發(fā)酵工程制藥-糖類藥物的發(fā)酵制藥

生物制藥工藝課程透明質(zhì)酸的發(fā)酵制藥透明質(zhì)酸可用作眼科人工晶體植入手術(shù)的粘彈劑、骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)手術(shù)的填充劑，作為媒介在滴眼液中廣泛應(yīng)用，還用于預(yù)防術(shù)后粘連和促進皮膚傷口的愈合。透明質(zhì)酸與其它藥物反應(yīng)形成的化合物對藥物發(fā)揮緩釋作用，可達到定向和定時釋放的目的。隨著醫(yī)藥科技的發(fā)展，透明質(zhì)酸在醫(yī)藥方面的應(yīng)用將越來越廣泛。透明質(zhì)酸是減緩關(guān)節(jié)炎疼痛的良藥醫(yī)藥級透明質(zhì)酸透明質(zhì)酸在體內(nèi)的生理功能已不局限于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及黏彈性等物理機械功能。透明質(zhì)酸受體的發(fā)現(xiàn)對透明質(zhì)酸的認識有了質(zhì)的飛躍，揭示了其通過受體的結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞的功能從而在胚胎發(fā)育，腫瘤發(fā)生，組織愈合等方面扮演了重要角色。透明質(zhì)酸受體的發(fā)現(xiàn)還有助于開發(fā)新的給藥途徑。明確掌握透明質(zhì)酸代謝機制，通過發(fā)現(xiàn)其代謝異常，可對一些疾病的診斷和治療具有指導(dǎo)意義。透明質(zhì)酸的生理功能項目動物組織提取法發(fā)酵法存在狀態(tài)在原料中與蛋白質(zhì)和其他粘多糖形成復(fù)合體，分離純化復(fù)雜在發(fā)酵液中游離存在，易于分離純化相對分子質(zhì)量取決與動物組織原料，基本無法控制，一般為（0.1-2.5）*106可通過發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)條件進行控制，一般為（1.0-4.0）*106品質(zhì)與產(chǎn)量取決于動物組織原料的品質(zhì)與數(shù)量品質(zhì)可控，產(chǎn)量無限制成本高低發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的優(yōu)點主要原料是人的臍帶、雞冠和牛眼玻璃體等。用丙酮或乙醇將原料脫脂、脫水、風(fēng)干后，用蒸餾水浸泡、過濾，然后以氯化鈉水溶液和氯仿溶液處理，之后加入胰蛋白酶保溫后得到混合液，最后用離子交換劑進行處理、純化得到精制的透明質(zhì)酸，該法提取率極低，僅為1％左右。透明質(zhì)酸的制備方法利用天然原料即從動物組織中提取以葡萄糖作為碳源，在培養(yǎng)基中發(fā)酵48h，發(fā)酵結(jié)束后，過濾除去菌體和雜質(zhì)，然后用醇沉淀法等簡單操作即得到高純度的透明質(zhì)酸。采用發(fā)酵法制得的透明質(zhì)酸，優(yōu)點是能按商品設(shè)計來設(shè)定分子量。發(fā)酵法的關(guān)鍵在于菌種的選擇，目前多選用鏈球菌屬類菌種等。透明質(zhì)酸的制備方法

生物發(fā)酵法獸疫鏈球菌鏡下觀察，圓圓的，常見多個細菌連在一起，成鏈狀，故稱鏈球菌。以透明質(zhì)酸為主要成分的莢膜圍繞在菌體周圍，保護細菌免受傷害。鏈球菌正常生長是一個產(chǎn)酸過程，通常做法在穩(wěn)定期提高發(fā)酵液的pH值。結(jié)果部分鏈球菌因pH突然變大而停止生長并產(chǎn)生莢膜，那些繼續(xù)生長的鏈球菌會不斷產(chǎn)酸，使發(fā)酵液pH恢復(fù)正常。此時再次提高發(fā)酵液pH。如此往復(fù)菌體不但能正常生長而且能不斷的產(chǎn)生我們所需要的莢膜。但是整個過程中pH值不能調(diào)的過高，如果過高，菌體因無法承受而被殺死。透明質(zhì)酸的發(fā)酵生產(chǎn)

