下丘腦-垂體-卵巢軸促性腺激素釋放激素在去卵巢時(shí)的表達(dá)及電針處理對(duì)自然代償大鼠的影響

下丘腦-垂體-卵巢軸促性腺激素釋放激素在去卵巢時(shí)的表達(dá)及電針處理對(duì)自然代償大鼠的影響

臨床上，采用針灸治療兩側(cè)卵巢切除術(shù)和更年期綜合征，取得了明顯的療效，可以完全取代西醫(yī)的“激素替代療法”。然而,也有臨床報(bào)道,“圍絕經(jīng)期綜合征”患者體內(nèi)的雌激素水平降低,出現(xiàn)諸如潮熱出汗、易怒煩躁、心悸、失眠等癥狀,在發(fā)病6～12個(gè)月后,大部分人不經(jīng)治療,臨床癥狀會(huì)有所改善,血雌激素水平也逐步回升。提示人體生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)可能存在一種自然代償?shù)臋C(jī)制。另外,有文獻(xiàn)報(bào)道,母羊被切除單側(cè)卵巢后,排卵率顯著升高,也提示機(jī)體在生殖功能方面,存在有自然代償?shù)臋C(jī)制。我們以往研究結(jié)果表明,在去卵巢導(dǎo)致HPOA功能異常的大鼠模型上,電針一組穴位3次后,動(dòng)物陰道涂片中,上皮細(xì)胞成熟脫落現(xiàn)象重新出現(xiàn),血雌激素水平也隨之升高,下丘腦內(nèi)出現(xiàn)GnRH在PVN的異位表達(dá),并且有GnRH與CRH共存于同一個(gè)神經(jīng)元中。電針的這種作用與婦女長(zhǎng)期患有“圍絕經(jīng)期綜合征”后,出現(xiàn)的自然代償非常相似。為此我們提出了以下設(shè)想:針刺處理后,大鼠下丘腦內(nèi)出現(xiàn)GnRH在PVN的異位表達(dá),是電針特異的作用,還是卵巢功能衰退后,經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間,機(jī)體本身會(huì)啟動(dòng)一種潛在的代償機(jī)制,以補(bǔ)償本身的HPOA功能低下,而電針處理可能提早啟動(dòng)了這一自我代償?shù)倪M(jìn)程,本文將就這些問(wèn)題進(jìn)行了探討。1材料和方法1.1陰道缺失菌株的檢測(cè)雌性Sprague-Dawley大鼠,45日齡左右,180～200g,購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于12h光照/12h黑暗的環(huán)境中,自由攝食和飲水。經(jīng)陰道涂片觀察陰道脫落細(xì)胞存在典型的4天周期性變化者,在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)一星期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物的處理符合國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)則。1.2陰道涂片檢查動(dòng)物隨機(jī)分為正常組(INT)、去卵巢組(OVX)、自然代償組(OVX3M組、OVX4M組、OVX5M組、OVX6M組)以及去卵巢加電針組(OVX+EA),每組6只大鼠。OVX動(dòng)物在乙醚麻醉下作雙側(cè)卵巢切除術(shù),術(shù)后與INT動(dòng)物在相同條件下喂養(yǎng)1個(gè)月后,連續(xù)3d作陰道涂片檢查,涂片中未見(jiàn)到成熟脫落上皮細(xì)胞作為卵巢切除成功的指標(biāo)。此時(shí)給予電針組以電針,選取腹部穴位“關(guān)元”(RN4)、“中極”(RN3)、雙側(cè)“子宮”(EXCA1)以及下肢穴位“三陰交”(SP6),采用連續(xù)波,刺激頻率3Hz,強(qiáng)度2mA(G6805-Ⅱ型電針儀,上海醫(yī)用器材廠生產(chǎn)),每天1次,連續(xù)3天。末次電針后6h,將OVX+EA與INT及OVX動(dòng)物同時(shí)灌注處死。自然代償組動(dòng)物分別于去卵巢之后3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月時(shí)處死,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.3大鼠尾動(dòng)脈取血、分離、測(cè)定處死前分別于OVX組、自然代償(OVX3M、OVX4M、OVX5M以及OVX6M)組以及OVX+EA組大鼠尾靜脈取血,INT大鼠于動(dòng)情間期取血。血樣品在室溫放置2h,3000×g離心20min,分離出血清,-70℃保存?zhèn)溆?。雌二醇RIA藥盒由上海生物制品研究所生產(chǎn)。按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。本方法的最小檢測(cè)量小于10pg/mL。1.4gnrh和兔抗大鼠crh的染色動(dòng)物電針組給予電針后6h以及非電針組,經(jīng)7%水合氯醛麻醉后,常規(guī)灌注固定。下丘腦部分制成30μm厚的連續(xù)冠狀位冰凍切片,用于H.E.