第5章 發(fā)酵菌種的制備

發(fā)酵工程2/jing/C76/zcr-1.htm南陽師范學院生命科學與技術學院發(fā)酵工程第一章發(fā)酵工程總論第二章發(fā)酵設備第三章發(fā)酵工業(yè)原料及其處理第四章發(fā)酵工業(yè)滅菌第五章發(fā)酵菌種的制備第六章發(fā)酵工業(yè)放大第七章微生物發(fā)酵機制第八章發(fā)酵動力學第九章發(fā)酵過程工藝控制第十章發(fā)酵染菌及防治第十一章發(fā)酵工業(yè)廢物、廢水處理和資源化技術第十二章展望1發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育2工業(yè)微生物種子的擴大培養(yǎng)3種子培養(yǎng)基及其制備第五章發(fā)酵菌種的制備2/jing/C76/zcr-1.htm1.1工業(yè)微生物的特點1.2發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求1.3工業(yè)生產常用的微生物菌種1.4工業(yè)微生物菌種的分離1.5發(fā)酵高產菌種的選育1.6菌種的退化與保藏1發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育第五章發(fā)酵菌種的制備1.1工業(yè)微生物的特點1發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育一個現(xiàn)代化的發(fā)酵工業(yè)必須具有優(yōu)良的菌種、合適的工藝和先進的設備、嚴格的檢測與控制，其中菌種是主體,其他則是為了充分發(fā)揮菌種的優(yōu)良性能而考慮和設計的。能用于發(fā)酵生產的微生物即為工業(yè)微生物，它們具有個體小、種類多、繁殖快、分布廣、代謝能力強、易變異改造等特點。1.2發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求1)能在廉價原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長，并生成所需要的代謝產物，且產量高；2）培養(yǎng)條件易于控制；3）生長速度快，發(fā)酵周期短；4）滿足代謝控制的要求；5）抗噬菌體和雜菌的能力強；6）遺傳性狀穩(wěn)定，菌種不易變異退化；7）在發(fā)酵過程中產生的氣泡要少，這對提高裝料系數、提高單罐產量、降低成本有重要意義；8）對需要添加的前體物質有耐受能力，并且不能將這些前體作為一般碳源利用；9）不是病原菌，同時在系統(tǒng)發(fā)育上與病原菌無關，不產生任何有害的生物活性物質和毒素，以保證安全。地球上的微生物資源非常豐富，目前已發(fā)現(xiàn)的僅占其總數的1%~5%，而在工業(yè)生產中被利用的僅有數百種，分屬于細菌、酵母菌、霉菌、放線菌、擔子菌、藻類。1.3工業(yè)生產常用的微生物菌種放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產芽孢的細菌植物或動物來源一、抗生素生產有關的微生物抗生素是次級代謝產物，需要生物體進行復雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來源如下：已工業(yè)化產品生產菌的介紹1.3工業(yè)生產常用的微生物菌種二、氨基酸生產有關的微生物代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有意識地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產物，這種發(fā)酵形象地稱為代謝控制發(fā)酵，最早在氨基酸發(fā)酵中得到成功應用。20世紀50-60年代以氨基酸發(fā)酵為代表的代謝控制發(fā)酵，是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展歷史上的一個轉折點：1.3工業(yè)生產常用的微生物菌種已工業(yè)化產品生產菌的介紹HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸的合成調節(jié)機制

HT:高絲氨酸轉乙酰酶AK:天冬氨酸激酶1.3工業(yè)生產常用的微生物菌種二、氨基酸生產有關的微生物氨基酸生產菌的要求：代謝途徑比較清楚，簡單谷氨酸發(fā)酵的菌種：其他氨基酸生產菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細菌常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌1.3工業(yè)生產常用的微生物菌種二、氨基酸生產有關的微生物三、食品酶制劑生產有關的微生物開發(fā)一個新酶，都要經過一系列研究的毒理試驗。關于食品用酶，美國需要得到FDA的批準。目前已同意使用的僅僅少數微生物能用于生產食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌1.3工業(yè)生產常用的微生物菌種已工業(yè)化產品生產菌的介紹三、常用的基因表達系統(tǒng)(一)原核生物：大腸桿菌(1977年Boyer)、枯草牙胞桿菌沙門氏菌

生長迅速、蛋白產量高;