一、菌種和培養(yǎng)基鏈球菌屬于兼性厭氧菌，在透明質(zhì)酸的發(fā)酵工藝中，大多數(shù)采用有氧發(fā)酵。有氧發(fā)酵的葡萄糖能量代謝可產(chǎn)生更多的ATP，有利于UTP生成，而UTP是生成透明質(zhì)酸的兩個活化前體物，即UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖所必需的物質(zhì)。因此從代謝調(diào)控的角度來說，有氧發(fā)酵有利于透明質(zhì)酸的合成。斜面培養(yǎng)基/％：葡萄糖0.2，牛肉膏1.0，蛋白胨2.0，酵母抽提物0.5，NaCl0.2，Na2HPO4?12H2O0.1，KH2PO40.012，瓊脂2.0；pH7.0～7.2。種子培養(yǎng)基/％：同斜面培養(yǎng)基，不加瓊脂。發(fā)酵培養(yǎng)基/％：蛋白胨2.0，酵母抽提物1.0，MgSO4?7H2O0.1，K2HPO40.25，NaCl0.2；pH7.0～7.2。葡萄糖配成50％的水溶液，單獨滅菌。

培養(yǎng)基生產(chǎn)透明質(zhì)酸用培養(yǎng)液，氮源為蛋白胨，酪蛋白水解液，酵母膏，牛肉膏，大豆蛋白水解液，尿素，無機銨鹽等。其中，酵母膏最為常用，除作為氮源外，還含有多種維生素和生長因子，有些是鏈球菌生長所必需的。在發(fā)酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸，可提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)率。碳源主要是各種單糖，蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖，要求藥品級口服葡萄糖，其他還有磷酸鹽，硫酸鹽等無機鹽。純化水不含金屬離子，溶解物料。氫氧化鈉：為中和劑，因為發(fā)酵時產(chǎn)酸，導(dǎo)致PH降低，從而減緩反應(yīng)速率。

斜面種子→搖瓶種子→接種→發(fā)酵培養(yǎng)→補料→放罐→發(fā)酵液（加乙醇粗提）→粗提液（加助濾劑、活性炭，調(diào)pH→過濾（去除雜質(zhì)）→濾液（乙醇沉淀）→沉淀物（脫水干燥）→成品透明質(zhì)酸二、工藝流程

工藝流程無菌空氣制備設(shè)備

三、種子擴大培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)取斜面種子，接種于裝有滅菌培養(yǎng)液的三角瓶中，37℃培養(yǎng)12h～16h，光鏡觀察菌體生長良好，無雜菌污染即可接種到種子罐中。培養(yǎng)液的配方：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸錳0.3g，加水溶解至1L，115℃滅菌30min。1、調(diào)種子罐壓0.05Mpa；調(diào)大接種口排污閥門，調(diào)小接種口靠罐閥門，使排氣口有氣排出即可，關(guān)閉接種口排污閥門；2、點燃火焰圈，放于接種口下方5cm處；3、在火焰保護下，迅速解開接種口外套，解開軟管上包扎用棉繩，迅速將軟管套上接種口；4、移走火焰圈，用卡箍將軟管套牢；5、打開接種口靠罐閥門；500L種子罐接種操作

