超氧化物歧化酶的分離、純化

實驗 超氧化物歧化酶的分離、純化超氧化物岐化酶(Superoxidedismutase,簡稱SOD)廣泛存在于生物體內(nèi)的含Cu、Zn>Mn、Fe的金屬類酶。它作為生物體內(nèi)重要的自由基清除劑，可以清除體內(nèi)多余的超氧陰離子，在防御生物體氧化損傷方面起著重要作用。離子(0丁)是人體氧代謝產(chǎn)物，它在體內(nèi)過量積累會引起炎癥、腫瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧陰離子與生物體內(nèi)許多疾病的發(fā)生和形成有關(guān)。由于SOD能專一消除超氧陰離子(0旳而起到保護(hù)細(xì)胞的作用，SOD作為一種藥用酶，具有廣闊的應(yīng)用前景，并引起了國內(nèi)外醫(yī)藥界、生物界和食品界的極大關(guān)注。按金屬輔基成分的不同可分成3種類型。最常見的一種含有銅鋅金屬輔基(CuZn-SOD),主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在高等植物的葉綠體基質(zhì)、類囊體內(nèi)以及線粒體膜河隙也有存在，CuZn-SOD酶蛋白的分子量約為3.2X10」，純品呈藍(lán)綠色，每個酶分子由2個亞基通過非共價鍵的疏水基相互作用締合成二聚體。每個亞基(肽鏈)含有銅、鋅原子各一個，活性中心的核心是銅。第二種含有鎰離子(Mn-SOD),主要存在于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞中，在植物的葉綠體基質(zhì)和類囊體膜上也有存在，純品呈粉紅色，由4條或2條肽鏈組成。第三種是Fe-SOD,過去一直認(rèn)為只存在于原核細(xì)胞中，近來發(fā)現(xiàn)有一些真核浹類甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD純品呈黃色或黃褐色，由2條肽鏈組成，多數(shù)情況下每一個二聚體中含有一個Fe原子。實驗(一)超氧化物歧化酶的活性測定［原理］SOD的活力測定方法很多，常見的有化學(xué)法、免疫法和等電點聚焦法。其中化學(xué)法應(yīng)用最普遍，化學(xué)法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會產(chǎn)生有色中間物和0尹，利用SOD分解而間接推算酶活力。在化學(xué)方法中，最常用的有黃瞟吟氧化酶法，鄰苯三酚法，化學(xué)發(fā)光法，腎上腺素法，NBT-還原法，光化學(xué)擴增法，Cyte還原法等。其中改良的鄰苯三酚自氧化法簡單易行較為實用。化學(xué)發(fā)光法和光化學(xué)擴增法不適用于測定\In-SOD,但對于Cu/Zn-SOD反應(yīng)極靈敏。Cyte還原法用于Xlii-SOD活力測定結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。但專一性和靈敏度不夠理想，而且需要特殊儀器，實際應(yīng)用受到限制。亞硝酸鹽形成法與CN—抑制劑或SDS處理相結(jié)合，應(yīng)用于Mn-SOD測定，靈敏度比Cyte還原法提高數(shù)倍，而且專一性強，重復(fù)性好，操作方便，不需要特殊儀器和設(shè)備，易于實際應(yīng)用和推廣，是目前較好的測定方法之一。在一般情況下，SOD酶活性測定只能應(yīng)用間接活性測定法。本實驗采用鄰苯三酚自氧化方法。鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O廣，生成帶色的中間產(chǎn)物，反應(yīng)開始后反應(yīng)液先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因為生成的中間物不斷氧化的結(jié)果。