迷走神經(jīng)刺激后激活的丘腦室旁核和下丘腦室旁核中含谷氨酸能神經(jīng)元的研究

迷走神經(jīng)刺激后激活的丘腦室旁核和下丘腦室旁核中含谷氨酸能神經(jīng)元的研究

20世紀(jì)30年代，人們意識(shí)到意識(shí)到eeg被誘導(dǎo)是因?yàn)榇竽X激活（vns），這會(huì)導(dǎo)致大腦激活的變化。當(dāng)前,歐美國(guó)家已經(jīng)普遍應(yīng)用該技術(shù);全世界已有超過(guò)15000癲疒間患者接受了迷走神經(jīng)刺激療法。初步結(jié)果顯示,VNS可以降低癲疒間發(fā)作頻率,減輕癲疒間發(fā)作程度。但是此法的機(jī)理尚不明了。在前期實(shí)驗(yàn)中,筆者觀察到VNS后在丘腦室旁核(paraventricularnucleusofthalamus,PV)、下丘腦室旁核(paraventricularnucleusofhypothalamus,PVN)內(nèi)的Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于正常組,提示PV、PVN是VNS的作用核團(tuán),VNS激活了PV、PVN的神經(jīng)元。谷氨酸(Glutamate,Glu)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì),在丘腦大量存在。本研究利用Fos和Glu免疫組化雙標(biāo)法,觀察VNS后PV、PVN是否存在Fos和Glu的雙標(biāo)細(xì)胞,來(lái)驗(yàn)證VNS后激活的PV、PVN的神經(jīng)元是否含谷氨酸能神經(jīng)元。1材料和方法1.1免疫組化抗體健康成年SD大鼠6只,體重190～220g,南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試劑焦油紫(美國(guó)Sigma公司),兔抗Fos蛋白抗體(美國(guó)Sigma公司),小鼠抗谷氨酸抗體(美國(guó)Sigma公司),生物素化羊抗兔IgG(武漢博士德公司),生物素化羊抗小鼠IgG(武漢博士德公司),SABC(武漢博士德公司),藍(lán)色DAB-H2O2(武漢博士德公司),黃色DAB-H2O2(武漢博士德公司)。1.2方法1.2.1神經(jīng)電刺激試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物在安靜、溫暖的環(huán)境中飼養(yǎng)24h。VNS組經(jīng)乙醚吸入結(jié)合戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉,仰臥固定,頸部正中切口,暴露左側(cè)頸動(dòng)脈鞘,分離迷走神經(jīng)干;將自制電極置于神經(jīng)干兩端,電極外接DCQ-3型電刺激儀。刺激參數(shù):頻率50Hz、電壓4.5V、波寬1ms;刺激時(shí)間30s、間歇5min,重復(fù)10次。1.2.2fos免疫組化動(dòng)物經(jīng)處理后存活2h,繼之開(kāi)胸,經(jīng)左心室插管,100ml生理鹽水沖洗后,冷4%多聚甲醛灌注。取腦,視交叉向后1mm切取含PV、PVN部位組織,切成2mm厚,置4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)中后固定12h。常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片,片厚5μm,隔20取4,分別行Fos免疫組化染色、對(duì)照實(shí)驗(yàn)和Nissl染色定位;取Fos顯色理想部位行Glu免疫組化染色。1.2.3小鼠抗能譜顯色法檢測(cè)igg水平固原螯蝦體內(nèi)氨基酸切片常規(guī)脫蠟至水,入含0.3%TritonX-100和3%H2O2中10min,pH6.0檸檬酸緩沖液熱修復(fù)抗原,BSA室溫10min,依次入兔抗Fos蛋白抗體(1∶2000)1h(37℃),生物素化羊抗兔IgG10min,SABC20min,藍(lán)色DAB-H2O2顯色。鏡下控制顯色,蒸餾水終止反應(yīng)。0.02mol/L的PBS充分漂洗后,BSA室溫10min,入小鼠抗谷氨酸抗體(1∶2000)2h(37℃),生物素化羊抗小鼠IgG10min,SABC20min,黃色DAB-H2O2顯色。鏡下控制顯色,蒸餾水終止反應(yīng)。上述各步驟間均用0.02mol/L的PBS充分漂洗3次,每次2min。脫水,透明,中性樹(shù)膠封片,觀察。對(duì)照實(shí)驗(yàn):以兔、小鼠正常血清代替一抗孵育切片。1.2.4nissl染色切片常規(guī)脫蠟至水,1%焦油紫溶液,室溫30℃,95%酒精分化數(shù)秒,脫水,透明,中性樹(shù)膠封片,觀察。1.3glu/fos雙標(biāo)細(xì)胞計(jì)數(shù)置光學(xué)顯微鏡10×10倍觀察定位核團(tuán),在40×10倍鏡下,用Leica圖像分析系統(tǒng)分別計(jì)數(shù)Glu單標(biāo)細(xì)胞、Fos單標(biāo)細(xì)胞和Glu/Fos雙標(biāo)細(xì)胞(以0.02mm2為單位面積計(jì)數(shù))。計(jì)算方法同F(xiàn)os。