6、逐漸升高罐內(nèi)壓力至0.08Mpa，穩(wěn)定后緩慢降低罐壓（壓力不能低于0.03Mpa），將種子液接入罐內(nèi)；7、如一次不能接完，可重復(fù)⑥中的升壓和降壓，直至種子液全部接入罐內(nèi)；8、關(guān)閉接種口靠罐閥；9、打開接種口排污閥門，卸清種子瓶內(nèi)的壓力，取下接種瓶，關(guān)閉接種口排污閥，旋上接種口外套；10、調(diào)節(jié)種子罐培養(yǎng)參數(shù)，開始培養(yǎng)。通過壓差法或火焰接種法將搖瓶種子接種到種子罐中，溫度37～37.5℃；罐壓：0.05Mpa；通氣量5.6m3/h；攪拌轉(zhuǎn)速60rpm；通氣量50L/min，培養(yǎng)過程中pH用20%的NaOH調(diào)節(jié)，維持6.8～7.0。培養(yǎng)時間12h~16h。種子罐培養(yǎng)（500L種子罐）

自接種起，按規(guī)定時間取樣。具體為0h、5h、9h、10h、11h。取樣時間根據(jù)菌體生長情況作一定調(diào)整。檢查項目為還原糖、pH、鏡檢。光鏡觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于發(fā)酵罐中。無雜菌、菌體數(shù)量較多、殘?zhí)呛?.5～2.0g/L；周期約12h。在搖瓶和種子罐培養(yǎng)階段，溫度一般控制在37℃，或在不同的階段采用不同的溫度。在種子培養(yǎng)階段和發(fā)酵初期，37℃培養(yǎng)可使菌體較快地生產(chǎn)增殖，發(fā)酵中期和后期可適當?shù)亟档蜏囟?，這樣做可使葡萄糖的代謝方向由合成菌體細胞壁轉(zhuǎn)向合成透明質(zhì)酸，提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)率和相對分子質(zhì)量。

等到種子罐內(nèi)的種齡達到工藝要求，進行以下操作：1、關(guān)閉種子罐的出氣閥門，使罐內(nèi)的壓力逐漸上升到0.10～0.12Mpa之間；2、關(guān)閉種子罐的取樣排污閥和發(fā)酵罐的移種管道排污閥；3、將與移種相關(guān)的閥門打開，并關(guān)閉或切斷與之無關(guān)的閥門；4、迅速同時打開發(fā)酵罐和種子罐的移種閥，將種子罐內(nèi)合格的菌種移入發(fā)酵罐內(nèi)達到工藝要求的菌種量；5、關(guān)閉發(fā)酵罐的移種閥。

四、5T發(fā)酵罐移種操作

1、培養(yǎng)條件溫度：接種后36.8～37.0℃；10h后37.1～37.3℃；17h后37.5～37.8℃罐壓：0.05Mpa通氣量：接種后72m3/h；補料1h后90m3/h轉(zhuǎn)速：接種后50rpm/min；補料1h后80rpm/minpH：培養(yǎng)過程中前期控制在6.9～7.0；補料后1h控制在6.9～8.0五、發(fā)酵培養(yǎng)（5噸）

綜合pH及糖代謝情況決定是否放罐。當1min內(nèi)pH下降低于0.02以下，糖濃度降低至3～5g/L（或糖不消耗，不加堿）時即可放罐。發(fā)酵周期作為參考依據(jù)。

六、放罐

發(fā)酵結(jié)束后，進入提取階段。將發(fā)酵液移至干凈的粗提罐內(nèi)，加入95%的乙醇進行粗提。之后將粗提液移至一干凈的罐內(nèi)，加入純水溶解，在攪拌下加入助濾劑以及活性炭，分別用NaOH和HCl進行大幅度地調(diào)整pH使蛋白質(zhì)失活變性。然后過濾去除菌體、雜蛋白、重金屬等雜質(zhì)。濾液用95%的乙醇沉淀，沉淀物再用乙醇脫水，然后干燥得成品透明質(zhì)酸。（注：干燥的溫度在50℃～60℃，溫度過高會影響透明質(zhì)酸的生物活性，反之又會延長干燥的時間而浪費能源）。七、分離純化核苷酸藥物的提取制藥目前，透明質(zhì)酸的生產(chǎn)方法逐漸由動物組織提取法轉(zhuǎn)向微生物發(fā)酵法。生物制藥工藝課程真菌多糖的發(fā)酵制藥真菌多糖