這里測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留30?45s后，與時間成線性關(guān)系，一般線性時間維持在4mm的范闌內(nèi)，中間物在420mn波長出有強烈光吸收。當(dāng)有SOD存在時，由于它能催化6??與H+結(jié)合生成6和HQ?,從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，因此，通過計算即可求出SOD的酶活性。酶活力單位定義：在25°C恒溫條件下，每亳升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達(dá)50%的酶量定義為1個酶活力單位。［試劑和器材］1、試劑pH8.2、50mmoLTTns-HCl稱取Tns0.61g,EDTA-2Na0.037g,用雙蒸水溶解至80mL左右，用HC1調(diào)節(jié)pH=8.20（用pH計校正），最后定容至1OOmLo（2） lOminoLLHCl（3） 50nunol/L鄰苯三酚稱取鄰苯三酚0.063g,用lOnunol/LHCl溶液溶解，定容至lOniL,避光保存。（4） SOD樣液2、器材（1） 恒溫水浴槽（2） 紫外分光光度計（3） 試管、刻度吸管、微量注射器［方法和步驟］1、鄰苯三酚自氧化速率的測定取兩支試管按下表加入25°C預(yù)熱過的緩沖液,然后加入預(yù)熱過的鄰苯三酚（空白管用lOminoL'LHCl代替鄰苯三酚），迅速搖勻，立即傾入lcm比色杯中，在325nm波長處測定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.07（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。試劑空白管（mL）自氧化管（mL）pH8?2、50nunol/LTns-HCl2.982.98lOmmol/LHC10.020.0150nunoLL鄰苯三酚-0.012、SOD樣液的活性測定樣品管取代自氧化管。樣品管測定時先加入預(yù)熱的待測酶液，再加鄰苯三酚。其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測定。試劑空白管（mL）樣品管（mL）pH8?2、50nunol/LTns-HCl2.982.98lOmmol/LHC10.02-SOD樣液-0.0150mmol/L鄰苯三酚-0.01（3）計算0.070-樣液速率1Ano/酶活性54 Ax反應(yīng)液總體積x樣化豐數(shù)50% 樣液體積實驗（二）動物血中超氧化物歧化酶的提取［原理］1969年，McCord和Fndovich第一次從牛血中提純到超氧化物岐化酶。自然界中SOD分布極廣，其含量隨生物體的不同而不同，即使同一種生物的不同組織或同一組織的不同部位，其SOD的種類和含量也有很人差別。迄今為止人們已從細(xì)菌，真菌、原生動物。浹類、昆蟲、魚類、植物和動物等各種生物體內(nèi)分離得到SODc為拓寬提取SOD的原料，篩選或基因過程開發(fā)產(chǎn)SOD量較高的菌株。目前，研究開發(fā)最多的資源還是從動物血液、動物組織中制備提純SODo從動物血液材料中制備Cu-Zn-SOD純化工藝分為三個主要步驟：（1）原材料的預(yù)處理;（2）粗酶液的制備；（3）離子交換柱層析精制。國內(nèi)多采用Mccoid和Fndovich法，其主要工藝過程為：第一步，乙醇-氯仿除去血紅蛋白：第二步，有機溶劑和硫酸錢分級沉淀；第三步，離子交換柱層析精制。［試劑和器材］1、試劑（1） 3.