發(fā)酵工程制藥-有機(jī)酸類藥物的發(fā)酵制藥

生物制藥工藝課程檸檬酸的發(fā)酵制藥

檸檬酸的發(fā)酵1.性質(zhì)(1)物理性質(zhì)分子式C6H8O7，又名枸櫞酸，為無色半透明晶體，或白色顆粒，或白色結(jié)晶性粉末，無臭，雖有強(qiáng)烈酸味但令人愉快，稍有一點(diǎn)后澀味。它在溫暖空氣中漸漸風(fēng)化，在潮濕空氣中微有潮解性。（2）化學(xué)性質(zhì)酸性與電離

檸檬酸是較強(qiáng)的有機(jī)酸，有3個(gè)H+可以電離。與酸反應(yīng)

檸檬酸與發(fā)煙硫酸混合，在常溫下即產(chǎn)生烏頭酸，稍稍加熱能生成α-酮戊二酸。檸檬酸與濃硫酸混合，溫度在40℃時(shí)產(chǎn)生丙酮、CO2、CO等，加熱至150℃時(shí)生成烏頭酸酐；加熱至200℃時(shí)生成雙康酸（C9H10O6）及CO、CO2等。與堿反應(yīng)檸檬酸與K2CO3或KOH或硝酸共熔得到草酸和醋酸或其它鹽類；與鈉鹽(如NaCl)加石灰干餾得到丙酮。在堿液中煮沸時(shí)得到丙烯酸（C3H4O2)。2.檸檬酸的應(yīng)用（1）在食品工業(yè)上的應(yīng)用

檸檬酸也稱第一食用酸味劑，廣泛用作酸味劑、增溶劑、緩沖劑、抗氧化劑、除腥脫臭劑、螯合劑等。（2）在醫(yī)藥上的應(yīng)用

檸檬酸鹽用于補(bǔ)充相應(yīng)的元素時(shí)，具有溶解度高，酸根直接被吸收代謝而無積留等優(yōu)點(diǎn)。醫(yī)藥上用的有檸檬酸鈉(抗凝血?jiǎng)?、檸檬酸鐵銨(補(bǔ)血?jiǎng)?等。（3）在化學(xué)工業(yè)上的應(yīng)用檸檬酸及其鹽類和衍生物在化學(xué)工業(yè)中廣泛用作緩沖劑、催化劑、激活劑、增塑劑、螯合劑、清洗劑、吸附劑、穩(wěn)定劑、消泡劑等。（4）其他方面的應(yīng)用3.生物合成途徑

檸檬酸合成的途徑包括兩個(gè)生化途徑（如圖10-1），一個(gè)是EMP途徑，由糖降解成丙酮酸；另一個(gè)是三羧酸循環(huán)途徑，而檸檬酸就是三羧酸循環(huán)中的一個(gè)分支。4、代謝調(diào)控5、發(fā)酵工藝

5.1檸檬酸生產(chǎn)菌青霉、毛霉、木霉、曲霉等。（1）以糖質(zhì)原料生產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉；（2）以石油原料生產(chǎn)檸檬酸的如解脂假絲酵母。

5.2原料薯干、甘蔗渣、廢糖蜜、馬鈴薯、玉米等。5.3工藝檸檬酸發(fā)酵工藝的發(fā)展可以分為三個(gè)階段：第一階段(上世紀(jì)20年代):青霉和曲霉表面發(fā)酵。第二階段(始于30年代）：曲霉深層發(fā)酵的發(fā)展。第三階段（50年代至今）：以黑曲霉深層發(fā)酵為主，表面和固體發(fā)酵并行。

檸檬酸深層發(fā)酵工藝

深層發(fā)酵的特點(diǎn)是微生物菌體均勻分散在液相中，利用溶解氧，發(fā)酵時(shí)不產(chǎn)生分生孢子，全部菌體細(xì)胞都參與合成檸檬酸的代謝。其優(yōu)點(diǎn)如下：(1)發(fā)酵體系是均一的液體，傳熱傳質(zhì)良好，不存在死角。(2)設(shè)備占地面積小，生產(chǎn)規(guī)模大。(3)發(fā)酵速率高,采用預(yù)培養(yǎng)菌絲球接種時(shí)只需50-70h即發(fā)酵完畢。(4)產(chǎn)酸率高，產(chǎn)檸檬酸幾乎接近理論產(chǎn)率，菌體生成量少，原材料消耗低。(5)發(fā)酵設(shè)備密閉，雜菌污染的可能性小，管理方便。(6)完全機(jī)械化操作，并可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制，勞動(dòng)強(qiáng)度低，勞動(dòng)生產(chǎn)率高。(7)發(fā)酵副產(chǎn)物少，有利于產(chǎn)品提取，所得產(chǎn)品質(zhì)量高。