表達蛋白的純化、分離及分析快速；

外源基因的導入相對容易；

已建立了整套表達理論及技術。已工業(yè)化產品生產菌的介紹1.3工業(yè)生產常用的微生物菌種(二)真核細胞表達系統(tǒng)

酵母(既是微生物又是真核細胞)

生長迅速，營養(yǎng)要求不高，易培養(yǎng)；

安全性好；

比哺乳動物細胞操作簡單；

具有一定的修飾蛋白的能力。1.3工業(yè)生產常用的微生物菌種已工業(yè)化產品生產菌的介紹

中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）表達系統(tǒng)

具有準確的轉錄后修飾功能；

具有產物胞外分泌功能，便于下游產物分離純化；

具有重組基因的高效擴增和表達能力；

具有貼壁生長特性，也可進行懸浮生長；

CHO很少分泌自身的內源蛋白。1.3工業(yè)生產常用的微生物菌種已工業(yè)化產品生產菌的介紹微生物（包括動、植物細胞）幾乎可以生產我們所需的一切產品，但是涉及到工業(yè)化生產對于某一種特定的產品，只有特定的微生物才具有大量表達的潛力。問題：生產抗生素的微生物能不能用于生產氨基酸？禮來(Elililly),花了10年的時間從40萬株微生物中，發(fā)現(xiàn)了三種有潛力的新抗生素。例：1.3工業(yè)生產常用的微生物菌種已工業(yè)化產品生產菌的介紹一、菌種分離的一般過程樣品采集預處理→增殖培養(yǎng)→純培養(yǎng)→菌種的鑒定問題：如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)目的：高效地獲取一株高產目的產物的微生物1.4工業(yè)微生物菌種的分離→→生產性能測定復合酶系復合菌系二、采樣時要注意的問題

氣候、水分、空氣

來源要廣

結合產品的特點

標簽：地點、時間、氣候等1.4工業(yè)微生物菌種的分離富集的三種方案：定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的條件，進行培養(yǎng)。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。當不可能采用定向培養(yǎng)時，則可設計在一個分類學中考慮，不能提供任何有助于篩選產生菌的信息，這時只能通過隨機分離的辦法1.4工業(yè)微生物菌種的分離定向培養(yǎng)的方法物理方法：加熱、膜過濾等，但主要是通過培養(yǎng)的方法1.4工業(yè)微生物菌種的分離三、目的微生物富集的一些基本方法2/jing/C76/zcr-1.htm定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批、連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。三、目的微生物富集的一些基本方法四、菌落的選出從產物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產物的形成有目的的設計培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素

從形態(tài)的角度

菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個重要表征。如多糖產生菌在適當的培養(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。1.4工業(yè)微生物菌種的分離實例：堿性纖維素酶產生菌的篩選采樣（造紙廠）→80℃30min處理文獻:產生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌、放線菌及霉菌0.0075%曲利本藍＋1%CMC（羧甲基纖維素），pH10.5培養(yǎng)3～4d，選擇有凹陷圈的菌落從285個土樣中獲得62株26株為組成型36株為誘導型↓1.4工業(yè)微生物菌種的分離實例：醛肟水解酶的篩選--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培養(yǎng)基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2~3d移去一半培養(yǎng)物，補充新鮮培養(yǎng)基不斷分析樣品，2-3個月后Z-PAOx降低后，稀釋分離菌落1.4工業(yè)微生物菌種的分離五、目的微生物富集方法的研究進展分子生物學的實驗手段，在微生物鑒別及特定目標產物的篩選方面發(fā)揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術等

