nf1基因表達(dá)產(chǎn)物神經(jīng)纖維素在正常成年大鼠腦中的分布

nf1基因表達(dá)產(chǎn)物神經(jīng)纖維素在正常成年大鼠腦中的分布

nf1是一種常染色體遺傳疾病，由神經(jīng)細(xì)胞因異常程度而導(dǎo)致大部分身體系統(tǒng)損傷。發(fā)病率為1/（30003500）。此病的主要特點(diǎn)為外周神經(jīng)多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤以及皮膚的咖啡色素斑。在NF1發(fā)病過程中,NF1基因的突變極為關(guān)鍵。NF1基因?yàn)橐环N腫瘤抑制基因,該基因定位于第17號染色體長臂1區(qū)1帶2亞帶(17q11.2),由其編碼的蛋白質(zhì)為神經(jīng)纖維素(neurofibromin)。神經(jīng)纖維素參與細(xì)胞的生長與分化,其氨基酸序列與哺乳類GTP酶活化蛋白(GTPaseactivatingprotein,GAP)家族相似,可加速GTP水解成GDP,從而將細(xì)胞原癌基因ras編碼的蛋白質(zhì)p21ras從活化型的三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合形式p21ras-GTP轉(zhuǎn)化為失活型的二磷酸鳥苷(GDP)結(jié)合形式p21ras-GDP,使原癌基因ras活性下調(diào),從而發(fā)揮抑癌作用。盡管有證據(jù)表明NF1基因作為腫瘤抑制基因在控制細(xì)胞的生長分化過程中起重要作用,但目前對神經(jīng)纖維素的作用機(jī)制尚不很清楚。如擬研究神經(jīng)纖維素的功能,必須首先搞清楚神經(jīng)纖維素在腦組織的表達(dá)。目前,關(guān)于神經(jīng)纖維素在成年動物腦組織分布的報道尚少且結(jié)果也不盡相同。本研究運(yùn)用免疫熒光組化法對成年大鼠腦中神經(jīng)纖維素的分布進(jìn)行了觀察,同時使用了兔抗神經(jīng)纖維素血清和小鼠抗星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性酶—膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體等兩種抗體作為一抗,以確定神經(jīng)纖維素在星形膠質(zhì)細(xì)胞是否表達(dá)。材料和方法1.zamheni溶液成年SD雄性大鼠5只,體重200～300g,用3%戊巴比妥鈉(1ml/kg體重)腹腔內(nèi)注射麻醉后經(jīng)升主動脈灌注,固定。先用生理鹽水50～100ml快速沖洗,后用Zamboni液(含2%多聚甲醛和15%苦味酸的0.1mol/L磷酸緩沖液,pH7.4)約200ml灌注50min。取腦修塊,置相同固定液中4℃后固定25h,然后將腦塊浸于含20%蔗糖的0.0lmol/LPB(pH7.4,4℃)中至沉底。恒冷箱冠狀連續(xù)切片,片厚30μm,每隔-片取1片。2.免疫熒光觀察切片經(jīng)0.0lmol/LPBS(pH7.4)漂洗5min×3次,0.3%TritonX-100處理1h(37℃),再用10%正常山羊血清孵育1h(37℃)。同前漂洗后,用間接法進(jìn)行免疫熒光反應(yīng):(1)在含兔抗神經(jīng)纖維素血清(NF1GRP,1∶80,SantaCruz)和小鼠抗GFAP單克隆抗體(1∶1200,Chemicon)的稀釋液中孵育2h(37℃);(2)用PBS洗2次,每次5min;(3)在含有FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶200,SantaCruz)和rhodamine標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶200,SantaCruz)稀釋液中孵育4h(室溫);(4)切片用PBS清洗后,裱片,干燥后用緩沖甘油封片,熒光顯微鏡(NikonUFX-Ⅱ)觀察,照相。替代實(shí)驗(yàn)用1∶10正常山羊血清代替一抗,其余步驟同實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。神經(jīng)纖維素陽性細(xì)胞神經(jīng)纖維素陽性細(xì)胞在4號濾色片(波長為490nm)下發(fā)綠色熒光;GFAP反應(yīng)陽性細(xì)胞在3號濾色片(波長為550nm)下呈紅色熒光。本實(shí)驗(yàn)觀察到神經(jīng)纖維素在端腦、間腦、腦干和小腦中都有廣泛分布(表1,Fig.1),熒光標(biāo)記物分布在神經(jīng)細(xì)胞的核周質(zhì)及胞核中,在部分較大的細(xì)胞還能見到其突起中也有綠色熒光標(biāo)記物分布。在4號濾色片下觀察時,可見在大腦皮質(zhì)中神經(jīng)纖維素陽性細(xì)胞最為密集(Figs.2,3)。海馬結(jié)構(gòu)CA1～CA3區(qū)、齒狀回、丘腦前核群、丘腦內(nèi)側(cè)核群(Fig.4)、丘腦板內(nèi)核群、丘腦中線核群及下丘腦室周核、室旁核等處的神經(jīng)纖維素陽性細(xì)胞也比較密集。杏仁核(Fig.5)、視交叉上核、視上核、乳頭體上核、頂蓋前區(qū)、下丘腦前區(qū)、下丘腦外側(cè)區(qū)、下丘腦后區(qū)以及小腦的Purkinje細(xì)胞層、顆粒層等部位也有數(shù)量較多的神經(jīng)纖維素陽性標(biāo)記細(xì)胞。此外,尾殼核、屏狀核、蒼白球、韁內(nèi)側(cè)核、韁外側(cè)核、外膝狀體核、內(nèi)膝狀體核、隔外側(cè)核(Fig.6)、隔內(nèi)側(cè)核、隔下丘腦核以及下丘腦外側(cè)前核、下丘腦背側(cè)核(Fig.7)、頂蓋前區(qū)(Fig.8)、三叉神經(jīng)脊束核、蝸神經(jīng)背核(Fig.9)、蝸神經(jīng)腹核、前庭上核、前庭內(nèi)側(cè)核(Fig.10)、前庭外側(cè)核、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核等部位也有數(shù)量不等的神經(jīng)纖維素陽性細(xì)胞分布。在4號濾色片下觀察到的神經(jīng)纖維素陽性細(xì)胞由于其所在腦區(qū)的不同,其胞體大小及形態(tài)也有所不同。