uplc-msms法同時測定注射用辛芍凍干粉針中8種成分的含量

uplc-msms法同時測定注射用辛芍凍干粉針中8種成分的含量

射箭注釋（冷凍干粉針）是用現(xiàn)代紅茶、燈火以及冷冷凍干燥法從現(xiàn)代紅茶中提取出來的中藥。具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)的功效，主要用于中風和血瘀阻絡(luò)證的臨床治療。能迅速改善腦缺血動物的癥狀,對腦缺血性大鼠及小鼠有明顯保護作用;增加大鼠腦血流,改善缺血大鼠腦微循環(huán)［1－4］。多成分含量測定方法是中藥現(xiàn)代化質(zhì)量控制的重要手段和趨勢。液質(zhì)聯(lián)用法由于專屬性強、靈敏度高,已經(jīng)越來越多地應用于中藥及其制劑的質(zhì)量控制研究中［5－6］。為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量,確保本品的臨床療效,采用UPLC-MS/MS法建立了注射用辛芍(凍干粉針)中7個主要成分的含量測定方法,該方法操作簡便,快速靈敏,重現(xiàn)性好,為全面準確地控制注射用辛芍(凍干粉針)的質(zhì)量提供了科學依據(jù)。ACQUITYTM系統(tǒng)超高液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(包括二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、三重四級桿質(zhì)量分析器和Masslynx4.1質(zhì)譜工作站,美國Waters公司)。沒食子酸(批號:110831-200803)、芍藥苷(批號:110736-200934)和野黃芩苷(批號:110842-201106)對照品購自中國食品藥品檢定研究院;氧化芍藥苷(批號:20120310)、芍藥內(nèi)酯苷(批號:S37-100126)、燈盞甲素(批號:20120706)和苯甲酰芍藥苷(批號:20120321)對照品購自中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心;注射用辛芍(凍干粉針,貴州省藥物制劑重點實驗室提供,規(guī)格:200mg/支,批號:20100612,20100620,20100703)。乙腈(德國Merck公司)、甲酸(美國Tedia公司)為色譜純;水為超純水;其他試劑均為分析純。方法和結(jié)果1流動相及流場色譜柱為WATERSACQUITYBEHC18柱(50mm×2.1mm,1.7μm);流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液,線性梯度洗脫程序見表1;流速為0.35mL·min－1;柱溫為45℃;進樣量為1μL。2正負離子同步檢測離子源電噴霧電離源(ESI);毛細管電壓3.0kV;離子源溫度120℃;去溶劑氣N2,流速650L·h－1;去溶劑氣溫度350℃;離子源溫度120℃;碰撞氣Ar,流速0.18mL·min－1;多反應離子監(jiān)測(MRM)模式進行正負離子同步檢測;監(jiān)測離子對分別為:沒食子酸,m/z(-)168.9→125.0;氧化芍藥苷,m/z(-)495.3→136.9;芍藥內(nèi)酯苷,m/z(+)481.3→105.0;芍藥苷,m/z(-)525.2→121.0;野黃芩苷,m/z(+)463.1→287.1;燈盞甲素,m/z(+)447.2→271.1;苯甲酰芍藥苷,m/z(-)583.3→120.9。3對照品溶液的制備精密稱取氧化芍藥苷對照品6.17mg、燈盞甲素對照品2.08mg、苯甲酰芍藥苷對照品10.04mg,置50mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,即得混合對照品溶液A;精密稱取沒食子酸對照品6.37mg、芍藥內(nèi)酯苷對照品5.06mg、芍藥苷對照品15.63mg、野黃芩苷對照品10.42mg,置100mL量瓶中,精密加入混合對照品溶液A10mL置量瓶,加甲醇稀釋至刻度,即得混合對照品溶液B。4供試品溶液制備取本品內(nèi)容物0.1g,精密稱定,置100mL量瓶中,加水使溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密吸取該液5mL,置50mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,用0.22μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作供試品溶液。5測定化合物與對照品溶液的保留時間精密吸取混合對照品溶液B、供試品溶液各1μL,分別進樣,結(jié)果見圖1。供試品溶液中被測定化合物與7個對照品的保留時間相同。比較被測定成分和對照品的母離子、子離子質(zhì)譜圖,兩者一致,表明本法專屬性良好。6儀器精密度與重復性6.1線性關(guān)系考察精密量取混合對照品溶液B1,2,4,6,8,10mL分別置于6個25mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,制得6個系列濃度線性工作液,分別進樣測定。以色譜峰峰面積(A)為縱坐標,以對照品濃度(C)為橫坐標進行線性回歸,得各被測成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及定量限(LOQ)和檢測限(LOD),見表2。6.2精密度取混合對照品溶液重復進樣6次,測定峰面積。沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、野黃芩苷、燈盞甲素和苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD(n=6)為2.69%,1.79%,3.07%,2.85%,3.71%,2.13%,3.93%。結(jié)果表明,儀器精密度良好。6.3重復性精密稱取同一批注射用辛芍(凍干粉針)(批號:20100612),共6份,按“供試品溶液”項下方法操作,在上述色譜條件下進樣,沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、野黃芩苷、燈盞甲素和苯甲酰芍藥苷的平均含量(n=6)分別為9.27%,1.22%,7.32%,23.71%,16.39%,0.39%,3.66%;RSD(n=6)分別為3.23%,2.14%,3.82%,1.73%,3.01%,2.59%,1.35%。結(jié)果表明,重復性良好。6.4穩(wěn)定性取同一批注射用辛芍(凍干粉針)樣品(批號:20100612),分別在0,1,2,4,8,12h進樣分析,測得沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、野黃芩苷、燈盞甲素和苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD(n=6)分別為2.43%,3.66%,2.59%,3.87%,3.03%,4.17%,3.23%。結(jié)果表明,供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。7注射用辛嫌犯凍干粉針的理化性質(zhì)測定隨著色譜技術(shù)的發(fā)展和儀器性能的提高,多成分含量測定方法已成為中藥現(xiàn)代化質(zhì)量控制的重要手段和趨勢［7－8］,與現(xiàn)行的單一指標成分定性、定量檢測的中藥質(zhì)量評價方法相比,可有效地量化檢測中藥各化學成分的綜合信息,突出了中藥整體性的特點,更為科學合理。本研究采用UPLC-MS/MS建立了注射用辛芍(凍干粉針)多指標成分含量測定方法,在4min內(nèi)同時測定了制劑中7個含量相對較高的指標成分,簡便、快速、準確,并實現(xiàn)了對藥物成分整體把握,可較為全面地控制注射用辛芍(凍干粉針)質(zhì)量。為加強中藥、天然藥物注射劑的質(zhì)量管理,促進中藥、天然藥物研制工作進一步規(guī)范化、科學化和標準化,2008年12月國家食品藥品監(jiān)督管理局正式出臺了《中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求》,規(guī)定注射劑中所含成分應基本清楚,多成分制成的注射劑,總固體中結(jié)構(gòu)明確成分的含量應不少于60%。本研究對3個批次的注射用辛芍(凍干粉針)中試樣品進行了測定,其可測成分含量在61.24%~63.47%之間,基本符合《中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求》,為注射用辛芍(凍干粉針的研究開發(fā)提供了科學依據(jù)。加樣回收率及rsd6.5回收率精密稱取6份已知含量的注射用辛芍(凍干粉針)樣品(批號:20100612)約0.05g,分別精密加入0.563mg·mL-1沒食子酸、0.084mg·mL-1氧化芍藥苷、0.437mg·mL-1芍藥內(nèi)酯苷、1.437mg·mL-1芍藥苷、1.003mg·m