基于uplc-ms和uplc-ms技術(shù)的土茯苓抑制黃嘌呤氧化酶活性研究

基于uplc-ms和uplc-ms技術(shù)的土茯苓抑制黃嘌呤氧化酶活性研究

高尿酸血癥是痛風(fēng)的重要因素。高尿酸過量、腎衰竭或總體影響導(dǎo)致高尿酸血癥的發(fā)生。目前，該病已成為糖尿病的第二代綿延病。黃嘌呤氧化酶(XanthineOxidase,XOD)能催化黃嘌呤和次黃嘌呤氧化生成尿酸,并產(chǎn)生過氧化物自由基。因此XOD抑制劑通過抑制XOD的活性來減少尿酸生成,用作降尿酸藥物。目前臨床上常用的XOD抑制劑別嘌呤醇及促進(jìn)尿酸排泄藥痛風(fēng)利仙,由于副作用大限制了其在臨床上的應(yīng)用,因此從中草藥及天然藥物中尋找新型抗痛風(fēng)和高尿酸血癥藥物成為藥學(xué)研究的一個熱點。土茯苓,別名土萆薢,為百合科植物光葉菝葜SmilaxglabraRoxb.的干燥根莖,具有除濕、解毒、通利關(guān)節(jié)的功效。臨床常用土茯苓治療高尿酸血癥及痛風(fēng)。研究顯示,土茯苓具有降尿酸作用,對體外XOD活性具有明顯的抑制作用。土茯苓主要有黃酮類、有機酸類等成分,其中黃酮類成分有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛作用,但降尿酸活性物質(zhì)不清。為進(jìn)一步研究土茯苓降尿酸活性的物質(zhì)基礎(chǔ),本研究以體外XOD活性為指標(biāo),系統(tǒng)分離篩選土茯苓抑制XOD活性的有效部位,再用UPLC-MS及HPLC分析有效部位成分,進(jìn)行活性評價,明確土茯苓抑制XOD活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。1儀器、試劑和測試劑WatersAcquity超高效液相色譜儀,配有二極管陣列(DAD)檢測器;WatersQ-TOFmicro質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源(ESI);Masslynx4.1工作站(美國Waters公司)。Waters515高效液相色譜儀,配有2487單波長檢測器,717自動進(jìn)樣器;Empower色譜管理軟件(美國Waters公司)。752紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司);UV-2401紫外分光光度計(日本島津公司)。氯仿、乙酸乙酯、正丁醇(化學(xué)純,購自上海久億化學(xué)試劑有限公司);亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(分析純,購自上海新寶精細(xì)化工廠);黃嘌呤氧化酶(XOD)、二甲基亞砜(DMSO)、黃嘌呤(購自Sigma公司);氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT,購自上海寶曼生物科技有限公司);磷酸緩沖液(pH7.9,50mmol/L)等均為分析純。土茯苓購自安徽亳州,由南京中醫(yī)藥大學(xué)王春根教授鑒定為百合科植物光葉菝葜SmilaxglabraRoxb.的干燥根莖。蘆丁(批號:ZL20100207LD)、落新婦苷(批號:ZL20090917LD)、槲皮素(批號:ZL20090928LD)、柚皮素(批號:ZL20090411LD)、表兒茶素(批號:ZL20101217LD)等對照品,均購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司,HPLC分析質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98.0%。2方法和結(jié)果2.1各種溶劑的xod活性評價2.1.1xod抑制活性測定XOD催化黃嘌呤生成尿酸,尿酸與氯化硝基四氮唑藍(lán)反應(yīng)生成紫色的formazan,當(dāng)XOD的活性受到抑制后,生成的尿酸量減少,紫色formazan的生成也就隨之減少,通過在560nm下測定生成的紫色formazan的吸光度來檢測XOD抑制活性的大小。2.1.2萃取部位待測液制備取土茯苓藥材粉末50g,用10倍量70%乙醇滲漉提取,合并滲漉液,回收至無醇味,用蒸餾水定容至50mL,即為土茯苓樣品溶液。量取土茯苓樣品溶液5mL置分液漏斗中,依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,分別回收溶劑至干,用70%乙醇溶解并定容至10mL,得氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位樣品。精密量取各溶劑部位及土茯苓樣品溶液適量,揮干溶劑,經(jīng)DM-SO溶解,配制成50mg生藥/μL溶液,即為各萃取部位待測溶液。分別精密稱取落新婦苷、蘆丁、槲皮素、柚皮素、表兒茶素對照品適量,經(jīng)DMSO溶解,配制成1μg/mL溶液,即為對照品溶液。2.1.3xod活性測定吸取1.2mL磷酸緩沖液至5mL容量瓶中,再分別加入1.5mL黃嘌呤溶液(2.0mmol/L)和0.2mLNBT(1.8mg/mL),搖勻,即為XOD活性測定用空白溶液。再往該空白溶液加入1.2mLXOD溶液(0.08U/mL),搖勻,即為XOD活性測定用XOD溶液。以XOD溶液的加入開始計時,25℃反應(yīng)30min后,在560nm波長下以空白溶液為對照,測定XOD吸光度A0。