小細(xì)胞未能觀察到突起,大細(xì)胞突起也較少,熒光標(biāo)記物質(zhì)在胞漿、胞核及突起中均有分布(Figs.2～11)。轉(zhuǎn)換3號濾色片觀察時,可見除大腦皮質(zhì)中GFAP陽性標(biāo)記細(xì)胞較少外,其余各腦區(qū)和核團(tuán)都有大量的GFAP陽性標(biāo)記細(xì)胞分布,胞體相對較小,并由胞體發(fā)出許多突起,胞體及突起均呈紅色熒光(Fig.12)。這些GFAP陽性標(biāo)記細(xì)胞均可確認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞。在同一視野分別用3號、4號濾色片觀察、照像,對比神經(jīng)纖維素陽性細(xì)胞和GFAP陽性細(xì)胞的位置,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)處于相同位置的雙標(biāo)記細(xì)胞(Figs.11～13)。神經(jīng)纖維素在細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)于NF1基因表達(dá)產(chǎn)物神經(jīng)纖維素在腦內(nèi)的分布,Gutmann通過Western及Northern印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維素在培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。Daston等通過免疫組化方法,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維素在人及大鼠脊髓的神經(jīng)細(xì)胞、Schwann細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞中有表達(dá),在星形膠質(zhì)細(xì)胞中則無表達(dá)。在成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)纖維素的分布狀況,則目前尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)用免疫熒光組化法證明了神經(jīng)纖維素在大鼠腦中的分布是非常廣泛的。除大腦皮質(zhì)中可見大量的陽性細(xì)胞外,在杏仁核、海馬結(jié)構(gòu)、丘腦前核群、丘腦內(nèi)側(cè)核群、丘腦板內(nèi)核群、丘腦中線核群及下丘腦室周核、下丘腦室旁核、下丘腦前區(qū)、下丘腦外側(cè)區(qū)、下丘腦后區(qū)、隔外側(cè)核、隔內(nèi)側(cè)核以及尾殼核、屏狀核、蒼白球、三叉神經(jīng)脊束核等部位也都觀察到數(shù)量不等的陽性細(xì)胞分布。以往報道神經(jīng)纖維素僅存在于胞質(zhì)內(nèi),但本研究觀察到除胞質(zhì)外,細(xì)胞核也含有豐富的神經(jīng)纖維素陽性反應(yīng)產(chǎn)物。神經(jīng)纖維素是否存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞?如上所述Gutmann用Western及Northern印跡法在培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中檢測出有神經(jīng)纖維素表達(dá),神經(jīng)纖維素存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。但Daston等用免疫組化法在人和大鼠脊髓的星形膠質(zhì)細(xì)胞卻未觀察到神經(jīng)纖維素陽性反應(yīng)產(chǎn)物。本研究重點(diǎn)觀察了大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞,用含抗神經(jīng)纖維素和抗星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志酶-GFAP的抗體混合液孵育切片,此結(jié)果僅見到GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞,而未見到雙標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞,此結(jié)果與Daston等的報道一致,而與Gutmann的結(jié)果不同。這種差異表明,在正常生理?xiàng)l件下,神經(jīng)纖維素可能主要在神經(jīng)元中表達(dá),而在星形膠質(zhì)細(xì)胞中無表達(dá)或很少表達(dá)。由于神經(jīng)纖維素在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的含量較少,因此用免疫組化方法檢測不到反應(yīng)信號,而可被Western和Northern印跡法檢出。此外,有資料表明,在培養(yǎng)細(xì)胞中,神經(jīng)纖維素的表達(dá)水平可能升高。關(guān)于神經(jīng)纖維素的功能,Gutmann根據(jù)在正常生理?xiàng)l件下,星形膠質(zhì)細(xì)胞中神經(jīng)纖維素的表達(dá)水平較低,而在病理?xiàng)l件下,星形細(xì)胞瘤的星形膠質(zhì)細(xì)胞中神經(jīng)纖維素的表達(dá)水平升高;在NF1+/-小鼠(NF1靶基因變異雜合體小鼠),由于NF1基因突變,星形膠質(zhì)細(xì)胞中神經(jīng)纖維素含量降低,表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加等現(xiàn)象,推測神經(jīng)纖維素可能是作為生長調(diào)節(jié)因子在星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。盡管神經(jīng)纖維素在神經(jīng)元中有大量的表達(dá),但是它在神經(jīng)細(xì)胞具有什么功能,作用機(jī)制如何,目前研究尚不多。有研究認(rèn)為神經(jīng)纖維素參與了信號通道的組成,并具