天冬中總皂苷的含量測定

天冬中總皂苷的含量測定

天冬是百合科植物天冬的干燥部位。它對滋陰、潤干、清肺和液體發(fā)生器也有很好的效果。這是臨床上常用的中藥之一?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抑菌、抗衰老、鎮(zhèn)咳祛痰、抗蚊蠅等藥理作用。天冬中含有皂苷類、多糖類和氨基酸類等多種化學(xué)成分,其中皂苷類成分,主要包括以菝葜皂苷元、薯蕷皂苷元、雅姆皂苷元等皂苷元為非糖部分的多種甾體皂苷,是天冬中主要有效成分。藥理研究也顯示天冬中皂苷類成分具有抑菌、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫能力等藥理活性11～33。因此,測定天冬中總皂苷含量對評(píng)價(jià)天冬藥材的質(zhì)量具有重要意義。2000版中國藥典中天冬項(xiàng)下只有水分和醇溶性浸出物的檢查,無內(nèi)在質(zhì)量控制指標(biāo)”。顯然,現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)難以客觀評(píng)價(jià)天冬的內(nèi)在質(zhì)量。因此,筆者對天冬中總皂苷的含量測定進(jìn)行了方法學(xué)考察,重點(diǎn)考察了樣品的不同制備方法及不同顯色劑對總皂苷含量測定的影響,盡可能的排除天冬中大量糖類成分的干擾。首次采用分光光度法,選用菝葜皂苷元(Sarsasapogenin,C27H44O3)為對照品,通過高氯酸顯色,計(jì)算天冬藥材中總皂苷的含量,并測定了不同產(chǎn)地天冬及四川內(nèi)江天冬CAP基地中不同生育期的天冬藥材中總皂苷的含量。該實(shí)驗(yàn)為考察天冬的內(nèi)在質(zhì)量提供了一定的依據(jù)。1設(shè)備和材料1.1uvns實(shí)驗(yàn)PerkinElmer分光光度計(jì)(Larabola35UVNISspectrometer);BP2110電子分析天平(德國Sartorius);DSY一2—4孔電熱恒溫水浴鍋(北京愛琦商貿(mào)中)。1.2皂苷元對照品,msasap膜天冬樣品均由鑒定教研室李敏副教授自行采集并鑒定,見表4;菝葜皂苷元對照品(Sarsasapogenin)(中國藥品生物制品鑒定所<定量用>);其余所用試劑均為分析純。2方法研究2.1對照晶溶液的制備精密稱取菝葜皂苷元對照品3mg,置于10ml容量瓶中,加甲醇溶解并定容即得。2.2香草醛乙醇液和硫酸ld因菝葜皂苷元分子中不具共軛結(jié)構(gòu),不宜用UV檢測,故須采用顯色劑顯色。本實(shí)驗(yàn)對4種顯色劑(0.2ml香草醛--冰醋酸和0.8ml高氯酸;8%香草醛乙醇液和77%硫酸;高氯酸:94%硫酸)進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)用高氯酸在65℃水浴加熱顯色15min后,取出,立即置冰水浴中15min停止反應(yīng),搖勻,隨行試劑空白,在200～600nm波長范圍內(nèi)繪制吸收曲線,發(fā)現(xiàn)對照品溶液與樣品溶液在308～315nm間均有最大吸收峰,且較為穩(wěn)定,漂移較小,方法簡單,故最后確定采用高氯酸在上述條件下顯色。2.3檢測曲線繪制精密吸取菝葜皂苷元對照品溶液與樣品溶液0.8ml,按2.2顯色方法顯色后,在200～600nm波長范圍內(nèi)繪制吸收曲線,發(fā)現(xiàn)菝葜皂苷元在308～31lnm處;樣品溶液在309～315nm處顯較強(qiáng)吸收,空白溶液在此范圍內(nèi)僅有微弱吸收,經(jīng)多次掃描后確定測定波長為310nm。2.4吸收值的測定精密吸取對照品溶液0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml于三角瓶中,置水浴中揮干甲醇,加高氯酸10ml,搖勻后同2.2項(xiàng)下顯色方法顯色,隨行試劑空白,在310nm處測定吸收值。以菝葜皂苷元質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo),吸收值A(chǔ)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得數(shù)據(jù)見表1、圖1。