、免疫組化染色及免疫熒光雙標(biāo)記染色。小鼠抗大鼠GnRH和兔抗大鼠CRH多克隆抗體為第一抗體,購(gòu)自美國(guó)Chemicon及SantaCruz公司,工作濃度分別為1∶500,1∶100。腦片在第一抗體液中,于37℃分別孵育3h和2h,4℃72h和48h。常規(guī)封固。陰性對(duì)照分別用正常小鼠血清和0.01MPBS(pH7.4)代替第一抗體,正常羊血清代替第二抗體,進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn),作陰性對(duì)照。1.5tritc-淮山抗兔的誘導(dǎo)誘導(dǎo)表達(dá)腦片于1%Triton-x100中孵育10min,漂洗3×5min;后入封閉液中37℃孵育30min;入GnRH和CRH一抗中,濃度分別為1∶300和1∶100,37℃孵育3h,4℃72h;加入TRITC-山羊抗兔IgG(1∶100)和FITC-山羊抗小鼠(1∶100)(購(gòu)自Jackson公司)混合液,37℃孵育2h,漂洗3×30min;90%甘油封片。激光共聚焦顯微鏡(CLSM,德國(guó)Leica公司)掃描并記錄。2結(jié)果2.1大鼠血民法2的表達(dá)大鼠切除卵巢后1個(gè)月,血E2水平顯著下降,去卵巢后3個(gè)月血E2水平為(16.72±3.19)pmol/mL,開(kāi)始逐漸上升,4個(gè)月時(shí)為(28.10±8.88)pmol/mL,明顯升高,至6個(gè)月時(shí)為(31.12±6.61)pmol/mL。電針后大鼠血E2水平為(27.04±3.93)pmol/mL,相當(dāng)于去卵巢后5個(gè)月的血E2水平。大鼠切除卵巢后,血雌激素水平隨著時(shí)間的變化逐步升高,如圖1所示,至5～6個(gè)月時(shí),幾乎呈平穩(wěn)趨勢(shì)。2.2大鼠腦室旁核中g(shù)nrh的表達(dá)我們觀察到,在大鼠下丘腦PVN有深褐色橢圓形或梭形的神經(jīng)元細(xì)胞,為GnRH的免疫陽(yáng)性物。OVX+EA組發(fā)現(xiàn)有50%的大鼠下丘腦室旁核有GnRH的表達(dá)。自然代償OVX3個(gè)月組,發(fā)現(xiàn)有16.7%的大鼠下丘腦室旁核有GnRH的表達(dá);OVX4個(gè)月組,有33.3%的大鼠有GnRH的表達(dá);OVX5個(gè)月組,有50%的大鼠在下丘腦室旁核有GnRH的表達(dá);OVX6個(gè)月組,有50%的大鼠下丘腦PVN有GnRH的表達(dá),如圖2所示。而INT和OVX組大鼠下丘腦室旁核未見(jiàn)有GnRH的表達(dá)。我們做了自然代償組PVN區(qū)相鄰兩張連續(xù)切片的GnRH與CRH免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果觀察到PVN區(qū)幾乎相同的部位分別有GnRH與CRH免疫陽(yáng)性物的表達(dá),如圖3所示。2.3抗兔igg抗體檢測(cè)用免疫熒光雙標(biāo)結(jié)合激光共聚焦的方法觀察自然代償組大鼠下丘腦PVN中CRH與GnRH是否共存。選用兩種熒光標(biāo)記的第二抗體。TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體顯示紅色熒光,FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體顯示綠色熒光。經(jīng)共聚焦顯微鏡處理后,若雙重標(biāo)記物質(zhì)即顯黃色熒光。我們觀察到,在PVN呈綠色熒光的CRH神經(jīng)元細(xì)胞漿內(nèi)有呈紅色熒光的GnRH免疫陽(yáng)性物,并且有雙重標(biāo)記的黃色熒光,如圖2所示,即表明,在自然代償組GnRH與CRH免疫陽(yáng)性物的共表達(dá)于同一個(gè)神經(jīng)元。3不同穴位對(duì)hpoa功能異常的調(diào)整作用現(xiàn)代病理生理學(xué)認(rèn)為,“圍絕經(jīng)期綜合征”是由于卵巢功能衰退或被去除,導(dǎo)致HPOA功能發(fā)生異常,從而引起全身,特別是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的機(jī)能紊亂所致的一種婦女常見(jiàn)病。西醫(yī)采用激素替代療法(hormonereplacementtherapy,HRT)治療該病,療效雖然顯著,但長(zhǎng)期使用激素會(huì)使患者發(fā)生乳腺癌、子宮癌、結(jié)腸癌和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增多,因此尋找一種療效可靠,副作用小的治療方法在臨床上非常重要。針刺療法是中國(guó)傳統(tǒng)的治病方法,在臨床上,用于治療“圍絕經(jīng)期癥候群”已取得滿(mǎn)意療效。針刺療法完全可以規(guī)避“激素替代療法”的不足之處,成為治療婦女“圍絕經(jīng)期綜合征”的主要治療手段。