定義：指各種真菌的子實體和菌絲體所產(chǎn)生的一類代謝產(chǎn)物，具有某種獨特生理活性的多糖化合物，包括酵母菌多糖、霉菌多糖、真核藻類多糖和大型真菌多糖等等。分類：1）結(jié)構(gòu)多糖2）活性多糖生理功能：真菌多糖被稱為稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物”，簡稱“BRM”，經(jīng)研究表明，多糖具有生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物的特征，可做為免疫增強劑和免疫激活劑，具有提高人體免疫功能、抗腫瘤、抗突變、抗衰老、降血糖、降血脂、預(yù)防糖尿病、抗菌和抗病等特殊生理功能。真菌活性多糖、真菌活性多糖的結(jié)構(gòu)及生理功能二、真菌活性多糖的制備工藝真菌活性多糖的制備工藝原料有兩種來源

子實體子實體多糖

液體深層發(fā)酵法

菌絲體

菌絲體多糖

（胞內(nèi)多糖）

發(fā)酵液

發(fā)酵液多糖

（胞外多糖）

（一）真菌多糖深層發(fā)酵法

1．原理2．設(shè)備

3．工藝流程

真菌液體深層發(fā)酵工藝流程

操作注意：

1）搖瓶種子在室溫下振蕩培養(yǎng)4~6d后，經(jīng)無菌檢驗以2%~5%的接種量接入種子罐中，發(fā)酵過程對無菌操作要求很高。

2）發(fā)酵前期通風(fēng)比為1:0.5，中后期調(diào)至1:1。

3）培養(yǎng)過程采用攪拌方式。4．工藝說明（1）菌種：菌種培育→斜面或沙土管孢子低溫保藏→復(fù)壯→分離純化

（2）培養(yǎng)基：

①孢子培養(yǎng)基：提供菌體的生長繁殖，形成孢子。②斜面/液體種子培養(yǎng)基：供孢子發(fā)芽、生長和繁殖菌絲體，并使菌體長得粗壯，成為活力強的“種子”。③發(fā)酵培養(yǎng)基：供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物（3）種子制備（種子擴大培養(yǎng)）①斜面活化：使保藏的生產(chǎn)菌種恢復(fù)活力②搖瓶培養(yǎng)：種齡要控制在對數(shù)期③種子罐擴大培養(yǎng)：一般不要超過三級（4）發(fā)酵罐：通風(fēng)式發(fā)酵罐

（5）發(fā)酵過程工藝控制：

①溫度、pH控制：最適生長溫度和pH并非一定是最適產(chǎn)物形成溫度和pH

②壓力控制：正壓發(fā)酵，保證純種的培養(yǎng)

③溶解氧控制：通過通氣和攪拌實現(xiàn)。攪拌轉(zhuǎn)速，通氣量發(fā)酵前期小、中期大、后期?、芘菽刂疲菏秤眉壪輨┤缗輸?/p>

⑤中間補料：真菌多糖的形成一般在減速期和穩(wěn)定期，故在此時期內(nèi)可連續(xù)或多次補料(一般為碳源)

⑥染菌控制：無菌操作，設(shè)備密封性能檢查，染菌檢查

（6）發(fā)酵終點判斷：

何時放罐要根據(jù)發(fā)酵目的、經(jīng)濟等因素綜合考慮。以菌絲形態(tài)、數(shù)量以及養(yǎng)分的消耗和代謝的變化作為指標。

（二）真菌活性多糖提取純化工藝

1．原理：熱水或極性溶劑浸提→分離純化→胞內(nèi)外多糖產(chǎn)品

2．設(shè)備

3．工藝流程

（1）原料及預(yù)處理：

4．工藝說明

（2）提取