食品微生物實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)

食品微生物試驗(yàn)室操作手冊(cè)簡(jiǎn)介了微生物試驗(yàn)中使用的原則菌的驗(yàn)收、制備、保藏、傳代、使用、銷毀的管理規(guī)程規(guī)定了質(zhì)量管理部門試驗(yàn)用原則菌種的驗(yàn)收、制備、儲(chǔ)管、使用、以及銷毀等的有關(guān)規(guī)定。合用于微生物程度檢查、無(wú)菌檢查、抗生素微生物（效價(jià)）測(cè)定、評(píng)價(jià)防腐劑和抗菌劑的抑菌效果和確認(rèn)滅菌效果、檢查措施的驗(yàn)證、培養(yǎng)基的合用性檢查，樣品檢查時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照等。根據(jù):中國(guó)藥典二部及菌種使用闡明書1.原則菌的來(lái)源

原則菌株由中國(guó)藥物生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心（ChinaMedicalculturecollection,CMCC）提供的冷凍干燥菌種（0代）或由上級(jí)藥檢部門已接種好的菌種斜面（3代）。黑曲霉的0代菌種為保留于含15%甘油的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中的孢子懸液冷存管。中國(guó)藥物生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌種的標(biāo)簽CMCC（B）代表細(xì)菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每種菌具有固定的代號(hào)。2.原則菌的驗(yàn)收

從菌種保藏中心購(gòu)置的原始菌種管是玻璃安瓿裝的凍干菌，接受同步應(yīng)檢查與否有隨菌種附有的有關(guān)資料。接受菌種時(shí)應(yīng)檢查安瓿的數(shù)量和名稱，和每一支安瓿的完整性。在對(duì)應(yīng)的菌種接受記錄上記上所有的有關(guān)菌種的信息，如名稱、數(shù)量和接受日期等。在菌種安瓿及菌種管上粘貼標(biāo)簽，內(nèi)容包括：菌種名稱、菌種代號(hào)、代次、接受日期、接受人、貯存條件、有效期至。新購(gòu)入的0代原始菌種儲(chǔ)存于－20℃，有效期為三年。從上級(jí)藥檢部門購(gòu)置的已接種好的菌種斜面（3代）應(yīng)檢查菌種管與否完好。儲(chǔ)存于2～83.原則菌的復(fù)蘇、復(fù)壯及原則儲(chǔ)備菌株的制備3.1物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培養(yǎng)基

改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基:用于黑曲霉復(fù)蘇、復(fù)壯.

液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基:用于生孢梭菌復(fù)蘇、復(fù)壯.

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復(fù)蘇、復(fù)壯。

改良馬丁培養(yǎng)基:用于白色念珠菌復(fù)蘇、復(fù)壯.3.3操作環(huán)節(jié)：

a.打開潔凈工作臺(tái)。

b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。

c.用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（啟動(dòng)安瓿時(shí)必須小心，由于安瓿遇熱時(shí)也許會(huì)破裂）。

d.以無(wú)菌措施用一無(wú)菌吸管從已準(zhǔn)備好的上述液體培養(yǎng)基中移取0.5～0.8ml到安瓿中。

e.輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充足混合并完全溶解。

f.用無(wú)菌吸管將安瓿內(nèi)菌液所有轉(zhuǎn)接到對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基。

g.根據(jù)安瓿上所標(biāo)明的不一樣菌種類型而將其培養(yǎng)于對(duì)應(yīng)的溫度（細(xì)菌培養(yǎng)溫度30～35℃，培養(yǎng)18～24小時(shí)；真菌培養(yǎng)溫度23～28℃，培養(yǎng)3～5天。觀測(cè)與否渾濁，渾濁闡明菌種復(fù)蘇生長(zhǎng)；若不渾濁，細(xì)菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天，真菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至14天，若仍未渾濁，滅菌處理。

h.黑曲霉的菌懸液先室溫待菌懸液融化后用無(wú)菌吸管吸取管內(nèi)液體1～2滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置23～28℃3.4菌種確認(rèn)

