地參加肯定的限制因素。該種限制因素需依據(jù)具體狀況而定。常用的有兩種方法，一是掌握肯定的養(yǎng)分，二是掌握肯定的培育條件。掌握培育基的養(yǎng)分是依據(jù)目的菌種的養(yǎng)分特性，在增殖培育基中參加相應(yīng)的底物作為唯一碳源或氮源，樣品中能夠分解利用底物的菌株因養(yǎng)分充分而快速生殖，而其他微生物則由于不能分解利用底物致生長受到抑制。富集培育基的選擇性只是相對(duì)富集培育還可以通過掌握肯定培育條件以到達(dá)有效分別的目的?？沙惺芨邷亍⒏邏?、參加抗生素等方法抑制非目的菌株的生長，以使目的菌株的比例增加。所以增殖培育在菌種選育過程中是很關(guān)鍵的一步。常用的純種分別方法有三種，即劃線分別法、稀釋分別法和組織分別法。要在平板上得到純的菌落，關(guān)鍵步驟是制備單孢子或菌體懸浮液。微生物，如霉菌。組織分別法適用于分別高等真菌。在具體應(yīng)用中承受哪種方法狀況而定。培育條件的掌握：①養(yǎng)分成分掌握②掌握培育基的酸堿度③添加抑制劑④熱處理⑤掌握培育溫度⑥通氣條件的掌握初篩可分為兩種狀況進(jìn)展平板篩選搖瓶發(fā)酵篩選微生物選擇性分別的原理和方法在菌種的分別篩選過程中，為了提高篩選的效率，通常要依據(jù)菌種的特性，設(shè)計(jì)具有選擇性的分別篩選方案，通過掌握養(yǎng)分和培育條件以有利于待分別菌株的生長和抑制非目的微生物的生長，或通過添加顯色劑、指示劑以便利待分別菌株的選擇。在常見選擇性分別方法中，除了掌握培育基養(yǎng)分成分和掌握培育條件外，還有依據(jù)目的微生物的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反響來設(shè)計(jì)選擇培育基，通過觀看微生物在選擇培育基上生長狀況或生化反響進(jìn)展分別的方法。這種利用平板的生化反響進(jìn)展分別的方法有以下幾種：①變色圈法;②透亮圈法;③生長圈法;④抑菌圈法.承受抑菌圈法，不僅能篩選抗生素，還能篩選某些酶類。誘變育種誘變育種的根本原理誘變育種的理論根底是基因突變。所謂基因突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。突變主要包括染色體畸變和基因突變兩大類。染色體畸變是指染色體或DNA片段的缺失、易位、逆位、重復(fù)等，而基因突變是DNA分子構(gòu)造中的某一部位發(fā)生變化〔又稱點(diǎn)突變。依據(jù)突變發(fā)生的緣由又可分為自然突變和誘發(fā)突變。所謂自然突變是指在自然條件下消滅的基因突變，而誘發(fā)突變是指用各種物理、化學(xué)因素人工誘發(fā)的基因突變。誘變因素的種類很多，有物理的、化學(xué)的和生物的三2-6。經(jīng)誘變處理后，微生物的遺傳物質(zhì)，DNA和RNA的化學(xué)構(gòu)造發(fā)生轉(zhuǎn)變，從而引起微生物的遺傳變異。由于引進(jìn)了誘變劑的處理，故誘變育種使菌種發(fā)生突變的頻率誘變育種的一般步驟利用各種誘變劑處理微生物細(xì)胞，提高基因的隨機(jī)突變頻率，擴(kuò)大變異幅度，通過肯定的篩選方法，獵取所需要優(yōu)良菌株的過程，稱為誘變育種。誘變育種包括誘變和篩選兩個(gè)局部。誘變局部包括由動(dòng)身菌株開頭，制出穎孢子懸浮液〔或細(xì)菌懸液〕作誘變處理，然后以肯定稀釋度涂平皿，至平皿上長出單菌落等各步驟。因誘發(fā)突變是使用誘變劑促使菌種發(fā)生突變，所以誘發(fā)所形成的突變與菌種本身的遺傳背景、誘變劑種類及其劑量的選擇和合理使用方法均有親熱關(guān)系，亦可說這三者是誘變局部的關(guān)鍵所在。篩選局部包括經(jīng)單孢子分別長出單菌落后隨機(jī)挑至斜面，經(jīng)初篩和復(fù)篩進(jìn)展生產(chǎn)能力測定和菌種保存〔馬上篩選出來的高產(chǎn)菌種保藏好。因此，可以認(rèn)為，誘變育種的整個(gè)過程主要是誘變和篩選的不斷重復(fù)，直到獲得比較抱負(fù)的高產(chǎn)菌株。最終經(jīng)考察其穩(wěn)定性、菌種特性、最適培育條件等后，再進(jìn)一步進(jìn)展中試、放大。誘變育種應(yīng)留意的問題 誘變成功的關(guān)鍵包括動(dòng)身菌株的選擇、誘變劑種類和劑量的選擇，以及合理的使用方法等?！?〕動(dòng)身菌株的選擇〔parentstrai生產(chǎn)性狀的力量或潛力、對(duì)誘變劑的敏感性大、變異幅度廣等條件。動(dòng)身菌株通常有三種：一是從自然界分別得到的野生型菌株；二是通過生產(chǎn)選育，即由自發(fā)突變經(jīng)篩選而得到的高產(chǎn)菌株；三是已經(jīng)誘變過的菌株，這類菌株作為動(dòng)身菌株較為簡單，一般認(rèn)為已經(jīng)誘變獲得的高產(chǎn)菌株，再誘變易產(chǎn)生負(fù)突變，再度提高產(chǎn)量比較困難，但有些高產(chǎn)突變往往需要經(jīng)過逐步累積的過程，進(jìn)展多步誘變可以獲得高產(chǎn)菌株。誘變因素的選擇在微生物誘變育種中，誘變處理主要承受物理誘變劑和化學(xué)誘變劑。目前常用的誘變劑主要有紫外線、γ射線、硫酸二乙酯、亞硝基胍和亞硝基甲基脲等。