目前土壤中能夠培養(yǎng)的微生物不到總數的1%，微生物的多樣性及資源的開發(fā)仍然是今后若干年的研究重點。

陳文新（科學院院士），2002

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～811.4工業(yè)微生物菌種的分離目的提高生產能力提高產品質量開發(fā)新產品解決生產實際問題防止菌種退化1.5發(fā)酵高產菌種的選育方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質體融合、基因工程基因的直接進化：點突變、易位PCR、同序法DNAShuffling等1.5發(fā)酵高產菌種的選育自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為10-8～10-9。自然突變有兩種情況：一種是我們生產上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產質量的下降，這種突變成為負突變。另一種是我們生產上希望看到的，對生產有利，這種突變成為正突變。一、自然選育1.5發(fā)酵高產菌種的選育自然選育在工業(yè)生產上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產高產的重要措施。回復突變：高產菌株在傳代的過程中，由于自然突變導致高產性狀的丟失，生產性能下降，這種情況我們稱為回復突變問題：高產菌株是正突變高，還是負突變高？1.5發(fā)酵高產菌種的選育自然選育操作步驟：一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落發(fā)酵試驗1.5發(fā)酵高產菌種的選育注意形態(tài)的觀察選擇性培養(yǎng)法隨機分離法平板劃線法平板稀釋法二、誘變育種用各種物理、化學的因素人工誘發(fā)基因突變進行的篩選，稱為誘變育種。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質稱為誘變劑（P103）誘變劑物理：紫外，快中子，射線，激光化學：硫酸二乙酯（DES），亞硝基胍（NTG）生物：噬菌體，轉座子1.5發(fā)酵高產菌種的選育（二）、誘變劑處理過程中幾個有關的問題

化學誘變劑使用過程的安全性誘變劑量的選擇誘變劑的選擇出發(fā)菌株的選擇（一）、誘變育種的原理誘變育種的理論基礎是基因突變，突變主要包括染色體畸變和基因突變兩大類。壓硝酸：0.07MNa2HPO4亞硝基胍：1MNaOH二、誘變育種（三）、誘變育種的一般步驟（P103）二、誘變育種誘變育種一般包括誘變和篩選兩個部分。誘變部分成功的關鍵包括出發(fā)菌株的選擇、誘變劑種類和劑量的選擇，以及合理的使用方法。篩選部分包括初篩和復篩來測定菌種的生產能力。誘變育種是誘變和篩選過程的不斷重復，直到達到高產菌株。（三）、誘變育種的一般步驟二、誘變育種出發(fā)菌株的選擇制備菌懸液誘變處理突變菌株的篩選營養(yǎng)缺陷型突變菌株的篩選抗反饋阻礙和抗反饋抑制突變菌株的篩選組成型突變株的篩選抗性突變株的篩選自然界直接分離到的野生型菌株經歷過生產條件考驗的菌株已經歷多次育種處理的菌株隨機篩選形態(tài)理化性質HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節(jié)機制

HT:高絲氨酸轉乙酰酶AK:天冬氨酸激酶結構類似物抗性：Lys的類似物AEC,Thr的類似物AHV營養(yǎng)缺陷型：如Thr缺陷型黃色短桿菌F9-50的誘變譜系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l三、基因的直接進化(directedevolution)

突變

基因突變庫的建立

篩選

基因突變庫的篩選

基因復制與遺傳步驟：

在分子水平上，對目標基因直接處理，然后通過高通量的篩選方法，提高目標蛋白的性能。1.5發(fā)酵高產菌種的選育主要應用：酶活性能的提高:生理環(huán)境→工業(yè)催化環(huán)境pH

溫度

有機溶劑底物專一性脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光學拆分選擇性(%)231577581905次錯位PCR2次定點突變Reetz(1997)Liebeton(2000)定點突變錯位PCRDNA改組(DNAShuffling):指DNA分子的體外重排，是基因在分子水平上進行有性重組(SexualRecombination)。DNA改組技術(1994)的發(fā)明人Stemmer博士，他以5項美國專利為技術支撐點，于1997年創(chuàng)立了專門從事DNA改組研究的公司Maxygen。公司剛剛建立，世界上幾家最大的公司紛紛與之洽談并建立了合作關系。這些公司包括最大的農業(yè)公司duPont公司、生產抗生素的世界巨頭DSM公司和工業(yè)酶研究生產之最的Novonordisk公司。此外，迄今為止，Maxygen公司還得到了來自美國國防高級研究計劃局(DARPA)和國家科學技術協(xié)會(NIST)的5項資助，共計2100萬美元。從另一角度反映了DNA改組的重要性及美國政府及商家對DNA改組技術的重視程度。圖1有性PCR法改組DNA的基本程序DNAshuffling圖2交錯延伸法改組DNA的基本程序

DNA

shufflingXXXX

XXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXXXXXXXXXXXXXXXFragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesDNAshuffling項目進化速度進化對象進化周期影響對象突變效率常規(guī)定向進化緩慢進化整個基因組多年完整基因組低DNAShuffling快速進化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因