然后用無菌壓縮空氣將培養(yǎng)的菌絲體（保持在35℃左右）輸入發(fā)酵罐中。發(fā)酵在35℃左右進(jìn)行，通風(fēng)攪拌培養(yǎng)4天。當(dāng)酸度不再上升，殘?zhí)墙档?g/L以下時(shí)，立即將發(fā)酵醪泵送到儲(chǔ)罐中，并及時(shí)提取檸檬酸。操作方法：在種子培養(yǎng)基中添加硫酸銨0.3%～0.5％拌勻，待種子培養(yǎng)基冷至約35℃接入黑曲霉麩曲，于35℃下通風(fēng)培養(yǎng)20～30h。

檸檬酸的提取

成熟發(fā)酵醪中除了含有主要產(chǎn)品檸檬酸之外，還含有殘?zhí)?、菌體、蛋白質(zhì)、色素、膠體物質(zhì)、無機(jī)鹽和有機(jī)雜酸，以及原料帶入的各種雜質(zhì)。這些物質(zhì)必須采用一系列物理和化學(xué)方法進(jìn)行處理。提取工藝有鈣鹽法、萃取法、離子交換法和電滲析法等。但目前普遍使用的仍是鈣鹽加離子交換的提取方法。鈣鹽法提取工藝流程1.發(fā)酵醪預(yù)處理

發(fā)酵醪成分如下：檸檬酸80％～95％，葡萄糖酸0.2％～0.3％，草酸0.1％～0.3％，殘?zhí)?.2％～0.5％。此外還含有蛋白質(zhì)等膠體物質(zhì)。在發(fā)酵結(jié)束之后，應(yīng)及時(shí)將發(fā)酵液加熱至100℃。熱處理的作用：（1）殺死微生物終止發(fā)酵，防止檸檬酸被分解（2）使蛋白質(zhì)等膠體物質(zhì)變性凝固，降低發(fā)酵液粘度，有利于過濾；（3）使菌體內(nèi)檸檬酸釋放出來，提高收率。2.菌絲過濾3.中和4.酸解脫色5.樹脂凈化

強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂去除Ca2＋、Fe3＋等金屬離子。6.濃縮與結(jié)晶

將酸解液置于60℃以下進(jìn)行減壓蒸發(fā)，濃縮至70％以上，待結(jié)晶。7.干燥

沸騰干燥箱，去除晶體表面的自由水。溫度控制在35℃以下，否則會(huì)失去一部分結(jié)晶水，影響成品光澤。生物制藥工藝課程葡萄糖酸的發(fā)酵制藥葡萄糖酸的發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸（五羥基己酸）是一種有機(jī)弱酸，含4個(gè)不對(duì)稱碳原子，是制藥工業(yè)和食品工業(yè)的重要原料，在建筑、化妝品、紡織、塑料制造上也有應(yīng)用。20世紀(jì)20~30年代，發(fā)現(xiàn)某些微生物可以發(fā)酵葡萄糖成葡萄糖酸。20世紀(jì)50年代，流加氫氧化鈉生產(chǎn)葡萄糖酸鈉，發(fā)酵時(shí)間為20h，成為現(xiàn)代深層發(fā)酵葡萄糠酸的基礎(chǔ)。葡萄糖酸與碳酸鈣或石灰中和生成的葡萄糖酸鈣，可治療生理性缺鈣癥和血鈣過低所引起手足抽搐、痙攣等癥，以及治療軟骨、佝僂等缺鈣癥，食品工業(yè)中用來制作果醬等。葡萄糖酸水溶液可形成葡萄糖酸δ-內(nèi)酯和葡萄糖酸γ-內(nèi)酯，三者等量混合存在。葡萄糖酸δ-內(nèi)酯是食品添加劑，可作為凝固劑、膨松劑、酸味劑。1．生產(chǎn)菌種曲霉、醋酸菌、多種青霉(尤其是產(chǎn)黃青霉)、幾種假單孢菌以及其他幾種菌。工業(yè)上常用的是醋酸菌和黑曲霉，特別是黑曲霉，在高糖濃度和微酸條件下能迅速氧化葡萄糖成葡萄糖酸，轉(zhuǎn)化率在95％以上。2．發(fā)酵工藝液體深層發(fā)酵多采用高濃度水解糖（25％~35％）和無機(jī)氮源，發(fā)酵時(shí)間40h。培養(yǎng)基中加入CaCO3，或在發(fā)解過程中添加50％的NaOH溶液，使pH值保持在5.5~6.5之間。目前已采用連續(xù)發(fā)酵法和固定化細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)葡萄糖酸。斜面菌種→搖瓶種子→種子罐→發(fā)酵罐→過濾濃縮→活性碳脫色→陽離子交換樹脂脫鈉→葡萄糖酸3．提取用離心、過濾或沉淀法分離菌絲體。鈣鹽清液在攪拌下升溫加石灰乳，使鈣總濃度達(dá)酸濃度的98％，100℃下濃縮到過飽和，冷至20℃靜置，葡萄糖酸鈣結(jié)晶自然析出?；驖饪s液用等濃度H2SO4酸化，并過濾除去CaSO4結(jié)晶即可得葡萄糖酸溶液。鈉鹽清液經(jīng)活性炭脫色和陽離子交換得到葡萄糖酸溶液，濃縮至過飽和后再冷至30℃，可結(jié)晶出無水葡萄糖酸。生物制藥工藝課程乳酸的發(fā)酵制藥乳酸醫(yī)藥用途在病房、手術(shù)室、實(shí)驗(yàn)室等場(chǎng)所中采用乳酸蒸氣消毒，可有效殺滅空氣中的細(xì)菌，起到減少疾病，達(dá)到提高健康之目的；在醫(yī)藥方面廣泛用作防腐劑、載體劑、助溶劑、藥物制劑、pH調(diào)節(jié)劑等；乳酸聚合得到聚乳酸，聚乳酸可以抽成絲紡成線，這種線是良好的手術(shù)縫線，縫口愈合后不用拆線，能自動(dòng)降解成乳酸被人體吸收，無不良后果。尤其是體內(nèi)手術(shù)縫線，免除二次手術(shù)拆線的麻煩。這種高分子化合物可做成粘接劑在器官移植和接骨中應(yīng)用；乳酸可以直接配制成藥物或日常保健品使用；乳酸的性質(zhì)