后兩種因有突出的誘變效果，被譽(yù)為“超誘變劑”。誘變的方法有單一誘變劑處理和復(fù)合誘變劑處理。選擇誘變劑時(shí)應(yīng)考慮使用的便利性和有效性，假設(shè)經(jīng)過誘變，正突變株消滅率較高，所用的誘變劑則為有效誘變劑。對(duì)于野生菌株，使用單一誘變因素有可能取得較好的效果；但是，對(duì)于已經(jīng)誘變過的菌株，單一誘變因素重復(fù)使用的效果不佳，這時(shí)可利用兩種以上誘變因素交替使用，以提高誘變效果。誘變劑劑量的選擇各種誘變劑有不同的劑量表示方法，例如，紫外線的強(qiáng)度是爾格〔1erg=10-7，X〔R〕或拉德(rad)的濃度和處理時(shí)間來表示。但是，僅承受誘變劑的理化指標(biāo)掌握誘變劑的用量常會(huì)造成偏差，不利于重復(fù)操作。誘變劑的劑量與致死率有關(guān)，而致死率又與誘變率有肯定關(guān)系，因此，可用致死率作為各種誘變劑的相對(duì)劑量，用以選擇各種誘變劑的劑量。對(duì)不同的微生物使用的劑量不同，通常狀況下，高劑量誘變劑處理后獲得的負(fù)突變率較高，而在偏低的劑70%~80%時(shí)的劑量。但是，在多核細(xì)胞中，仍舊承受高劑量，由于在高劑量誘變時(shí)，除個(gè)別核發(fā)生突變外，其他核均被致死，可形成較純的變異菌株，同時(shí)也造成遺傳物質(zhì)的巨大損傷，可削減回復(fù)突變。單孢子〔或單細(xì)胞〕懸液的制備誘變育種要求所處理的細(xì)胞必需是處于對(duì)數(shù)生長期同步生長的細(xì)胞，并且是均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液。細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)誘變處理睬產(chǎn)生很大的影響，細(xì)菌一般在對(duì)數(shù)生長期的誘變處理效果較好，而霉菌和放線菌的分生孢子在稍加萌發(fā)時(shí)進(jìn)展誘變處由于在很多微生物的細(xì)胞內(nèi)同時(shí)含有幾個(gè)核，即使使用單細(xì)胞懸液進(jìn)展誘變處理，還是簡潔消滅不純的菌落。因此，獲得單細(xì)胞懸液的方法必需具有針對(duì)性，對(duì)產(chǎn)孢子或芽孢的微生物最好承受其孢子或芽孢。例如，誘變霉菌或放線菌時(shí)，應(yīng)處理它們的孢子；誘變芽孢桿菌時(shí)，應(yīng)處理它們的芽孢。常用的物理誘變劑處理方法紫外線誘變?chǔ)蒙渚€誘變太空育種常用的化學(xué)誘變劑處理方法亞硝酸誘變亞硝基胍〔NTG〕誘變雜交育種雜交育種一般指兩個(gè)基因型不同的菌株通過結(jié)合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重組合，從中分別和篩選出具有性狀的菌株。雜交育種是選用性狀的供體菌株和受體菌株作為親本，把不同菌株的優(yōu)良性狀集中于組合體中。因此，雜交育種具有定向育種的性質(zhì)。原生質(zhì)體融合就是用酶法將細(xì)胞膜外的細(xì)胞壁除掉——原生質(zhì)體，將兩種來源于微生物細(xì)胞A和B的原生質(zhì)體，在融合誘導(dǎo)劑〔或促進(jìn)劑〕例如聚乙二醇和Ca2+等溶液中等量混合起來，使原生質(zhì)體外表形成電極性，相互之間易于吸引、脫漸增大而實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體融合。原生質(zhì)體融合技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)：〔1〕去除了細(xì)胞壁的障礙，親株基因組直接融合，交換，實(shí)現(xiàn)重組，不需要有的遺傳系統(tǒng)。即使是一樣接合型的真菌細(xì)胞也能發(fā)生原生質(zhì)體的相互融合，并可對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)展轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染?！?〕四個(gè)，這是一般常規(guī)雜交所達(dá)不到的?！?〕重組頻率特別高，由于有聚乙二醇等作助溶劑?！?〕再組合到一個(gè)單株中?！?〕可以用溫度、藥物、紫外線等處理、鈍化親株的一方或雙方，然后使之融合，再在再生菌落中篩選重組子。這樣往往可以提高篩選效率。菌種保藏的原理菌種退化：是指優(yōu)良菌種的群體中消滅某些生理特征和形態(tài)特征漸漸減退或喪失，而表現(xiàn)為目的代謝產(chǎn)物合成力量下降的現(xiàn)象。在形態(tài)上，常有分生孢子削減或菌落顏色的轉(zhuǎn)變，如放線菌和霉菌在斜面上經(jīng)過屢次傳代后產(chǎn)生了“光禿型”。在生理上，有的是菌種的發(fā)酵力〔如糖、氮的消耗力量〕下降，有的是生殖力〔如孢子的產(chǎn)生力量〕下降，有的是發(fā)酵產(chǎn)品得率下降，有的是抗不良環(huán)境力量減弱，全部這些都給發(fā)酵生產(chǎn)帶來不利影響。菌種退化不是突然發(fā)生的，而是從量變