1.4統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,P<0.05為結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1拾遺織物色散在pv、pvn光鏡下觀察,在雙標(biāo)染色切片上顯示三種陽(yáng)性細(xì)胞:Fos單標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞核呈褐色,多為圓形或卵圓形,散在分布于PV、PVN;Glu單標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞漿呈黃色,細(xì)胞核不著色,散在分布于PV、PVN;Fos和Glu雙標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞核呈深褐色,細(xì)胞漿呈黃色,零星分布于PV、PVN(表1,圖1、2,封三)。2.2nissl染色神經(jīng)元胞體為藍(lán)色,膠質(zhì)細(xì)胞為淡藍(lán)色,背景無(wú)色。2.3比較實(shí)驗(yàn)以正常兔、小鼠血清代替一抗孵育切片,為陰性。3vns激活glu能神經(jīng)元的作用目前公認(rèn)的VNS抗疒間機(jī)制假說(shuō)為“直接聯(lián)系理論”和“遞質(zhì)學(xué)說(shuō)”。“直接聯(lián)系理論”認(rèn)為經(jīng)由迷走神經(jīng)傳入的電刺激信號(hào)通過(guò)孤束核及其他相關(guān)結(jié)構(gòu),如丘腦、杏仁核、海馬、下丘腦、島葉皮質(zhì)等,這可能引起了同步與非同步的腦電活動(dòng),從而引起腦電圖的間隔變化,使癲疒間發(fā)作閾值升高。在前期實(shí)驗(yàn)中,筆者利用Fos陽(yáng)性細(xì)胞作為神經(jīng)元被激活的標(biāo)志,觀察到VNS激活了PV、PVN的神經(jīng)元?！斑f質(zhì)學(xué)說(shuō)”提出VNS通過(guò)改變遞質(zhì)水平發(fā)揮抗疒間作用。神經(jīng)遞質(zhì)的變化,包括增加抑制性遞質(zhì)和減少興奮性遞質(zhì)。既往的研究主要集中在γ-氨基丁酸、去甲腎上腺素和單胺類遞質(zhì)等抑制性遞質(zhì)。但對(duì)興奮性遞質(zhì),特別是Glu的報(bào)道較少。Glu作為腦內(nèi)的一種神經(jīng)遞質(zhì),在癲疒間發(fā)作中起著重要的作用,其作用主要通過(guò)兩類受體介導(dǎo):離子型受體和代謝型受體。Glu的解毒主要經(jīng)過(guò)神經(jīng)元的重?cái)z取和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的攝取。本實(shí)驗(yàn)參數(shù)的迷走神經(jīng)刺激產(chǎn)生腦電去同步,發(fā)揮了抑疒間作用;且PV、PVN既是VNS的活化區(qū)域,也是癲疒間的敏感區(qū)域;因此在PV、PVN,單純VNS引起的變化與癲疒間的起源和調(diào)節(jié)有關(guān)。通過(guò)Fos/Glu的雙標(biāo)實(shí)驗(yàn),筆者觀察到VNS后在PV、PVN處,可見(jiàn)Fos/Glu雙標(biāo)細(xì)胞,說(shuō)明Glu能神經(jīng)元被VNS激活,這些激活的Glu能神經(jīng)元在VNS抑癲疒間的機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。Fos/Glu雙標(biāo)細(xì)胞僅占Glu陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)的33%、33%,說(shuō)明并不是所有的Glu能神經(jīng)元都能被VNS激活;Fos/Glu雙標(biāo)細(xì)胞僅占被激活的細(xì)胞總數(shù)的29%、35%,說(shuō)明VNS還激活了其他細(xì)胞,它們可能共同對(duì)PV、PVN內(nèi)的Glu能神經(jīng)元進(jìn)行調(diào)控。結(jié)合上述的研究?jī)?nèi)容,筆者推測(cè)VNS抑癲疒間的機(jī)制。第一,VNS激活了Glu能神經(jīng)元,但同時(shí)也激活了其他的一些物質(zhì)如膠質(zhì)細(xì)胞。激活的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞間隙內(nèi)Glu的重?cái)z取,降低胞外Glu的濃度。第二,VNS可能降低部分離子型Glu受體的密度,減少突觸前Glu與突觸后膜的受體結(jié)合,使Ca2+的內(nèi)流減少,引起Glu的胞內(nèi)堆積,從而減少Glu向胞外的釋放。第三,VNS可能激活部分代謝型Glu受體,致cAMP介導(dǎo)的突觸前電壓依賴性鈣通道磷酸化的減少,從而減少Ca2+的內(nèi)流,抑制Glu的釋放,突觸后膜上的代謝型Glu受體激活后也可通過(guò)cAMP途徑減輕興奮性毒性損害。第四,被VNS激活的Glu能神經(jīng)元可能起著中間神經(jīng)元的作用,興奮抑制性突觸,升高抑制性遞質(zhì)和受體水平,對(duì)Glu的