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）檸檬酸三鈉（2） 0.9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鈉（3） 95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇（4） 氯仿（5） 丙酮（6） pH7.6、2.5nunol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液（7） DEAE-SephadexA-502、器材（1） 豬血（2） 恒溫水?。?） 離心機（4） 布氏漏斗、抽濾瓶（5） 燒杯、量筒、攪棒（6） 透析袋［方法和步驟］1、從豬血中提取SOD（1） 分離血球取新鮮豬血，加入到3.8%檸檬酸三鈉抗凝液中，新鮮豬血與抗凝液的比例為3：1,輕輕攪拌均勻，4OOOr/niui離心20mm，收集紅血球。（2） 除血紅蛋白紅血球用3倍體枳生理鹽水洗滌，4000i7nuii離心20mm,重復(fù)三次，然后向洗凈的紅血球加入1-1.1倍體積去離子水，攪拌溶血30iiihi,再向溶血液中分別緩慢加入0.25倍體積的預(yù)冷95%乙醇和0.15倍體積的預(yù)冷氯仿，劇烈攪拌15mm左右，靜置111,然后4000r/nun離心20nun除去變性血紅蛋白沉淀，取清液，過濾，收集濾液（記錄體積，測酶活性和蛋白濃度）。（3） 熱變性上清液加熱到65°C,保溫lOnun,然后迅速冷卻到室溫，3OOOr/niin離心20min,棄去沉淀物，收集上清液（記錄體積，測酶活性和蛋白濃度）。（4）沉淀清液在鹽冰浴中冷卻，然后在-5°C以卞的操作溫度下，加入1.5倍量預(yù)冷丙酮，邊加邊攪拌均勻，即有白色沉淀產(chǎn)生，靜置2?3mm,迅速抽濾，棄去濾液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸館I水溶解，4OOOr/nun離心20mm,除去不溶物，用pH7.6的2.5mmol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液透析，即得粗SOD溶液（記錄體積，測酶活性和蛋白濃度）。［結(jié)果與計算］1、 計算每步操作所得酶液的酶活性、蛋白濃度和比活力。2、 計算每步操作的酶活性回收率、蛋白回收率和純化倍數(shù)。實驗（三）離子交換層析純化超氧化物歧化酶［原理］本實驗利用超氧化物歧化酶的解離性質(zhì)，在一定緩沖液條件卞與離子交換纖維素吸附和解吸的能力不同于溶液中雜蛋白，進(jìn)而除去雜蛋白。實驗中選用DE-32離子交換纖維素。相關(guān)原理請參見實驗教材中離子交換層析一章。［試劑和器材］1、試劑（1） DE-32（2）緩沖液I:2.5nmiol/LK2HPO4-KH2PO4（pH7.6）（2） 緩沖液II：20011U11O1/LK2HPO4-KH2PO4（pH7.6）2、器材（1） 層析柱（2.5cmX25cm）（2） 部分收集器（3） 梯度洗脫儀（4） 紫外分光光度計（5） 試管、透析袋［方法和步驟］1、 DEAE-纖維素的預(yù)處理：（1） 稱取5gDE-32,撒在盛有75mL0.5mol/LHCl的燒杯中，室溫放置30mm,不時輕輕攪拌。（2） 將糊狀物移入3號砂芯漏斗中，用蒸飾水淋洗。如此重復(fù)，每加一次去離子水，浸泡一段時間，再進(jìn)行抽濾，至洗滌液pH等于4即可（pH試紙試）。（3） 將糊狀物移入燒杯中，加入75mL0.5mol/LNaOH,放置30mm,不時輕輕攪拌，棄去上清液，依同法用0.5mol/LNaOH再處理一次。（4） 將交換劑移入3號砂芯漏斗中，反復(fù)用去離子水淋洗，直至洗滌液pH為&0（可用pH試紙測試）。（5） 將DEAE-纖維素浸泡在150mL去離子水中。用0.5mol/L鹽酸把pH調(diào)至7.6,滴定可在pH計上進(jìn)行，須使懸液最終pH在lOnun內(nèi)無變化，然后抽濾。（6） 將上述濾塊置于100毫升量筒中，加入75111L緩沖液I,慢慢攪混之后，靜置2011U11,用傾斜法除去上清液中細(xì)微粒子，如此重復(fù)若干次，最后上清液pH與緩沖液I幾乎一致。2、 裝柱