用無(wú)菌接種環(huán)從質(zhì)控管中取細(xì)菌培養(yǎng)物接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，或?qū)?yīng)的宜于該細(xì)菌生長(zhǎng)的鑒別平板上，劃線分離出單個(gè)菌落。然后在30～35℃下培養(yǎng)2～3天；同樣的措施取真菌到玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，并在23～283.5污染處理

假如在該平板上發(fā)既有其他菌落生長(zhǎng)，則闡明或操作有污染或菌種不純。將此被污染了的培養(yǎng)物滅菌處理。可尋找原因重新分離挑選純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為第四代。并重新制備儲(chǔ)備菌種管3.6菌種的傳代與保藏

將菌種接種至一新鮮培養(yǎng)基上，每萌發(fā)一次即稱為一代，因此，當(dāng)原始菌種復(fù)溶并轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)，即認(rèn)為已傳代一次，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第0代，冷凍干燥的原始菌種啟動(dòng)后轉(zhuǎn)種后為第1代，直到第3代為工作菌種。菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過(guò)5代。菌種的傳代保藏過(guò)程

3.3項(xiàng)下原則菌的復(fù)蘇為傳第一代，復(fù)壯為第二代。

傳第三代時(shí)取1支凍存管自然解凍，將其轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種。此時(shí)，工作用菌種為第3代。工作用菌種，分為兩類：一類用于定期傳代(W3)，一類用于試驗(yàn)用（S3）。

定期傳代用菌的傳代其操作環(huán)節(jié)如下（斜面接種法）：

（1）從冰箱冷藏室中取出菌種斜面后，應(yīng)在室溫放置約30分鐘。

（2）將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期，和傳代菌種一并移入潔凈工作臺(tái)，打開紫外燈照射一小時(shí)。

（3）關(guān)閉紫外燈。點(diǎn)燃酒精燈，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30秒，隨即將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，來(lái)回通過(guò)三次。

（4）右手用無(wú)名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少許菌苔，隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方。

（5）塞上管塞，左手將菌種管放下，取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面（或改良馬丁瓊脂斜面）一支，照上述操作打開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部向上劃一條直線，然后從底部向上作持續(xù)曲線劃線，一直劃到斜面頂端，使細(xì)菌接種在斜面的表面上。

（6）取出接種環(huán)，在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子，然后將接種過(guò)細(xì)菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。

（7）將已接種好的細(xì)菌管置30～35℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)22～24h，真菌管置23～28℃真菌培養(yǎng)箱最多培養(yǎng)7天。

當(dāng)工作用菌種傳代代數(shù)不不小于5時(shí)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種，如：（W3）可直接轉(zhuǎn)接為（W4）。按上述程序操作，直至（W4）轉(zhuǎn)為（W5）為止，需重新接種，舊的工作菌種進(jìn)行銷毀。菌種斜面的培養(yǎng)、保藏條件及時(shí)間

菌種

培養(yǎng)條件及時(shí)間

培養(yǎng)基

保留條件及時(shí)間

大腸埃希菌(CMCC(B)44102)

30～35℃22～24h

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

2℃～8℃保留3個(gè)月

金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)

30～35℃22～24h

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

2℃～8℃保留3個(gè)月

枯草芽孢桿菌(CMCC(B)63501)

30～35℃22～24h

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

2℃～8℃保留3個(gè)月

銅綠假單胞菌(CMCC(B)10104)

30～35℃22～24h

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

2℃～8℃保留3個(gè)月

乙型副傷寒沙門菌(CMCC(B)50094)

30～35℃22～24h

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

2℃～8℃保留3個(gè)月

生孢梭菌(CMCC(B)64941)

30～35℃22～24h

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

2℃～8℃保留3個(gè)月

白色念珠菌(CMCC(F)98001)

23～28℃最多7天

改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基

2℃～8℃保留3個(gè)月

黑曲霉(CMCC(F)98003)

23～28℃最多7天