乳酸是無色至淡黃色透明、漿狀液體，有吸濕性，口味酸澀。乳酸有D-型、L-型和DL-型三種構(gòu)型，只有L-型乳酸才能被人體完全吸收。L-乳酸為左旋性，D-乳酸為右旋性。分子量90.08。結(jié)構(gòu)式表示如下：乳酸菌是一群能利用碳水化合物（主要為葡萄糖）產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱。保加利亞乳桿菌（乳桿菌屬）乳桿菌屬鏈球菌屬明串珠菌屬片球菌屬雙歧桿菌屬嗜熱鏈球菌（鏈球菌屬）乳酸發(fā)酵指糖經(jīng)無氧酵解而生成乳酸的發(fā)酵過程。乳酸代謝同型乳酸發(fā)酵：經(jīng)EMP途徑，生成乳酸。異型乳酸發(fā)酵：經(jīng)PK途徑，生成乳酸和乙醇。雙歧乳酸發(fā)酵：經(jīng)HK途徑，生成乳酸和乙酸。乳酸脫氫酶EMP途徑葡萄糖葡萄糖-6-磷酸葡萄糖酸-6-磷酸5-磷酸核酮糖5-磷酸木酮糖乙酰磷酸乙酰CoA乙醛乙醇ADPATPNADNADH+H+NADNADH+H+NADNADH+H+ADPATPNADNADNADH+H+NADNADH+H+己糖激酶5-磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu)酶磷酸解酮酶磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶乙醛脫氫酶乙醇脫氫酶丙酮酸乳酸脫氫酶PK途徑乳酸

2葡萄糖

2葡萄糖-6-磷酸6-磷酸果糖6-磷酸-果糖2木酮糖-5-磷酸磷酸己糖解酮酶磷酸己糖解酮酶4-磷酸-赤蘚糖乙酰磷酸2甘油醛-3-磷酸2乙酰磷酸2乳酸2乙酸乙酸HK途徑特別提醒：微生物的代謝途徑一般都不是單一的，不論同型乳酸發(fā)酵還是異型乳酸發(fā)酵，實(shí)際代謝產(chǎn)物都不象代謝途徑中那樣單純，兩類乳酸發(fā)酵的代謝產(chǎn)物沒有不可逾越的界限。應(yīng)用范圍：同型乳酸菌發(fā)酵的微生物已經(jīng)用來發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。異型乳酸發(fā)酵的微生物，例如雙歧桿菌，已經(jīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)活菌飲料。