經(jīng)計(jì)算得回歸方程為;Y=1.7588X-0.0165,r=0.9991,菝葜皂苷元在0.18～0.42mg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,因標(biāo)準(zhǔn)曲線為不經(jīng)過原點(diǎn),故采用外標(biāo)兩點(diǎn)法測定樣品。2.5樣品溶液的制備精密稱取0.5g藥材粉末,置索氏提取器內(nèi),加l00ml氯仿脫脂2h,殘?jiān)鼡]去溶劑后,再加甲醇100ml在80℃回流提取至無色,溶液回收甲醇至干,加蒸餾水10ml溶解,用水飽和的正丁醇萃取四次(15ml、10ml、10ml、10ml),合并正丁醇部分,用正丁醇飽和的水洗滌,減壓回收至干,殘?jiān)眉状既芤憾ㄈ葜?0ml,制得樣品溶液。2.6測定多次的測定取樣品按2.2項(xiàng)下方法顯色后,每隔10min測定1次,數(shù)據(jù)見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明,在1h內(nèi)同一樣品液的測定結(jié)果基本穩(wěn)定,RSD為1.72%。2.7精密度測試定量吸取同一樣品液液,共6份,按2.2項(xiàng)下方法顯色后測定,數(shù)據(jù)見表3。試驗(yàn)結(jié)果表明,方法的精密度較好,RSD為1.03%。2.8加樣回收率測定分別精密稱取已測知含量的天冬樣品5份。每份重0.5g。分別各加入一定量菝葜皂苷元對照品,按2.5項(xiàng)下方法制備樣品溶液,依法測定,計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為98.80%,RSD為1.18%。2.9不同產(chǎn)地、不同性別、不同藥用部位樣品中總皂苷含量的變化精密吸取各樣品液,按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法顯色,測定,以菝葜皂苷元(C27H44O3)計(jì)算各樣品中天冬總皂苷的含量,含量均以干燥品計(jì)。本實(shí)驗(yàn)共測定了6個(gè)不同產(chǎn)地(生長期均為2～3年)和12個(gè)不同生育期、不同藥用部位樣品中總皂苷的含量,結(jié)果見表4、表5。由表4可得出:不同產(chǎn)地的天冬藥材中總皂苷的含量差別較大。以上四川內(nèi)江產(chǎn)天冬均為藥典收載品種A.cochinchinensis(Lour.)Merr.郭北鎮(zhèn)、雙風(fēng)鎮(zhèn)為“四川內(nèi)江天冬規(guī)范化種植示范區(qū)”試驗(yàn)基地所在地。由表5可得出:天冬中總皂苷的含量隨生育期的增長而增大。天冬皮中總皂苷的含量也較高。3討論3.1開環(huán)類哌體皂苷的測量方法對于天冬中甾體皂苷含量測定方法,曾有資料報(bào)道。該方法中所用對為天冬皂苷AspIV、AspV、AspVI,國內(nèi)極難得到,且其選用的Ehrlish試鹽酸一對二甲氨基苯甲醛試劑)為開環(huán)類甾體皂苷的專屬性顯色劑,而天冬含皂苷并非全為開環(huán)類甾體皂苷,因此上述方法測定范圍較狹窄,可行性不高。在與天冬的功能主治相吻合的化學(xué)成分不明確的情況下,筆者選用菝葜皂苷元為對照品,通過高氯酸顯色,來測定計(jì)算天冬中總皂苷的含量,該法簡便、準(zhǔn)確、靈敏,重現(xiàn)性良好,可用于天冬質(zhì)量控制及GAP研究。3.2樣品溶液制備方法對總皂苷測定的影響樣品溶液制備時(shí),筆者根據(jù)天冬藥材的性質(zhì)及所含化學(xué)成分,參照人參等藥材中總皂苷含量測定方法,分別從是否脫脂、水飽和的正丁醇萃取次數(shù)及是否用正丁醇飽和的水洗滌等3個(gè)方面考察了樣品溶液制備方法對總皂苷含量測定的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:樣品溶液經(jīng)過氯仿脫脂后,除去非皂苷類的親脂性雜質(zhì),再用甲醇熱提,然后用水飽和的正丁醇萃取4次,最后再用正丁醇飽和的水洗滌1次,制得的樣品溶液澄清,基本排除了天冬中大量糖類等雜質(zhì)的干擾,且對皂苷提取完全(萃取4次與萃取5、6次制得的樣品所測含量相差極小)。該樣品制備方法簡單,對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高,適用于一般實(shí)驗(yàn)室測定大量樣品,尤其適用于天冬藥材GAP研究中各項(xiàng)規(guī)范化操作規(guī)程(SOP)的大量因素的篩選比較,故確定采用2.5樣品制備方法。3.