2.1.4土茯苓茯苓樣品對xod活性的影響精密吸取“2.1.2”項中土茯苓樣品溶液及各萃取部位待測樣品溶液各30μL置于5mL容量瓶中,按“2.1.3”項下操作分別得到樣品XOD抑制活性測定用空白溶液以及樣品XOD抑制活性測定用XOD溶液。以XOD溶液的加入開始計時,25℃反應(yīng)30min后,在560nm波長下以空白溶液為對照,測定XOD吸光度As。結(jié)果見表1。土茯苓樣品對XOD活性具有較強的抑制作用。在各萃取部位中,乙酸乙酯部位對XOD活性的抑制作用最強,且超過土茯苓樣品,正丁醇及水部位抑制作用較弱,表明乙酸乙酯部位為土茯苓抑制XOD活性的有效部位。2.1.5so吸光度測定分別取2.5、5.0、10.0μL乙酸乙酯部分的DMSO溶液置于5mL容量瓶中,按“2.1.3”項下操作測定吸光度,結(jié)果見表2。乙酸乙酯部位在125~500μg范圍內(nèi)對XOD活性的抑制作用具有量效關(guān)系。2.2乙酸乙酯系統(tǒng)分析2.2.1對照溶液的制備取蘆丁對照品適量,干燥至恒重,精密稱定,加入70%乙醇溶液配制成0.2320mg/mL的對照品溶液。2.2.2土茯苓茯苓總黃酮檢測波長的確定分別取蘆丁對照品溶液及上述土茯苓樣品溶液適量于25mL容量瓶中,加入5%亞硝酸鈉溶液1mL,搖勻,放置6min,加入10%硝酸鋁溶液1mL,搖勻,放置6min,再加入10%氫氧化鈉溶液10mL,加蒸餾水定容至刻度,搖勻,15min后于UV-2401紫外分光光度計中掃描測定,對照品及樣品溶液均在500nm處有最大吸收峰,由此確定測定土茯苓總黃酮的最佳檢測波長為500nm。2.2.3線性范圍精密量取蘆丁對照品溶液2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL分別置于25mL容量瓶中,按“2.2.2”項下操作,在500nm處以相應(yīng)試劑為空白,測定吸收度,根據(jù)樣品量(X)和吸光度(Y)可得回歸方程:Y=0.5308X-0.0054,r=0.9999(n=6),線性范圍為0.4640~1.0440mg。2.2.4重現(xiàn)性與穩(wěn)定性連續(xù)5次精密量取同一份樣品溶液,按照“2.2.2”項下操作測定吸光度,RSD值為2.36%,表明該方法精密度良好。精密稱取5份藥材,按照樣品制備方法進(jìn)行制備,按“2.2.2”項下操作測定吸光度,RSD值為2.48%,表明該方法重現(xiàn)性良好。精密吸取一定量樣品溶液,按照“2.2.2”項下操作,在0、5、10、15、30、60min測定吸光度,RSD值為0.76%,表明該樣品在60min內(nèi)穩(wěn)定。精密稱取6份已知含量的土茯苓藥材1.0g,分別精密加入1.0、2.0、3.0mL蘆丁對照品溶液,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.2.2”項下方法測定含量,結(jié)果見表3,表明該方法準(zhǔn)確。2.2.5黃酮轉(zhuǎn)移率測定分別取“2.1.2”項中土茯苓樣品溶液和乙酸乙酯部位溶液,按“2.2.2”項下操作測定黃酮含量。乙酸乙酯部位黃酮轉(zhuǎn)移率為62.50%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.13%。表明乙酸乙酯部位主要為黃酮類成分。2.3乙酸乙酯系統(tǒng)分析2.3.1冰醋酸溶液b色譜條件:分離采用AcquityT3色譜柱(2.1mm×100mm,1.8μm);流動相甲醇(A)-1.5%冰醋酸(B);梯度洗脫,0~15min,20%~45%A,15~21min,45%~75%A,21~25min,75%~85%A。質(zhì)譜條件:ESI(-),干燥氣流速10L/min,干燥氣溫度350℃,毛細(xì)管電壓3200eV,霧化室壓強275.8kPa,分流比1∶4,掃描范圍m/z100~1000。2.3.2b-1.5%冰醋酸溶液采用DiamonsilC18色譜(250mm×4.6mm,5μm);流動相甲醇(A)-1.5%冰醋酸(B);梯度洗脫,0~60min,10%~45%A,60~85min,45%~75%A,85~95min,75%~85%A,95~100min,85%~10%A。進(jìn)樣量10μL,柱溫30℃,檢測波長280nm。2.3.3質(zhì)譜分析取“2.1”項中乙酸乙酯部位樣品經(jīng)UPLC-ESI-MS分析,得質(zhì)譜總離子流圖(圖1)。依據(jù)各色譜峰的分子離子峰及主要碎片峰的解析、與文獻(xiàn)對比及HPLC法與對照品比對,確定了乙酸乙酯部位中7個黃酮類成分,結(jié)果見表4。2.4黃酮類化合物xod活性評價3不同部位黃酮類成分對xod活性的影響本研究系統(tǒng)分離土茯苓各溶劑部位,以體外XOD活性為指標(biāo),評價其抑制XOD活性作用,結(jié)果顯示,乙酸乙酯部位抑制XOD活性的作用強于原藥材,表明土茯苓藥材中抑制XOD活性的物質(zhì)基礎(chǔ)主要集中于乙酸乙酯部位中。經(jīng)黃酮含量分析表明,土茯苓黃酮類成分是抑制XOD活性的有效部位。再以UP-LC-MS分析及HPLC對照品比對,確認(rèn)了黃酮部位中表兒茶素、落新婦苷、新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷、槲皮素、柚皮素7個成分,進(jìn)一步評價其抑制XOD活性顯示,表兒茶素、落新婦苷、槲皮素及柚皮素為土茯苓抑制XOD活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外對治療高尿酸血癥植物藥的研究發(fā)現(xiàn),黃酮類成分是通過抑制XOD活性及促進(jìn)尿酸排泄等多途徑多靶點防治高尿酸