乳酸發(fā)酵微生物（1）乳酸細(xì)菌1）乳酸菌分離釀造發(fā)酸食品采樣泡菜形式富集碳酸鈣透明圈法分離（傾注法倒平板）2）產(chǎn)D-乳酸細(xì)菌德氏乳桿菌：77g/L，轉(zhuǎn)化率90%，D-乳酸比例：90%保加利亞乳桿菌：40g/L，轉(zhuǎn)化率72%，D-乳酸比例：99%左旋乳酸芽孢桿菌菊糖芽孢乳桿菌：98g/L，轉(zhuǎn)化率97%，D-乳酸比例：99%3）產(chǎn)L-乳酸細(xì)菌乳桿菌、鏈球菌、芽孢桿菌趨勢(shì)：嗜熱乳酸桿菌，厭氧高溫發(fā)酵（50℃以上）部分微生物乳酸全部為L(zhǎng)型，部分含少量D-乳酸產(chǎn)乳酸細(xì)菌較多，根據(jù)需要選擇個(gè)別菌屬可產(chǎn)淀粉酶（嗜淀粉乳桿菌）（2）米根霉果園、菜園、花盆土壤中或谷物上分離馬?。∕artin）培養(yǎng)基分離純化最適溫度30℃，產(chǎn)酸多，副產(chǎn)物多，對(duì)糖利用效率低，但可以以淀粉為原料（分泌淀粉酶、糖化酶）

乳酸生產(chǎn)工藝1原料及預(yù)處理碳源1）蔗糖2）糖蜜3）葡萄糖4）淀粉輔料：麥根、麩皮、米糠、玉米漿、毛發(fā)水解液2發(fā)酵工藝（1）細(xì)菌發(fā)酵工藝1）菌種（德氏乳桿菌）A）同型乳酸發(fā)酵的乳酸菌B）營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單C）耐高酸，反饋抑制作用小D）耐高溫，最好在50℃以上2）菌種擴(kuò)大培養(yǎng)（種量5-10%）菌種成熟指標(biāo)：乳酸5-7g/L，細(xì)胞含量7-8*1010個(gè)/ml，鏡檢可以看到2-4個(gè)細(xì)胞排列成鏈，原生質(zhì)均勻，無大的異染顆粒，無雜菌培養(yǎng)基配方：還原糖15%，麥根3.75%，磷酸氫二銨0.25%，碳酸鈣10%種子培養(yǎng)：50℃,24h，接種量1-10%發(fā)酵操作：填料系數(shù)0.8碳酸鈣分批添加，控制pH不低于5.0溫度：50℃發(fā)酵罐敞口，利于二氧化碳逸出殘?zhí)堑陀?g/L發(fā)酵結(jié)束周期：5-6d發(fā)酵結(jié)束，加石灰乳調(diào)pH10.0，提溫至90℃，澄清后進(jìn)入提取工段。（2）米根霉發(fā)酵工藝斜面孢子：30℃,4d種子培養(yǎng)基：葡萄糖11%，尿素0.2%，KH2PO40.06%，MgSO40.025%，ZnSO40.088%,CaCO31%,pH自然，34℃,24h發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15%，尿素0.2%，KH2PO40.02%，MgSO40.025%，ZnSO40.044%,CaCO36.7%(單獨(dú)滅菌),pH自然，34℃,32-34h發(fā)酵結(jié)束，氫氧化鈣中和至pH7.0，壓濾或離心去除菌體3提取工藝發(fā)酵液-----預(yù)處理（堿化）------提取------粗乳酸-------精制------成品乳酸1）細(xì)菌發(fā)酵預(yù)處理發(fā)酵結(jié)束，5水合乳酸鈣，發(fā)酵液變粘，糖濃度高固化發(fā)酵結(jié)束升溫至90-100℃，加入石灰乳，pH調(diào)至9.5-10.0，靜置4-6h（維持溫度55℃），沉渣清液分離活性炭60-70℃脫色，去除色素乳酸鈣結(jié)晶酸解工藝濾液------濃縮--------冷卻結(jié)晶-------離心洗滌--------加熱溶晶--------酸解（硫酸）----------過濾（去除硫酸鈣）----------脫色（活性炭）-------粗乳酸乳酸鈣常溫下溶解度：5%，水溶液pH6.0—7.0，乳酸鈣濃度達(dá)11—14波美度可自然結(jié)晶1）濃縮：12-13波美度（乳酸鈣26—28%）雜質(zhì)影響（雜質(zhì)增加1%，乳酸鈣溶解度增加10%），濃縮前要除雜乳酸鈣結(jié)晶酸解工藝2）結(jié)晶初始溫度30℃----------23℃（1h），投放6—7%晶種23℃-------18℃（1.5h）后溫度每1h降低2℃終溫10℃，保持3—5h晶核形成：不能攪動(dòng)或震動(dòng)，否則會(huì)形成粥狀結(jié)晶，無法和母液分離影響結(jié)晶因素：起晶誘導(dǎo)時(shí)間、晶核形成速度