（1）層析柱用洗滌液洗清潔，柱的下端聯(lián)接塑料管，裝上螺旋夾。關(guān)上螺旋夾，柱內(nèi)裝入緩沖液I,微開螺旋夾。讓緩沖液緩慢流出，趕走死區(qū)及塑料管中的氣泡，柱中保留少量緩沖液，關(guān)閉螺旋夾。（2）將基本平衡好的DEAE-纖維素漿液（約有1倍體積的緩沖液I）放在抽濾瓶中減壓除盡氣泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高約1cm高度時，部分旋松螺旋夾，讓溶液緩慢流出去，注意此時的流速要比正常洗脫時的流速慢，陸續(xù)加入較多的漿液，直至達(dá)到高10cm以上的柱床體積。3、 平衡當(dāng)全部交換劑裝入柱中后，用上柱起始緩沖液進(jìn)行平衡。流速可維持在4niL/15nun,直至流出液的pH與上柱緩沖液完全相同。（一般要平衡8h以上或過夜。）4、 層析用毛細(xì)吸管小心吸去交換劑上面大部分液體，打開出II使緩沖液I恰流到表面，關(guān)閉出II。用毛細(xì)吸管小心地沿柱壁四周緩緩加入SOD粗酶液，打開出II,使樣品溶液進(jìn)入纖維素內(nèi)，至幾乎露出床面時，柱壁用少量緩沖液小心洗滌2?3次，然后裝入緩沖液】，使液面高出創(chuàng)面2?3cm左右。5、洗脫（1）按圖將梯度洗脫器和層析柱連接好。（2）在洗脫瓶A（貯存器）和洗脫瓶E（混合器）內(nèi)各裝入100mL緩沖液I和緩沖液II,注意兩洗脫瓶，特別是液面應(yīng)處于同一水平面，同時應(yīng)排除連接管內(nèi)氣泡。（3） 開動電磁攪拌器開關(guān)，調(diào)節(jié)攪拌速度，以混合器內(nèi)緩沖液旋轉(zhuǎn)而無明顯旋渦為宜。（4） 將兩瓶和柱上卞連接管道打開，開始收集洗脫流出液，控制流速在1.5111L/iiuiio收集液測定蛋白質(zhì)濃度和酶活性。（5） 收集合并具有SOD活性部分的洗脫液，透析濃縮后冷凍干燥即得純化SOD（淡藍(lán)綠色產(chǎn)品）。［結(jié)果與計算］1、 畫出層析圖譜并標(biāo)出酶活曲線和線性梯度曲線。2、 計算蛋白回收率、酶活回收率、純化倍數(shù)。3、 求出酶活最高峰時洗脫液鹽的濃度。實驗（四）金屬螯合層析分離純化超氧化物歧化酶［原理］金屬螯合層析是利用固定相偶聯(lián)的配基一一亞氨基二乙酸（IDA）及金屬離子發(fā)生螯合作用，該金屬離子又與蛋白分子中的某些含有筑基或咪啖基的氨基酸結(jié)合。金屬螯合層析主要分為3個階段:第一階段是螯合介質(zhì)與二價金屬離子作用生成金屬螯合介質(zhì)；第二階段是在一定的條件卞金屬螯合介質(zhì)與被分離蛋白質(zhì)分子形成金屬螯合復(fù)合物；第三階段是從金屬螯合介質(zhì)上將被分離物質(zhì)解吸下來。本實驗采用亞氨基二乙酸（EDA）以二納鹽形式與環(huán)氧化的瓊脂糖-6E結(jié)合，再在偏堿性的條件下與二價金屬銅離子發(fā)生可逆性螯合，二價金屬銅離子又與含有咪呼基的超氧化物歧化酶發(fā)生可逆性的螯合吸附。金屬離子在螯合介質(zhì)與被分離分子之間起著橋梁作用，金屬離子的一端與螯合介質(zhì)連接，另一端與被分離組分結(jié)合。這兩種結(jié)合方式都是可逆的，在一定條件下洗脫被分離組分。［試劑和器材］1、 試劑（1） 瓊脂糖（2） 亞氨基二乙酸（EDA）（3） 環(huán)氧氯丙烷（4） 三疑甲基氨基甲烷（Tns）（5） 氫氧化鈉（6） 氯化鈉（7） 硼氫化鈉（8） pHlO.O、2moLLNa2CO3-NaHCO3緩沖液（9） pH7.2、20mmol/L磷酸緩沖液2、 器材（1） 層析柱（2） 紫外分光光度計（3） 部分收集器（4） 沸水?。?） 金屬網(wǎng)篩［方法和步驟］1、 IDA-瓊脂糖6E的制備稱取瓊脂糖2g,