但到目前為止,國(guó)內(nèi)外采用針刺治療“圍絕經(jīng)期綜合征”尚不普及,其主要原因是針刺治病的現(xiàn)代科學(xué)機(jī)理尚不清楚。因此,系統(tǒng)深入研究針刺治療圍絕經(jīng)期癥候群的機(jī)制,應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的語(yǔ)言闡釋針刺治病的科學(xué)內(nèi)涵,是更好地推廣針刺治病的需要。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,“圍絕經(jīng)期綜合征”屬于“經(jīng)斷前后諸癥”的范疇?！端貑?wèn)·上古天真論》有“女子七歲,腎氣盛,齒更發(fā)長(zhǎng)。二七而天癸至,任脈通,太沖脈盛,月事以時(shí)下,故有子。三七腎氣平均,故真牙生而長(zhǎng)極。四七筋骨堅(jiān),發(fā)長(zhǎng)極,身體盛壯。五七陽(yáng)明脈衰,面始焦,發(fā)始?jí)?。六七三?yáng)脈衰于上,面皆焦,發(fā)始白。七七任脈虛,太沖脈衰少,天癸竭,地道不通,故形壞而無(wú)子也”的論述。闡明了“圍絕經(jīng)期綜合征”的病機(jī)是與婦女進(jìn)入老年期后腎氣衰、任脈虛、太沖脈衰少有關(guān)。因此,本文采用一組對(duì)“經(jīng)斷前后諸癥”具有良好臨床療效的穴位,以關(guān)元、三陰交為主穴,配以中極,子宮穴,對(duì)大鼠“圍絕經(jīng)期綜合征”模型進(jìn)行針刺實(shí)驗(yàn)性處理,滿(mǎn)意地驗(yàn)證了這組穴位對(duì)HPOA異常功能的調(diào)整作用。關(guān)元為任脈經(jīng)穴,并與沖脈相通,具有補(bǔ)腎、益氣和血之功。三陰交為肝、脾、腎三經(jīng)的交會(huì)穴,而沖任帶三脈又與肝、脾、腎關(guān)系密切,故取之可以調(diào)補(bǔ)沖任,疏肝理脾,起到補(bǔ)益肝脾腎三臟的作用。中極亦為足三陰經(jīng)與任脈的交會(huì)穴,可以補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)。子宮為腹部的經(jīng)外奇穴,是治療婦人胞宮病癥的經(jīng)驗(yàn)要穴。因此針刺該組穴位確能調(diào)整HPOA功能異常,對(duì)“圍絕經(jīng)期綜合征”有良好的治療作用。我們以往的研究結(jié)果表明,在對(duì)去卵巢大鼠電針關(guān)元、三陰交等穴位后,動(dòng)物外周血雌激素水平回升,陰道脫落細(xì)胞重新出現(xiàn);下丘腦GnRH超常釋放和垂體促性腺激素的過(guò)高分泌明顯抑制;下丘腦CRH的合成、釋放及基因表達(dá)增加;生理情況下,下丘腦PVN中無(wú)GnRH的存在,但切除卵巢1月后的大鼠接受3次電針處理后,出現(xiàn)GnRH免疫陽(yáng)性物在PVN的異位表達(dá),并與CRH共存在于同一神經(jīng)元中。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,切除卵巢后的大鼠經(jīng)過(guò)3～6個(gè)月,在PVN逐漸出現(xiàn)GnRH異位表達(dá),而在切除卵巢1～2個(gè)月以及正常大鼠下丘腦PVN內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)有GnRH免疫陽(yáng)性物。提示機(jī)體在HPOA功能異常情況下,可能存在一種潛在的代償機(jī)制。它一方面通過(guò)GnRH的異位表達(dá),并與CRH共存在同一神經(jīng)元中,可能啟動(dòng)了一種新的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)通路,使HPOA和HPAA兩項(xiàng)內(nèi)分泌軸的相互調(diào)節(jié)作用加強(qiáng),HPAA功能的活躍,導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)功能增強(qiáng),皮質(zhì)甾體激素包括合成雌激素的前體雄性激素的合成增多;另一方面,可能促進(jìn)了機(jī)體的性腺外芳香化作用,使性腺外組織如脂肪、肝和腦等組織的組織芳香化酶的活性和表達(dá)增加,體內(nèi)的雌激素水平升高,從而部分自然代償了大鼠因切除卵巢而導(dǎo)致的HPOA的功能低下。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,不同的動(dòng)物切除卵巢后,對(duì)血E2水平都有影響。但是,大多數(shù)文獻(xiàn)都采用去卵巢后幾天或1～2周的動(dòng)物模型作為研究對(duì)象,未作大鼠切除卵巢后血E2水平變化的長(zhǎng)時(shí)程觀察。本文對(duì)切除卵巢后的大鼠E2水平作了6個(gè)月較長(zhǎng)時(shí)間的觀察,結(jié)果表明,大鼠切除卵巢1～2個(gè)月后的血E2水平比INT顯著降低;到3個(gè)月時(shí)